Способ экспресс-диагностики дисбактериоза полости рта

Изобретение относится к области медицины, в частности микробиологии и гастроэнтерологии. Способ экспресс-диагностики дисбактериоза полости рта заключается в том, что по отношению интегральных оценок спектров поглощения газовыделений мазка с миндалин и выдыхаемого воздуха в диапазоне длин волн 933-954 см^-1 судят о наличии дисбактериоза в ротовой полости, а именно при значении соотношения интегральных оценок поглощения газовыделений мазка с миндалин и выдыхаемого воздуха, в интервале 1,0±0,015 диагностируют норму, при отклонении от этих значений диагностируют дисбактериоз. Использование заявленного способа позволяет упростить и сократить время диагностики дисбактериоза полости рта. 4 табл., 1 ил.

 

Изобретение относится к области медицины, в частности микробиологии и гастроэнтерологии, и может найти применение в медицинской практике для экспресс-диагностики дисбактериоза полости рта.

В настоящее время основным методом оценки состояния микрофлоры различных биотопов является бактериологический анализ и заключается в заборе пробы биологического материала - слюны со слизистых рта, посеве на питательную среду и последующем учете микроорганизмов, который проводится согласно методическим рекомендациям МЗ СССР (Приказ №535, 1985). Данный метод является достоверным и адекватным, однако, отличается достаточно сложной, громоздкой технологией исследования и требует длительного времени для получения результата (5-6 сут).

Известен способ оценки дисбактериоза полости рта, основанный на определении отношения уреазы и лизоцима. Если это отношение превышает единицу, это свидетельствует о наличии дисбактериоза, степень которого коррелирует с величиной отношения [1]. Однако известный метод можно назвать малодоступным, т.к. требует наличия эталонного кристаллического белка - лизоцима и косвенным, потому что позволяет оценить, в большей мере, состояние местного иммунитета, а не микрофлоры.

Известен способ экспресс-диагностики дисбактериоза полости рта, выбранный в качестве прототипа, путем получения мазка-отпечатка со слизистой оболочки полости рта, окрашенного по методу Грамма. При этом подсчитывают количество грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, а степень дисбактериоза устанавливают по их соотношению [2]. Этот метод можно считать слишком упрощенным и вызывающим сомнения в достоверности его результатов.

Новая техническая задача - упрощение способа и сокращение времени.

Для решения поставленной задачи в способе экспресс-диагностики дисбактериоза полости рта, включающем забор пробы биологического материала из полости рта с последующим подсчетом в ней микроорганизмов, одновременно дополнительно осуществляют забор выдыхаемого воздуха, причем о наличии дисбактириоза ротовой полости судят по отношению интегральных оценок S поглощения газовыделений мазка с миндалин и выдыхаемого воздуха в диапазоне длин волн 933-954 см^-1 при этом интегральную оценку состояния S, характеризуемую набором спектров , рассчитывают по формуле

где - мера близости спектра к заранее выбранному референтному массиву спектров S₀;

- мера компактности области, занимаемой в пространстве признаков объектами, относящимися к состоянию S₀. Здесь - расстояние Махаланобиса

С - матрица ковариации признаков, характеризующих референтное состояние S₀.

И при значении соотношения интегральных оценок поглощения газовыделений мазка с миндалин и выдыхаемого воздуха S/S₀ 1.0±0.015 диагностируют норму, а при отклонении от этих значений диагностируют дисбактериоз.

В основу предлагаемого способа экспресс-диагностики дисбактериоза полости рта положена специфичность газовыделений различных микроорганизмов. Будучи живыми существами, микроорганизмы обладают обменом веществ (метаболизмом). Для получения энергии многие из них пользуются брожением. В результате бродильных процессов выделяются различные продукты, в том числе и газы. Например, стафилококк выделяет NH₃, N₂, NO₂, H₂S, кишечная палочка - СО₂ (при наличии в среде глюкозы), индол, NO₂, синегнойная палочка - NO₂, N₂ [3, 4].

Изменение состояния биосистемы, как правило, сопровождается разнонаправленной динамикой различных показателей, причем ряд из них может незначительно меняться по сравнению с нормой. С учетом этого для оценки изменения спектра поглощения газовыделений бактерий использовался интеллектуальный анализ данных, основанный на интегральной оценке состояния.

С формальной точки зрения выделение некоторого состояния биосистемы S заключается в задании набора измеряемых показателей (х₁, х₂,…, x_n) и указания диапазона их значений, соответствующих этому состоянию. Таким образом, каждый объект может рассматриваться как вектор в n-мерном пространстве признаков. При этом оценка состояния объекта может быть охарактеризована количественно его мерой близости в пространстве признаков к референтному состоянию. В биомедицинских задачах, как правило, мера близости объектов выражается через расстояние Махаланобиса

здесь С - матрица ковариации признаков, характеризующих состояние S.

При выборе меры близости требуется учитывать конфигурацию области, занимаемой референтным состоянием, расположение оцениваемого объекта относительно нее в пространстве признаков, а также взаимное расположение объектов, представляющих референтное состояние системы. С учетом этих условий интегральный критерий оценки близости состояния объекта к состоянию S₀ можно задать следующим образом:

где - мера близости объекта к множеству S₀; - мера компактности области, занимаемой в пространстве признаков объектами, относящимися к состоянию S₀ [5]. Расчет производили с использованием программы для ЭВМ «StatSys» (свидетельство о регистрации №2006614010, 22.11.2006) [12].

Предлагаемые критерии для диагностики дисбактериоза подобраны на основании анализа клинических наблюдений. Микробиологические исследования проводились на базе кафедры микробиологии и вирусологии Сибирского государственного медицинского университета и отделения химиотерапии ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН.

Материалом для исследования явились мазки со слизистой оболочки полости рта. Использовались бактериологический анализ и микроскопический метод. Материал из ротовой полости брали натощак стерильным ватным тампоном. Посев производили стеклянным стерильным шпателем равномерно по поверхности питательной среды в чашке Петри. Учет колоний проводили спустя 24 ч инкубации при 37°С, для грибов - через 5 сут при комнатной температуре. Дифференцировку микроорганизмов проводили до родов по морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам. При изучении биологических свойств кокковой флоры определяли гемолитическую активность, плазмокоагулазу, лецитиназу. Оценку плазмокогулазы проводили с плазмой кролика по общепринятой методике, лецитиназу изучали на желточно-солевом агаре, гемолитическую активность исследовали путем посева односуточной культуры на агар с 5% дефибринированной кровью. Идентифицировали микроорганизмы согласно методическим рекомендациям МЗ СССР (Приказ №535, 1985).

Обследовали 90 женщин в возрасте 47-60 лет. В группу больных включены 60 женщин с морфологически подтвержденным диагнозом: рак молочной железы (РМЖ) III и IV стадии и получивших специальную противоопухолевую терапию. Группу сравнения составили 30 женщин с терапевтической патологией.

Результаты исследования показали [6-9], что микрофлора ротовой полости больных РМЖ значительно отличалась по качественному составу от микрофлоры пациентов группы сравнения (таблица 1). Так, из ротовой полости женщин, не имеющих онкологической патологии, высевались стафилококки (21%), стрептококки (52%), энтеробактерии (17%), нейссерии (2%), грибы рода Кандида (6%). У больных РМЖ большинство микроорганизмов составляли стафилококки (55%), увеличена высеваемость грибка Кандида (12%).

Выделенные из ротовой полости стафилококки и стрептококки мы подвергали оценке их биологических свойств с целью определения степени патогенности (вирулентности). Для этого было проведено исследование ферментов патогенности у данных бактерий: лецитиназы, плазмокоагулазы и гемолитических свойств. Результаты показали, что в группе сравнения выделенные из ротовой полости кокки гемолитической и лецитиназной активностью не обладали. Свертывание плазмы кролика они осуществляли более чем за 6 ч. У больных РМЖ обнаруживали кокки, обладающие достаточно высокой степенью патогенности: зона гемолиза на кровяном агаре у стафилококков была 15,42±0,21 мм, у стрептококков - 16,33±0,13 мм, лецитиназная активность (фосфолипаза) у стафилококков -7,44±0,52 мм, у стрептококков - 4,44±0,28 мм, стафилококки свертывали плазму в течение 2,51±0,18 ч, стрептококки - 2,34±0,17 ч (таблица 2). Таблица 2 - Биологические свойства кокковой флоры, выделенной из ротовой полости больных РМЖ (Х±m). Примечание к табл.2: р - уровень достоверности результатов между группой сравнения и больными раком молочной железы

Таким образом, у больных РМЖ после химиотерапевтического лечения отмечен дисбаланс ротовой микрофлоры: увеличивается высеваемость стафилококка и кандида, кокковая флора обладает высоким содержанием ферментов патогенности (лецитиназы, плазмокоагулазы, гемолитических свойств).

Проведены исследования качественного состава микрофлоры ротовой полости у больных раком легкого до начала лечения и в условиях противоопухолевой химиотерапии. Всего обследовано 15 мужчин и 5 женщин в возрасте 46-65 лет. В группы больных включены 20 мужчин и 3 женщины с морфологически подтвержденным диагнозом рак легкого (РЛ) 2-4 стадии, находившиеся на обследовании и лечении в отделении химиотерапии [6, 10]. Группу сравнения составили 18 здоровых мужчин и 2 здоровые женщины.

При исследовании было установлено, что микрофлора ротовой полости группы сравнения значительно отличалась по качественному составу от микрофлоры ротовой полости больных РЛ еще до проведения химиотерапии. Микрофлора ротовой полости группы сравнения была представлена, в основном, кокковой флорой: Staphylococcus, Streptococcus. Кроме того, обнаруживались Enterobacteria, грибы рода Candida. Наиболее часто высевались представители рода Streptococcus, в процентном соотношении их количество составляло 57% (таблица 3) от всех высеваемых в этом биотопе микроорганизмов. Представители рода Staphylococcus занимали 22%, на долю Enterobacteria приходилось до 15%, около 4% занимали грибы рода Candida и 2% Neisseria.

При этом было отмечено, что высеваемые стафилококки не имели признаков патогенности. У высеваемых стрептококков отсутствовала гемолитическая активность.

В группе больных РЛ до начала химиотерапии микрофлора ротовой полости также была представлена кокковой флорой: Staphylococcus, Streptococcus, высевались Enterobacteria, грибы рода Candida. На долю Staphylococcus, Streptococcus приходилось по 35%, Enterobacteria составляло 20%, остальные 10% представлены грибами рода Candida. Высеваемые Staphylococcus не имели признаков патогенности и Streptococcus с умеренной гемолитической активностью.

В таблице 3 приведены данные по высеваемости микроорганизмов ротовой полости здоровых людей и больных раком легкого в условиях противоопухолевой химиотерапии (%).

Примечание: процентное содержание микроорганизмов рассчитано на группу обследуемых.

После первого курса химиотерапии в группе больных РЛ на долю Staphylococcus приходится 40%, на долю Streptococcus 29%, Enterobacteria 19% и грибы рода Candida -12%.

После второго курса химиотерапии доминирующее положение в микробиоценозе ротовой полости занимают Staphylococcus без признаков патогенности. Количество их в процентном соотношении достигало 54%, реже высевались Streptococcus с умеренной гемолитической активностью - 8%, Enterobacteria - 14%. Высеваемость грибов рода Candida увеличилась до 24%.

Таким образом, в составе микрофлоры ротовой полости больных РЛ чаще обнаруживаются представители рода Staphylococcus и Streptococcus. После проведения каждого курса противоопухолевой химиотерапии увеличивается количество Staphylococcus, грибы рода Candida и снижается количество Streptococcus.

В результате проведенных исследований нами обнаружен дисбаланс нормальной микрофлоры в полости рта у больных раком молочной железы и раком легкого, выявляемый до и после проведенной химиотерапии. При этом отмечается замещение представителей нормальной, индигенной микрофлоры дрожжеподобными грибами рода Candida и кокковой группы, несущей признаки патогенности и вирулентности, что указывает на дисбактериоз.

Результаты спектроскопических исследований

Критерии включения пациентов в исследование.

1. Пациенты, имеющие верифицированый диагноз рака молочной железы, выявленный впервые, не получавшие ранее лечение цитостатиками.

2. Пациенты, имеющие верифицированный диагноз немелкоклеточного, либо мелкоклеточного рака легкого, не получавшие ранее цитостатического лечения.

Критерии исключения пациентов из исследования.

1. Пациенты, получающие в течение 12 месяцев до включения в исследование массивную антибактериальную терапию.

Алгоритм обследования и лечения больного.

Проведение исследования проводилось до и после курса химиотерапии в условиях отделения химиотерапии ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН. Исследуемым материалом являлся зубной налет, мазки со слизистой поверхности щек и миндалин, пробы выдыхаемого воздуха.

Этапы обследования.

Исследование включало мазок со слизистой щек, миндалин, забор зубного налета и выдыхаемого воздуха, непосредственно перед началом курса химиотерапии и на 7-10 сутки после его окончания. Для лечения рака молочной железы пациенты получают стандартные схемы химиотерапии FAC или AT.

Схема FAC включает в себя: доксорубицин 50 мг/м² в 1-й день, циклофосфан 500 мг/м² в 1-й день, 5 фторурацил 500 мг/м² в 1-й день. Интервал 3 недели.

Схема AT включает в себя: доксорубицин 50 мг/м² в 1-й день, доцетаксел 75 мг/м² во 2-й день либо паклитаксел 175 мг/м² на фоне стандартной премедикации дексаметазоном. Интервал 3 недели.

Для лечения мелкоклеточного рака легкого пациенты получают курсы химиотерапии по схеме ЕР: цисплатин 80 мг/м² в 1-й день, этопозид по 120 мг/м² в 1, 2, 3-й день. Интервал между курсами 21 день.

При немелкоклеточном раке легкого применяется схема лечении ЕР: цисплатин 80 мг/м² в 1-й день, этопозид по 120 мг/м² в 1, 3, 5-й день. Интервал между курсами 21 день.

Исследование состояния микрофлоры пациентов проводилось в следующем режиме: производился забор налета зубов, мазков с миндалин и щек, а также выдыхаемого воздуха. Забор производился до введения химиопрепарата и после завершения курса терапии. Производилось порядка 20 измерений каждой пробы. Соответственно суммарно на каждого пациента проводилось 80 измерений до курса химиотерапии и 80 измерений - после.

В качестве референтного состояния использовались данные по спектру поглощения выдыхаемого воздуха здоровых людей. Референтное состояние сформировано по результатам измерения спектра поглощения выдыхаемого воздуха у 31 человека, возраста 18-20 лет, некурящих, без хронических заболеваний.

В таблице 4 представлены величины результатов интегральной оценки этих данных состояния микрофлоры в различных диапазонах спектра поглощения

На чертеже представлены результаты интегральной оценки спектра поглощения микрофлоры у онкобольных до и после курса химиотерапии при различных способах забора пробы. Количественная оценка специфичности спектра поглощения газовыделений исследуемого объекта определялась по отношению к спектру, характеризующему эталонное состояние. Весь спектр генерации СО₂ лазера разбивался на два поддиапазона (933-954 с^-1 и 967-982 см^-1), состояние характеризовалось двумя признаками: интегральной оценкой суммарного поглощения в каждом из этих диапазонов. Таким образом, виртуальное пространство признаков представляло собой плоскость. Результаты представлены на чертеже - интегральная оценка спектра поглощения у онкобольных до и после химиотерапии при различных способах забора пробы. В качестве референтного использовался спектр поглощения выдыхаемого воздуха здоровых людей.

Из представленных данных видно, что после химиотерапии наиболее сильно меняются газовыделения мазка с миндалин и со щек, наименьшие изменения наблюдаются для зубного налета. Это говорит о существенном дисбалансе микрофлоры преимущественно на слизистой оболочке в ротовой полости, что также согласуется с данными микробиологического анализа.

Кроме этого видно, что отношение интегральных оценок газовыделений мазка с миндалин и выдыхаемого воздуха наиболее сильно меняется до и после химиотерапии для диапазона 933-954 см^-1. В соответствии с результатами микробиологического анализа этот показатель коррелирует с наличием дисбактериоза.

Пример 1

Пациентка Р., 63 г. Рак левой молочной железы. ВОИФ. МТС в левые аксиллярные, пекторальные, подключичные л/у, печень? T4N1Mx. Состояние после х/терапии. Проведено исследование: бактериологический анализ (посев на кровяной агар) пациентов с онкологическими заболеваниями до и после лечения. Получены результаты КОЕ до лечения 30, КОЕ после лечения 470, величина изменения КСЕ составила 440. Дополнительно проведено исследование согласно предлагаемому способу - измерение интенсивности спектра поглощения выдыхаемого воздуха и мазка с миндалин в диапазоне 932-954 см^-1 с использованием оптико-акустического газоанализатора ILPA-1 [11]. С использованием компьютерной программы [12] рассчитывалась интегральная оценка изменений спектра поглощения выдыхаемого воздуха и мазка с миндалин пациентов по отношению к спектрам поглощения выдыхаемого воздуха здоровых людей (референтная группа). Затем вычислялось К - отношение интегральных оценок мазка с миндалин к выдыхаемого воздуху для каждого пациента до и после проведения химиотерапии. Получены результаты: до лечения 0,872, после лечения 1,169.

Пример 2.

Пациентка Б.,32 года. Рак правой молочной железы, ВОИФ, мультицентричный рост. Состояние после секторальной резекции ПМЖ в 2005 г. Продолженный рост, МТС аксиллярные л/у справа. Ст IIIA T2 N2 М0. Прогрессирование (02.09 г.), МТС в над-, подключичные л/у справа. Состояние после 3 курсов химиотерапии.

Проведено исследование: бактериологический анализ (посев на кровяной агар) пациентов с онкологическими заболеваниями до и после лечения. Получены результаты КОЕ до лечения - рост колоний отсутствовал 30, КОЕ после лечения 340, величина изменения КОЕ составила 340. Дополнительно проведено исследование согласно предлагаемому способу - измерение интенсивности спектра поглощения выдыхаемого воздуха и мазка с миндалин в диапазоне 932-954 см^-1 с использованием оптико-акустического газоанализатора ILPA-1 [11]. С использованием компьютерной программы [12] рассчитывалась интегральная оценка изменений спектра поглощения выдыхаемого воздуха и мазка с миндалин пациентов по отношению к спектрам поглощения выдыхаемого воздуха здоровых людей (референтная группа). Затем вычислялось К - отношение интегральных оценок мазка с миндалин к выдыхаемого воздуху для каждого пациента до и после проведения химиотерапии. Получены результаты: до лечения 0,968 и после лечения 1,059.

На основании приведенных клинических примеров можно сделать вывод о том, что величина показателя К коррелирует с данными микробиологического анализа.

Предлагаемый способ может успешно применяться для диагностики дисбактериоза с целью назначения своевременной коррекции микрофлоры у пациентов после проведения лечения.

Источники информации

1. Способ оценки дисбактериоза полости рта / U200601643 от 17.02.2.006, авт.Левицкий А.П., Макаренко О.А., Селиванская И.А., Деньга О.В., Почтарь В.Н., Гончарук С.В.

2. Способ эспресс-диагностики дисбактериоза полости рта/ U70709 А от 15.10.2004, авт. Василишин У.Р., Рожко Н.М., Никифорчин Р.Н., Куцик Р.В.

3. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. - М.: Мир, 1982. - 310 с.

4. Метаболизм микробов. Изд-во Московского ун-та, 1986.

5. Фокин В.А. Технология интегральной оценки состояния биомедицинских систем // Системы управления и информационные технологии. - 2008, №11(31). - С.191-194.

6. Карпинская Н.П. Колонизационная резистентность слизистой оболочки полости рта у больных раком легкого в условиях противоопухолевой химиотерапии. Дисс. на соиск. уч. степ. к.м.н. - Томск, 2006. - 112 с.

7. Хайруллин Р.Г. Механизмы противоинфекционной защиты кожи и слизистых оболочек у больных раком молочной железы в условиях кислородо- и озонотерапии. Дисс. на соиск. уч. степ. к.м.н. - Томск, 2007. - 124 с.

8. Хайруллин Р.Г., Гольдберг В.Е., Красноженов Е.П., Чубик М.В. Влияние кислородо- и озонотерапии на состояние противоинфекционной защиты кожи у больных раком молочной железы // Сибирский онкологический журнал. - 2007. - №1. - С.23-26.

9. Хайруллин Р.Г., Красноженов Е.П., Чубик М.В. Колонизационная резистентность слизистой полости рта у больных раком молочной железы в условиях гипербарической оксигенации // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы изучения эпидемического благополучия населения Российской Федерации». - Москва, 2007. - Т.2. - С.313.

10. Чубик М.В., Гольдберг В.Е., Красноженов Е.П., Карпинская Н.П. Некоторые показатели микроэкологии слизистой оболочки полости рта у больных раком легкого в условиях противоопухолевой терапии // Сибирский онкологический журнал. 2008. - Том 27. - №3. - С.38-42.

11. Внутрирезонаторный лазерный оптико-акустический сенсор ILPA-1. Паспорт. Техническое описание. Руководство по эксплуатации. ЗАО "ЭльСиЭс Фасилити Менеджмент". Новосибирск, 2005. - 25 С.

12. Фокин В.А., Хакимов И.С., Никифорова О.Ю. Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ №2006614010 РФ. Программа для ЭВМ "StatSys" / Заявка №2006613281; Заявлено 29.09.2006; Зарегистрировано 22.11.2006.

Таблица 1
Группы обследу- емых	Стафилококк	Стрептококк	Энтеробактерии	Нейссерии	Грибы рода Кандида
Группа сравнения (n=30)	21	52	17	2	6
Больные РМЖ (n=60)	55	10	15	0	12

Таблица 2
Группы обследу- емых	Гемолиз, мм	Лецитиназа, мм	Плазмокоагулаза, ч
Стафилококки	Стрепткокки	Стафилококки	Стрептококки	Стафилококки	Стрептококки
Группа сравнения (n=30)	0	0	0	0	7,40±0,54	7,15±0,62
Больные РМЖ (n=60)	15,42±0,21	16,34±0,13	7,44±0,59	4,44±0,28	2,51±0,18 p<0,05	2,34±0,17 р<0,05

Таблица 3
Группы обследу- емых	Staphylococcus	Streptococcus	Enterobacteria	Neisseria	Грибы рода Candida
Группа сравнения (n=20)	22	57	15		4
Больные раком легкого до начала лечения (n=20)	35	35	20		1
Больные раком легкого после I курса химиотера- пии (n=20)	40	29	19		12
Больные раком легкого после II курса химиотера- пии (n=17)	54	8	14		24

Таблица 4
Группы	Способ забора пробы	ИК (933-954 мкм)	ИК (966-982 мкм)
Онкобольные До химиотерапии	Выдыхаемый воздух	2,21±0,14	2,93±0,18
	Мазок с зубов	2,31±0,14	2,97±0,18
	Мазок с миндалин	2,22±0,13	2,91±0,18
Мазок со щек	2,28±0,16	3,05±0,21
Онкобольные После химиотерапии	Выдыхаемый воздух	2,24±0,13	3,10±0,20
	Мазок с зубов	2,28±0,13	3,16±0,21
	Мазок с миндалин	2,30±0,15	3,12±0,19
Мазок со щек	2,25±0,16	3,31±0,22

Способ экспресс-диагностики дисбактериоза полости рта, включающий забор пробы биологического материала из полости рта, отличающийся тем, что одновременно дополнительно осуществляют забор выдыхаемого воздуха, причем о наличии дисбактериоза ротовой полости судят по отношению интегральных оценок спектров поглощения газовыделений мазка с миндалин и выдыхаемого воздуха в диапазоне длин волн 933-954 см^-1, при этом интегральную оценку рассчитывают по формуле

где - мера близости спектра поглощения к заранее выбранному эталонному состоянию S₀, заданному набору спектров поглощения выдыхаемого воздуха здоровых людей , - объем выборки:


С - матрица ковариации коэффициентов поглощения спектров выдыхаемого воздуха здоровых людей, характеризующих эталонное состояние S₀,

и при значении соотношения интегральных оценок поглощения газовыделений мазка с миндалин и выдыхаемого воздуха в интервале 1,0±0,015 диагностируют норму, при отклонении от этих значений диагностируют дисбактериоз.