Способ хроматографической очистки октреотида


 

C07K1/20 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение
C07K1/16 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2441018:

Закрытое акционерное общество "Фарм-Синтез" (RU)

Изобретение относится к области фармацевтической химии, конкретно к способу хроматографической очистки циклического пептида октреотида I, и имеет своей целью разработку полупромышленного процесса очистки октреотида-сырца. Сущность изобретения заключается в том, что очистка осуществляется методом препаративной ВЭЖХ, в частности, на сорбенте VYDAK С18 120А 10 мкм (производитель Grace) с использованием в качестве элюента тройной системы изопропиловый спирт - вода - уксусная кислота в присутствии неорганичесих и (или) органических иодидов, например, таких как йодистый калий, йодистый аммоний, йодистый натрий или йодистый тетраалкиламмоний (N+RR'R''R'''I-, где R, R', R'', R''' - алкил С1-С4 или бензил).

D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OI (I)

 

Изобретение относится к способам хроматографической очистки синтетических пептидных препаратов, а именно октреотида, и может быть использовано для получения высокоочищенных субстанций.

Октреотид представляет собой синтетический октапептид, являющийся аналогом естественного гормона соматостатина и обладающий сходными с ним фармакологическими эффектами, но значительно большей продолжительностью действия. Он подавляет патологически повышенную секрецию гормона роста, а также пептидов и серотонина, продуцируемых в гастроэнтеропанкреатической эндокринной системе. Октреотид применяется как лекарственное средство для лечения акромегалии, опухолей гастропанкреатической эндокринной системы, а также используется как действенное средство профилактики осложнений в панкреатической хирургии.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) является вариантом колоночной жидкостной хроматографии, в которой подвижная фаза (ПФ) - элюент - проходит через колонку, заполненную сорбентом, (ПФ) с большей скоростью за счет значительного давления (десятки и сотни атмосфер) на входе в хроматографическую колонку.

ВЭЖХ является удобным способом разделения и проведения количественного и качественного анализа термолабильных соединений как с малой, так и с большой молекулярной массой.

Плотная упаковка частиц адсорбента малого диаметра (5-20 мкм) в колонке позволяет получить высокоэффективное хроматографическое разделение компонентов смеси.

Жидкостная хроматография стала усиленно развиваться, особенно в последнее время. Разработка новых методов детектирования, создание специальных носителей и сорбентов, углубление понимания механизма хроматографических процессов дало возможность резко увеличить скорости разделения и сократить время проведения анализов.

В настоящее время ВЭЖХ широко применяется в экологической аналитической химии, для анализа лекарственных средств, пищевых продуктов, разделения многокомпонентных смесей органических соединений, очистки фармацевтических субстанций и их полупродуктов и т.д.

Известен, в частности, способ хроматографической очистки пептидного препарата бусерелина. Бусерелин-сырец обрабатывают 0,1 М раствором уксусной кислоты, осадок отделяют, а жидкую фазу наносят на колонну со стиролдивинилбензольным сорбентом с последующим элюированием раствором уксусной кислоты; далее элюат хроматографируют в режиме ВЭЖХ на обращенно-фазном сорбенте Диасфер-110- С18 с размером частиц 16 мкм в градиенте изопропилового спирта с добавками органических кислот (см. RU 2332248, 27.08.2008) (1).

Известно достаточно большое количество примеров получения октреотида, и в большинстве из них очистка продукта стадии окислительной циклизации (октреотид-сырец) производится методами препаративной ВЭЖХ. Однако ни в одной из них нет конкретного описания процесса хроматографирования. Так, в WO 2006041945 A2 (not classified, 20.04.2006, С07K 1/20, 7/16) (2) было отмечено, что октреотид-сырец был очищен с использованием препаративной ВЭЖХ на С18 колонке с использованием в качестве элюента системы ацетонитрил - вода - 0,1% трифторуксусная кислота. В WO 2007110765 А2, С07К 7/06, 04.10.2007) (3) в качестве элюента использовали систему метиловый спирт - уксусная кислота с добавкой 0,1-4% ацетата аммония. Препаративная ВЭЖХ была выполнена на YMC ODS-A колонке 50×500 мм с размером зерна 15 микрон и размером пор 12 нм. При этом содержание октреотида в растворе на деление составляло 1 г/л.

Технической задачей заявленного изобретения является разработка высокоэффективного полупромышленного способа очистки октреотида с использованием метода препаративной ВЭЖХ.

Поставленная техническая задача достигается заявленным способом хроматографической очистки октреотида, включающим обработку раствора октреотида-сырца неорганическим и/или органическим йодидом и последующую ступенчатую очистку полученного раствора методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием в качестве элюента тройной системы изопропиловый спирт - вода - уксусная кислота.

Используемый неорганический и/или органический йодид выбран, например, из группы, включающей йодистый калий, йодистый аммоний, йодистый натрий или йодистый тетраалкиламмоний (N+RR'R''R'''I-, где R, R', R'', R''' - алкил С1-С4 или бензил).

Очистку осуществляют, в частности, на сорбенте VYDAK С18 120А 10 мкм (производитель Grace) с использованием в качестве элюента тройной системы изопропиловый спирт - вода - уксусная кислота в присутствии неорганических и (или) органических иодидов, таких как йодистый тетраалкиламмоний, йодистый калий, йодистый аммоний, йодистый натрий. Используют иодиды, например, в массовом соотношении 0,1-5 к октреотиду. Так, для очистки октреотида до чистоты >98% необходимо, чтобы содержание октреодида в растворе на деление составляло 1 г/л. Добавление иодидов позволяет получать фракцию, содержащую октреотид более компактной, и, кроме того, для достижения той же самой чистоты (>98%) содержание октреодида в растворе на деление может составлять 4-5 г/л, что существенно увеличивает производительность стадии очистки.

Аналитическую ВЭЖХ проводили на хроматографе фирмы Shimadzu. Колонка - из нержавеющей стали Grom-Sil 12J ODS-4HE, 5µm, 250*4,6 mm. Условия: градиент с 20%В до 40%В за 20 минут, А - вода+фосфатный буфер рН 3, В - ацетонитрил.

Препаративную ВЭЖХ проводили на хроматографе фирмы Shimadzu. Насос ВЭЖХ Shimadzu LC-8A, расход до 150 мл в минуту.

Спектрофотометрический детектор Shimadzu SPD-20A, колонка 250*50 mm, сорбент VYDAK С18 120А 10 мкм, производитель Grace.

В качестве элюента при проведении очистки методом ВЭЖХ используют водные буферные растворы (тройные системы изопропиловый спирт - вода - уксусная кислота). Буферные растворы (водные):

А1 - 3% Изопропилового спирта, 3 мл/л Уксусной кислоты;

А2 - 6% Изопропилового спирта, 3 мл/л Уксусной кислоты;

В - 35% Изопропилового спирта, 3 мл/л Уксусной кислоты.

Нижеследующие примеры иллюстрируют заявленное изобретение, но не ограничивают его.

Пример 1.

Подготовительная операция.

На стадию очистки октреотид-сырец поступает в виде раствора, полученного из реакционной смеси после окислительной циклизации и выдержанного при 4-7°С в течении 12-24 часов. За это время из раствора выпадают в виде вязкого налета сопутствующие примеси.

Далее полученный раствор фильтруют под вакуумом через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Фильтрат слегка желтоватого цвета переливают в мерную емкость для определения объема. После этого отбирают 100 мкл раствора, разбавляют в 100 раз и анализируют на аналитическом хроматографе для определения содержания октреотида. После определения общего количества октреотида добавляют равное по массе количество йодистого тетраметиламмония (соотношение октреотид/йодистый тетраметиламмоний 1:1), перемешивают до полного растворения, и раствор октреотида сырца переливается в емкость для хранения, которую помещают в холодильник (2-5°С).

Очистка на препаративной ВЭЖХ установке.

Колонка уравновешивается буфером А1 в течение 20 минут при скорости 80 мл/мин. Далее на колонку наносится раствор октреотида-сырца (содержание октреодида в растворе 5-7 г/л), содержащий 1,8-2,2 грамма в пересчете на октреотид. Нанесение ведется со скоростью 40 мл/мин. После нанесения образца запускается программа ступенчатой элюции. В течение 10 минут колонка прокачивается буфером А1. После этого с 10-ой минуты запускается изократическая элюция буфером А2.

До 35 минуты весь выходящий поток поступает в слив. После 35 минуты при достижении уровня поглощения (на 220 нм) 1500 мВ начинается сбор предпиковых фракций с содержанием октреотида более 50%. Через 2 минуты после начала сбора предпиковых фракций сбор переключается на емкость для сбора целевых фракций. Сбор целевых фракций ведется до момента снижения уровня поглощения до 1500 мВ. После этого сбор переключают опять в емкость для предпиковых фракций и ведут до снижения уровня поглощения до 100 мВ. Сбор прекращают и начинают промывку буфером В со скоростью 80 мл/мин. После 7-10 минут промывки выходят основная масса примеси. После падения уровня поглощения до базовой линии разделение прекращают.

Чистота продукта по данным ВЭЖХ - 98,4%;

Выход - 80,0% от содержания октреотида в сырье.

Пример 2. Хроматографическую очистку октреотида осуществляют аналогично примеру 1, но в качестве йодида используют йодистый калий (при массовом соотношении октреотид/йодистый калий 1:1,8).

Чистота продукта по данным ВЭЖХ - 98,7%;

Выход - 85,0% от содержания октреотида в сырье.

Пример 3. Хроматографическую очистку октреотида осуществляют аналогично примеру 1, но в качестве йодида используют йодистый аммоний (при массовом соотношении октреотид/йодистый аммоний 1:0,7).

Чистота продукта по данным ВЭЖХ - 99,0%;

Выход - 84,5% от содержания октреотида в сырье.

Пример 4. Хроматографическую очистку октреотида осуществляют аналогично примеру 1, но в качестве йодида используют йодистый натрий (при массовом соотношении октреотид/йодистый натрий 1:0,9). Чистота продукта по данным ВЭЖХ - 99,2%;

Выход - 87,0% от содержания октреотида в сырье.

Далее после проведения ступенчатой ВЭЖХ из емкостей для предпиков и целевых фракций отбираются пробы, разбавляются в 10 раз и анализируются на аналитическом хроматографе. Подсчитывается чистота этих фракций и содержание в них октреотида. Если целевые фракции удовлетворяют критериям чистоты (>98%), то их сливают в емкость для целевых фракций. Если чистота предпиковых фракций составляет >50% и <98%, то их сливают в емкость для предпиковых фракций.

Концентрирование.

Раствор из емкости для целевых фракций поступает на стадию его концентрирования. Его разбавляют вдвое и наносят на колонку со скоростью 150 мл/мн. После этого начинают элюцию октреотида буфером В. Через 5-7 минут начинается резкое нарастание оптической плотности, в этот момент начинают сбор сконцентрированного октреотида. Сбор продолжают до падения поглощения ниже 50 мВ.

Раствор сконцентрированного октреотида упаривают на роторном испарителе до полного удаления изопропилового спирта, замораживают и лиофилизуют.

Концентрирование предпиковых фракций производят таким же образом. После упаривания на роторном испарителе до полного удаления изопропилового спирта полученный раствор снова очищают на ВЭЖХ системе по методике, приведенной выше.

Таким образом, заявленный способ позволяет осуществить эффективную очистку октреотида-сырца полупромышленным методом с использованием метода ВЭЖХ с получением конечного продукта высокой степени очистки (>98%).

Источники информации, принятые во внимание

1. RU 2332248, 27.08.2008.

2. WO 2006041945 A2, not classified, 20.04.2006, C07K 1/20, 7/16.

3. WO 2007110765 A2, С07К 7/06, 04.10.2007.

Способ хроматографической очистки октреотида, включающий обработку раствора октреотида-сырца неорганическим и/или органическим йодидом и последующую ступенчатую очистку методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием в качестве элюента тройной системы изопропиловый спирт - вода - уксусная кислота.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к производным метотрексата, которые содержат белоксвязывающую группу и могут быть ферментативно расщеплены в теле, так что высвобождается активное соединение или низкомолекулярное производное активного соединения.
Изобретение относится к твердофазному способу синтеза пептида формулы H-D- -Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2, в котором используются и Вос-защищенные, и Fmoc-защищенные аминокислоты и смола из хлорметилированного полистирола.

Изобретение относится к области биохимии и иммунологии и может быть применено в медико-биологической промышленности при производстве препаратов для профилактики и лечения раковых заболеваний.

Изобретение относится к области фармацевтической химии, конкретно к способу получения октреотида жидкофазным методом путем окислительной циклизации с использованием в качестве окислительного и деблокирующего реагента трииодида калия в водно-метанольном растворе.

Изобретение относится к области медицины, в частности к области химиотерапии. .

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. .
Изобретение относится к твердофазному способу синтеза пептида формулы H-D- -Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2, в котором используются и Вос-защищенные, и Fmoc-защищенные аминокислоты и смола из хлорметилированного полистирола.

Изобретение относится к области фармацевтической химии, конкретно к способу получения октреотида жидкофазным методом путем окислительной циклизации с использованием в качестве окислительного и деблокирующего реагента трииодида калия в водно-метанольном растворе.

Изобретение относится к способу получения циклических аналогов соматостатина формулы I и промежуточным продуктам, применяемым в способе. .

Изобретение относится к медицине и биохимии и описывает парентеральные фармацевтические композиции, включающие аналог соматостатина и винную кислоту. .

Изобретение относится к химерному аналогу, включающему аналог соматостатина, выбранный из DPhe-цикло(Cys-3ITyr-DTrp-Lys-Val-Cys)-Thr-NH 2, DPhe-цикло(Cys-3ITyr-DTrp-Lys-Thr-Cys)-Thr-NH 2, DPhe-цикло(Cys-Tyr-DTrp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH 2, цикло(Cys-Tyr-DTrp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH 2, DTyr-DTyr-цикло(Cys-Tyr-DTrp-Lys-Abu-Cys)Thr-NH 2 и DTyr-DTyr-цикло(Cys-3ITyr-DTrp-Lys-Thr-Cys)Thr-NH 2 и фрагмент, связывающийся с рецептором допамина, выбранный из Dop2, Dop3, Dop4 и Dop5.
Наверх