Штамм "ставрополь 01/08" вируса африканской чумы свиней для вирусологических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований

Авторы патента:

Колбасов Денис Владимирович (RU)

Балышев Владимир Михайлович (RU)

Куриннов Виктор Васильевич (RU)

Цыбанов Содном Жемьянович (RU)

Васильев Александр Павлович (RU)

Калантаенко Юрий Федорович (RU)

Жуков Анатолий Николаевич (RU)

G01N33/53 - иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого (препараты для терапевтических целей, содержащие антигены или антитела,A61K; гептены вообще, см. соответствующие рубрики в классе C07; пептиды, например протеины, вообще C07K)

C12N7 - Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их (лекарственные препараты, содержащие вирусы A61K 35/76; получение лекарственных составов, содержащих вирусные антигены или антитела, например вакцин из вирусов A61K 39/00)

Владельцы патента RU 2439152:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (RU)

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии. Штамм выделен от свиньи, павшей в ТОО «Горькая Балка» Советского района Ставропольского края во время эпизоотии болезни в 2008 г. Штамм является новым, ранее неизвестным, выделенным на территории РФ и обозначен как штамм «Ставрополь 01/08». Обладает высокой инфекционной активностью, накапливается в культурах клеток костного мозга свиней и лейкоцитах свиней в титре 6,0-7,0 lg ГАЕ_50/см3. Титр вируса на свиньях составляет 7,0-7,5 lg ЛД_50см3. Гибель зараженных свиней наступает с признаками, характерными для острой формы АЧС через 3-6 суток после проявления клинических признаков болезни. Изобретение может быть использовано в научно-исследовательских институтах и диагностических центрах в качестве референс-штамма при проведении вирусологических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований. 3 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к штаммам вируса африканской чумы свиней (АЧС), и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и диагностических центрах в качестве референс-штамма при проведении вирусологических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований.

В странах Африканского, Американского и Европейского континентов выделено более 400 штаммов и изолятов вируса АЧС, обладающих различными биологическими свойствами. Рядом авторов проводились исследования по классификации имеющихся изолятов вируса АЧС. С этой целью они использовали перекрестное заражение свиней, реакцию задержки гемадсорбции (РЗГАд) в культуре клеток костного мозга свиней (КМС) или лейкоцитов свиней (ЛС), рестрикционный анализ ДНК, генотипирование вируса и др. [1, 3, 4, 5].

Согласно разработанной в ГНУ ВНИИВВиМ классификации, в основу которой положены результаты РЗГАд типоспецифическими сыворотками и иммунобиологической пробы на свиньях, имеющиеся в коллекции института изоляты вируса АЧС разделены на 8 серотипов [2]. Наиболее изученными являются штаммы вируса, отнесенные к I-IV серотипам; Референс-штаммом I-го серотипа определен штамм «Лиссабон 57», II-го - «Конго 49», III-го - «Мозамбик 78», IV-го «Франция 32» [1].

Целью данного изобретения является получение нового вирулентного штамма вируса африканской чумы свиней, обладающего стабильными культуральными и вирулентными свойствами для свиней различных возрастных групп для использования в качестве референс-штамма при проведении вирусологических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований.

Поставленная цель достигается путем выделения вируса АЧС от свиньи, павшей в ТОО «Горькая Балка» Советского района Ставропольского края во время эпизоотии болезни в 2008 г., который является новым, ранее неизвестным штаммом этого возбудителя, выделенным на территории РФ. Полученный вирулентный штамм обозначен как штамм «Ставрополь 01/08» и депонирован в Коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН под №278.

Новый вирулентный штамм обладает следующими свойствами.

Морфологические и молекулярно-генетичесие свойства. При электронно-микроскопическом исследовании в вируссодержащем материале обнаруживают округлые частицы диаметром 175-215 нм, состоящие из плотного нуклеотида, 2-слойного икосаэдрического капсида и наружной оболочки. Плавучая плотность вириона в CsCl составляет 1.19-1.24 г/см³, коэффициент седиментации 1800-8000 S. Нуклеотид содержит ДНК, белок и окружен электронно-прозрачным слоем. Геном вируса представлен неинфекционной, двуспиральной, линейной молекулой ДНК, состоящей из 170-190 тыс. пар нуклеотидов. На основании результатов секвенирования фрагментов гена, кодирующего структурный белок Р 72, штамм отнесен к 2-му генотипу вируса АЧС.

Антигенные свойства. Антигенные свойства штамма типичны для вируса АЧС. В вирионах идентифицированы 54 полипептида. Вирусспецифические антигены выявляются в реакциях преципитации, связывании комплемента, иммуноферментном анализе, иммунофлуоресценции, задержки гемадсорбции и др.

Типовая принадлежность. По результатам РЗГАд с использованием полученных в ГНУ ВНИИВВиМ референс-сывороток штамм «Ставрополь 01/08» отнесен к вирусу АЧС VIII-го серотипа.

Культуральные свойства. Штамм размножается в первичных культурах клеток КМС и ЛС. Репродукция вируса сопровождается адсорбцией эритроцитов свиней на инфицированных клетках (феномен гемадсорбции) на 3-5 сутки культивирования и их лизисом через 120-144 часов. Накопление вируса в эти сроки составляет 6,0-7,0 lg ГАЕ_50/cм3. В течение 20 серийных пассажей (срок наблюдения) штамм сохраняет эти свойства. Штамм не размножается в перевиваемых культурах клеток почки поросенка, тестикул поросенка, почки сибирского горного козерога, почки зеленой мартышки.

Инфекционная активность. Инфекционная активность штамма в культуре клеток КМС и на свиньях составляет

соответственно.

Патогенные свойства. Штамм патогенен только для свиней всех пород и возрастных групп. При внутримышечном заражении вирус вызывает их гибель с признаками острой формы болезни с характерными клиническими симптомами АЧС. У заболевших свиней на 3-5 сутки после заражения отмечают повышение температуры тела до 41,5-42,0°С, цианоз кожи, угнетение, отказ от корма, нарушение координации движений, учащенное дыхание, у отдельных животных парез задних конечностей. Длительность болезни у животных составляет от 3 до 6 суток. В ряде случаев животные погибают без проявления характерных клинических признаков АЧС на 3-4 сутки после внутримышечного заражения (сверхострая форма).

Патологоанатомические изменения. Патоморфологические изменения у взрослых свиней характерны для острой формы АЧС. На серозных оболочках внутренних органов наблюдаются кровоизлияния, в грудной и брюшной полостях скопление серозно-геморрагического экссудата, междольковая ткань легких отечна, у отдельных животных с признаками серозно-геморрагической пневмонии. Лимфоузлы увеличены, темно-красного цвета, на разрезе геморрагически воспалены. Селезенка увеличена, кровенаполнена, черного цвета. Печень кровенаполнена, дряблой консистенции, темно-коричневого цвета.

Контагиозность. Штамм контагиозен для свиней. Интактные свиньи заболевают АЧС при совместном содержании с инфицироваными штаммом «Ставрополь 01/08» животными.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами. Штамм не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Способ получения и условия хранения. Штамм хранят при минус 40°С в виде лиофилизированной вируссодержащей крови, которую получают от внутримышечно зараженных свиней, находящихся в агональном состоянии. Периодичность освежения штамма один раз в 10 лет.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Накопление вируса в культуре клеток КМС

В табл.1 приведены сведения по культивированию штамма «Ставрополь 01/08»» вируса АЧС в монослое культуры клеток КМС, в течение 20 последовательных пассажей.

Таблица 1
Накопление вируса АЧС в процессе пассирования
Характеристика штамма	* Доза заражения	Накопление вируса (lg ГАЕ_50/см3)
	1 пас.	5 пас.	10 пас	20 пас.
Лиофилизиро-ванная вирус-кровь (2 пассаж)	1,0	6,0	6,25-6,5	6,5-6,75	6,25-7,0
Лиофилизиро-ванная вирус-кровь (2 пассаж)	0,1	6,0-6,25	6,5	6,5-7,0	6,5-6,75
0,001	6,0-6,25	6,25-7,0	6,5-6,75	6,25-7,0
Примечание: * - Доза заражения приведена в lg ГАЕ_{50/клетка.}

Как видно из табл.1, в течение 20 последовательных пассажей штамм «Ставрополь 01/08» вируса АЧС стабильно размножается в монослое культуры клеток КМС. Через 96-120 часов культивирования при температуре 37,0-37,5°С накопление вируса составляло 6,0-7,0 lg ГАЕ_50/см3. Размножение вируса сопровождалось феноменом гемадсорбции с последующим цитолизом инфицированных клеток. Заражающая доза 1,0-0,01 ГАЕ_{50/клетка} не влияла на накопление вируса. В более ранние сроки (48-72 час) цитолиз клеток наступает при инфицирующей дозе 1 ГАЕ_{50/клетка.}

Полученный вируссодержащий материал обладает высокой инфекционной активностью и может быть использован при проведении фундаментальных и прикладных НИОКР.

Пример 2.

Определение типовой принадлежности штамма «Ставрополь 01/08»

Типовая принадлежность штамма определена в РЗГАд со специфическими референс-сыворотками I-VIII серотипов по разработанной в ГНУ ВНИИВВиМ методике. Установлено, что только специфическая референс-сыворотка, полученная на штамм Родезия вируса АЧС, вызывает задержку гемадсорбции штамма «Ставрополь 01/08». На основании этих исследований штамм «Ставрополь 01/08» отнесен к вирусу АЧС VIII-го серотипа и принят в качестве референс-штамма.

Результаты типирования штамма приведены в табл.2.

Таблица 2
Результаты типизации штамма «Ставрополь 01/08» вируса АЧС в РЗГАд
Штаммы вируса АЧС	Типовые референс-сыворотки (серотип)	Серотип вируса
I	II	III	IV	V	VI	VII	VIII
Референс-штаммы
Лиссабон - 57	-	+	+	+	+	+	+	+	I
Конго - 49	+	-	+	+	+	+	+	+	II
Мозамбик - 78	+	+	-	+	+	+	+	+	III
Франция - 32	+	+	+	-	+	+	+	+	IV
ТСП - 80	+	+	+	+	-	+	+	+	V
ТС/7	+	+	+	+	+	-	+	+	VI
Уганда	+	+	+	+	+	+	-	+	VII
Родезия	+	+	+	+	+	+	+	-	VIII
Испытуемый вирус
Ставрополь 01/08	+	+	+	+	+	+	+	-	VIII
Примечание: (-) - отсутствие (задержка) ГАд
	(+) - специфическая ГАд

Пример 3

Изучение биологических свойств изолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ.

При изучении биологических свойств изолятов вируса АЧС, выделенных при мониторинговых исследованиях в РФ, в качестве референс-штамма использовали штамм «Ставрополь 01/08». Результаты этих исследований приведены в табл.3.

Таблица 3
Результаты изучения вируса АЧС, выделенного в РФ
Наименование штаммов и изолятов	Биологические свойства
Наличие ГАд	* Титр вируса в культуре КМС	Форма болезни	Генотип	Серотип
	Референс-штамм
Ставрополь 01/08	+	6.0-7.0	Острая	2	VIII
	Изучаемые изоляты
Краснодар 01/09	+	6.0-6,5	Острая	2	VIII
Северная Осетия	+	6.0-6,5	Острая	2	VIII
Ростов 01/09	+	6.25-,70	Острая	2	VIII
Чечня 04/09	+	6.0-,75	Острая	2	VIII
Примечание: (+) - признак положительный
	* - титр вируса выражен в lg ГАЕ_50/см3

Как видно из табл.3, изоляты вируса АЧС «Краснодар 01/09», «Северная Осетия», «Ростов 01/09», «Чечня 04/09» имели сравнимые характеристики с референс-штаммом «Ставрополь 01/08». Это указывает на общность происхождения и идентичность возбудителя АЧС, циркулирующего на территории РФ.

Источники информации

1.Диагностика африканской чумы свиней. И.Ф.Вишняков, Н.И.Митин, А.Н.Курносов, В.М.Колосов, Ф.А.Бадаев, И.В.Федорищев, В.А.Бурлаков // Материалы научной конференции ВНИИВВиМ. - Покров, 1992. - С.57-70.

2. Сероиммунологическая классификация природных изолятов вируса африканской чумы свиней. И.Ф.Вишняков, Н.И. Митин, Ю.И. Петров и др. // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: Материалы научно-практич. конф. ВНИИВВиМ. - Покров, 1995. - С.141-143.

3. Селянинов Ю.О. Вирус африканской чумы свиней: физическое картирование генома штаммов / Ю.О.Селянинов, В.М.Балышев, С.Ж.Цыбанов / Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2000. - №5. - С.75-76.

4. Genotyping fielstraing of African swine fever by partial p72 gene characterization. A.D.S. Bastos [et al.] // Arch. Virol - 2003, vol.148, - P.693-706.

5. Malmguist W.A. Serologic and immunologic studies with African swine fever virus / W.A. Malmguist // Amer. J. Vet. Res. 1963. - P.24.

Штамм «Ставрополь 01/08» вируса АЧС семейства Asfarviridae рода Asfivirus, инв. №2783, депонированный в Коллекции микроорганизмов ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН, предложен в качестве вирулентного референс-штамма 8-го серотипа для проведения вирусологических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам оценки пролиферативного состояния лимфоцитов, и может быть использовано в диагностике. .

Способ прогноза эффективности лечения острого риносинусита // 2438134

Изобретение относится к медицине, в частности к оториноларингологии и иммунологии. .

Способ прогнозирования эффективности лечения рассеянного склероза глюкокортикоидами // 2438133

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, и описывает способ прогнозирования эффективности лечения рассеянного склероза глюкокортикоидами путем исследования крови, где определяют содержание в крови абсолютного количества лимфоцитов с признаками апоптоза, вычисляют индекс реализации запрограммированной клеточной смерти ИРА(%) до лечения, во время терапии и после лечения по формуле, и при нарастании величины индекса реализации апоптоза (ИРА) после лечения глюкокортикоидами по отношению к первоначальным его значениям оценивают лечение как эффективное, а при отсутствии динамики прогнозируют отрицательный эффект от использования гормональной терапии.

Способ визуализации астроглиального вала в диагностике низкодифференцированных глиом // 2437159

Изобретение относится к области медицины, а именно к нейрохирургии. .

Способ экспресс-определения атерогенности крови (варианты) // 2437098

Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано для экспресс-определения атерогенности плазмы крови человека. .

Способ определения специфических ige-антител к стафилококку в сыворотке крови больного аллергическими заболеваниями, имеющего гиперчувствительность к аллергенам стафилококка, с применением тест-системы для определения специфических ige-антител к стафилококку, выделенная из стафилококка активная аллергенная субстанция (аас) и способ диагностики стафилококковой аллергии // 2436100

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии и аллергологии. .

Способ прогнозирования гематогенного метастазирования у больных раком молочной железы при проведении противоопухолевого лечения // 2436099

Изобретение относится к области медицины, а именно, к онкологии, и описывает способ прогнозирования гематогенного метастазирования в отдаленные органы у больных раком молочной железы (РМЖ) при проведении противоопухолевого лечения путем определения показателей крови, а именно показателей иммунной системы при постановке диагноза, во время противоопухолевого лечения и после его окончания: количество CD4+ клeтoк периферической крови, %, количество CD8+ клеток периферической крови, %, количество CD56+ клеток периферической крови, %, количество CD22+ клeтoк периферической крови, %, количество CD95+ клeтoк периферической крови, %, функциональный резерв нейтрофилов в НСТ-тесте (тест восстановления нитросинего тетразолия), у.е., функциональный резерв нейтрофилов в НСТ-тесте, %, спонтанную активность нейтрофилов в НСТ-тесте, у.е., спонтанную активность нейтрофилов в НСТ-тесте, %, уровень циркулирующих иммунных комплексов, у.е., уровень иммуноглобулина G (IgG) в сыворотке крови, г/л, уровень IgM в сыворотке крови, г/л, уровень IgA в сыворотке крови, г/л, иммунорегуляторный индекс (ИРИ CD4 +/CD8+), уровень спонтанной продукции фактора некроза опухоли- (ФНО ) клетками периферической крови, пг/мл, уровень спонтанной продукции интрелейкина-1 (ИЛ-1 ) клетками периферической крови, пг/мл, уровень стимулированной продукции ИЛ-1 клетками периферической крови, пг/мл, количество CD3 + клеток периферической крови, %, активность системы комплемента в сыворотке крови, у.е., количество CD25+ клeтoк периферической крови, %, индекс стимуляции пролиферации лимфоцитов фитогемагглютинином (ИС ФГА), пролиферативную активность лимфоцитов при стимуляции ФГА, спонтанную пролиферативную активность лимфоцитов, уровень клеток периферической крови с признаками морфологического апоптоза, %, и рассчитывают дискриминантные функции Y1, Y 2, по дискриминантным уравнениям, соответствующим каждому этапу наблюдения, при этом классифицируемый случай относят к тому классу прогноза, для которого получено большее значение вычисленной дискриминантной функции.

Детектирование рака яичника по повышенным уровням bcl-2 в моче // 2436098

Изобретение относится к области медицины и касается способа диагностики рака яичника. .

Биомаркеры ишемии и их применение для прогнозирования неблагоприятных неврологических последствий хирургической операции // 2435165

Изобретение относится к медицине и касается способа прогнозирования появления неблагоприятных неврологических последствий хирургической операции. .

Способ прогнозирования развития осложнений геморрагической лихорадки с почечным синдромом в начальный период заболевания // 2433407

Изобретение относится к области медицины, а именно к разделу инфекционных болезней, и описывает способ оценки тяжести течения геморрагической лихорадки с почечным синдромом, включающий определение маркера дисфункции эндотелия сосудов в крови, где в плазме крови в качестве маркера дисфункции эндотелия сосудов определяют концентрацию антигена ингибитора активаторов плазминогена 1 типа (ИАП-1) в лихорадочный период болезни и значение концентрации антигена ИАП-1 от 341,2 до 570,0 нг/мл оценивают как предиктор среднетяжелой формы заболевания, от 240,4 до 320,1 нг/мл - как предиктор тяжелой формы заболевания без осложнений, от 138,3 до 75,5 нг/мл оценивают как предиктор тяжелой формы заболевания с осложненным течением.

Штамм бактериофага acinetobacter baumannii ар22 для идентификации бактерий acinetobacter baumannii при бактериологическом анализе клинического материала и для получения препарата против внутрибольничных a.baumannii-инфекций // 2439151

Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии и касается штамма бактериофага Acinetobacter baumannii AP22, который может быть использован для создания новых диагностических и лечебных препаратов.

Штамм "ас-21/07" вируса ауески для изготовления вакцинных и диагностических препаратов // 2439150

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано для изготовления вакцинных и диагностических препаратов. .

Штамм вируса гриппа a/herring gull/mongolia/454/08/ h13n8-субтипа, используемый при получении антигенсодержащего субстрата и сыворотки для диагностических целей // 2439149

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и микробиологии, а именно к штамму вируса гриппа H13N8 - субтипа. .

Инактивированные химерные вакцины и связанные с ними способы применения // 2436591

Способ продуцирования репликативной частицы вируса гриппа, композиция клеток (варианты), композиция клеточной культуры и ее применение // 2435855

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и медицины. .

Способ получения пероральной вакцины против вируса бешенства // 2432963

Изобретение относится к области биотехнологии ветеринарных препаратов. .

Реассортантный штамм вируса гриппа rn 1/09-swine a(h7n1) для определения антител к нейраминидазе при гриппозной инфекции и вакцинации // 2428476

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается реассортантного диагностического штамма RN1/09-swine A(H7N1). .

Способ получения биологически активного комплекса // 2427386

Изобретение относится к области молекулярной биологии, иммунологии, вирусологии и касается способа получения биологически активного комплекса. .

Биологически активный комплекс, обладающий протективной активностью против вируса гриппа // 2427385

Изобретение относится к области молекулярной биологии, иммунологии, вирусологии. .

Штамм бактериофага escherichia coli v32 для идентификации бактерий escherichia coli серогруппы о157 // 2425877

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к методам идентификации и дифференциации культур с использованием бактериофага. .

Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение // 2441067

Изобретение относится к областям молекулярной биологии, вирусологии, иммунологии и медицины