Применения антител против cd40

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована при лечении рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками у пациента, гетерозиготного или гомозиготного в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F). Лекарственные средства по изобретению включают варианты моноклонального антитела против CD40, которое связывается с эпитопом, способным связывать моноклональное антитело CHIR-12.12. Способы по изобретению включают идентификацию пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, подлежащем лечению антителом против CD40 и не поддающемся лечению ритуксимабом путем определения генотипа FcγRIIIa-158 (V/V, V/F или F/F) с использованием биологического образца, полученного у этого пациента-человека. Использование изобретений позволяет лечить рак или предраковое состояние, не поддающееся лечению ритуксимабом. 4 н. и 39 з.п. ф-лы, 1 табл., 14 ил.

 

Настоящее изобретение относится к новым применениям антител против CD40, в частности к лечению разных типов рака и предраковых состояний, ассоциированных с CD40-экспрессирующими клетками.

Уровень техники

Многие члены семейства факторов некроза опухолей (TNF), включающие лиганды и соответствующие рецепторы, регулируют рост нормальных клеток, индуцируя апоптоз или повышая выживание и пролиферацию клеток. Существует баланс между сигналами, вызывающими апоптоз, и сигналами, повышающими выживание и пролиферацию клеток, который сохраняет гомеостаз нормальных клеток. В настоящее время идентифицировано, по крайней мере, 26 рецепторов семейства TNF и 18 лигандов семейства TNF. Биологически активные формы рецепторов и лигандов представляют собой аутособранные тримеры белков. Идентифицированы трансмембранные и растворимые формы рецепторов и лигандов. Несмотря на то, что внутриклеточные домены рецепторов не имеют гомологичных последовательностей, их внеклеточные домены содержат повторы в 40 аминокислот с высоким содержанием цистеина. Их цитоплазматические концевые сегменты передают сигналы в результате взаимодействия с двумя основными группами внутриклеточных белков, которыми являются факторы, ассоциированные с рецепторами TNF (TRAF), и белки, содержащие домен гибели (DD). Взаимодействие между, по крайней мере, шестью TRAF человека и TRAF-связывающими сайтами в цитоплазматическом концевом сегменте некоторых из указанных рецепторов инициирует несколько сигнальных путей, включающих АКТ (серин/треонинкиназа, определяемая как протеинкиназа В или РКВ), ядерный фактор-κВ (NF-κВ) и митогенактивируемые протеинкиназы (МАРК). См., например, обзорную статью Younes and Kadin (2003) J. Clin. Oncol. 18:3526-3534.

Рецептор CD40 семейства TNF является антигеном клеточной поверхности длиной 50-55 кДа, который присутствует на поверхности как нормальных, так и опухолевых В-клеток, дендритных клеток, моноцитов, макрофагов, CD8⁺ Т-клеток, эндотелиальных клеток, моноцитарных и эпителиальных клеток человека и многих солидных опухолей, включающих рак легкого, молочной железы, яичника, мочевого пузыря и ободочной кишки. Связывание лиганда CD40 (CD40L) с антигеном CD40 на В-клеточной мембране вызывает образование положительного костимулирующего сигнала, который стимулирует активацию и пролиферацию В-клеток, в результате чего происходит созревание В-клетки в плазмацит, который секретирует большое количество растворимого иммуноглобулина. CD40 активирует TRAF-2, -3, -5 и -6, которые усиливают различные сигнальные пути после взаимодействия CD40 с CD40L (с мембраносвязанным CD40L или растворимым CD40L), в том числе внеклеточную регулируемую сигналом киназу (ERK), с-jun аминоконцевую киназу (JNK), митогенактивируемую протеинкиназу р38 (МАРК), АКТ и NF-κВ (см., например, публикации Younes and Carbone (1999) Int. J. Biol. Markers 14:135-143; van Kooten and Banchereau (2000) J. Leukoc. Biol. 67:2-17).

Злокачественные В-клетки из опухолей В-клеточной линии дифференцировки экспрессируют CD40 и, по-видимому, зависят от передачи сигналов CD40, определяющих выживание и пролиферацию. Трансформированные клетки, полученные у субъектов, страдающих низкодифференцированной и высокодифференцированной В-клеточной лимфомой, В-клеточным острым лимфолейкозом, множественной миеломой, хроническим лимфолейкозом, макроглобулинемией Вальденстрема и болезнью Ходжкина, экспрессируют CD40. Экспрессия CD40 обнаружена также в случае острого миелобластного лейкоза и в 50% случаев СПИД-ассоциированных лимфом.

Некоторые карциномы и саркомы также характеризуются высокими уровнями экспрессии CD40, хотя роль передачи сигналов CD40 в указанных раковых клетках менее изучена. CD40-экспрессирующие карциномы включают рак мочевого пузыря (Paulie et al. (1989) J. Immunol. 142:590-595; Braesch-Andersen et al. (1989) J. Immunol. 142:562-567), рак молочной железы (Hirano et al. (1999) Blood 93:2999-3007; Wingett et al. (1998) Breast Cancer Res. Treat. 50:27-36); рак предстательной железы (Rokhlin et al. (1997) Cancer Res. 57:1758-1768); рак почки (Kluth et al. (1997) Cancer Res. 57:891-899), недифференцированный рак носоглотки (UNPC) (Agathanggelou et al. (1995) Am. J. Pathol. 147:1152-1160), плоскоклеточный рак (SCC) (Amo et al. (2000) Eur. J. Dermatol. 10:438-442; Posner et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5:2261-2270), папиллярные карциномы щитовидной железы (Smith et al. (1999) Thyroid 9:749-755), кожную злокачественную меланому (van den Oord et al. (1996) Am. J. Pathol. 149:1953-1961), рак желудка (Yamaguchi et al. (2003) Int. J. Oncol. 23(6):1697-702) и рак печени (см., например, публикацию Sugimoto et al. (1999) Hepatology 30(4): 920-26, в которой описаны печеночно-клеточные карциномы человека). Для ознакомления с CD40-экспрессирующими саркомами см., например, публикацию Lollini et al. (1998) Clin. Cancer Res. 4(8):1843-849, в которой описаны остеосаркома человека и саркома Юинга.

Передача сигналов CD40 защищает незрелые В-клетки и В-клеточные лимфомы от апоптоза, вызываемого IgM или Fas (см., например, публикацию Wang et al. (1995) J. Immunol. 155:3722-3725). Клетки лимфомы коры головного мозга экспрессируют большое количество CD40, при этом установлено, что введение экзогенного лиганда CD40 повышает выживание клеток и защищает их от апоптоза, вызываемого флударабином (Clodi et al. (1998) Brit. J. Haematol. 103:217-219). Роль передачи сигналов CD40 в выживании и пролиферации раковых В-клеток делает антиген CD40 потенциальной мишенью для противораковой терапии. Действительно, антитела против CD40 ингибируют пролиферацию и/или дифференцировку раковых В-клеток человека in vitro (см., например, публикацию заявки на патент США № 2004/0109857). При исследовании агрессивных лимфом человека в моделях с использованием мышей была продемонстрирована эффективность in vivo антител против CD40 для стимуляции выживания животных. См., например, публикации Funakoshi et al. (1994) Blood 83:2787-2794; Tutt et al. (1998) J. Immunol. 161:3176-3185; и Szocinski et al. (2002) Blood 100:217-223.

Лиганд CD40 (CD40L), известный также как CD154, является трансмембранным белком длиной 32-33 кДа, который также существует в двух биологически активных растворимых формах меньшей длины, соответственно равной 18 кДа и 31 кДа (Graf et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25:1749-1754; Mazzei et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:7025-7028; Pietravalle et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:5965-5967). CD40L экспрессирован в активированных, а не находящихся в состоянии покоя, CD4+ Т-клетках-хелперах (Lane et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22:2573-2578; Spriggs et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1543-1550; и Roy et al. (1993) J. Immunol. 151:1-14). CD40 и CD40L были клонированы и исследованы (Stamenkovi et al. (1989) EMBO J. 8:1403-1410; Armitage et al. (1992) Nature 357:80-82; Lederman et al. (1992) J. Exp. Med. 175:1091-1101; и Hollenbaugh et al. (1992) EMBO J. 11:4313-4321). См. также патент США № 5945513, в котором описан CD40L человека. Клетки, трансфецированные геном CD40L и экспрессирующие белок CD40L на своей поверхности, могут запускать пролиферацию В-клеток и вместе с другими стимулирующими сигналами могут вызывать продуцирование антител (Armitage et al. (1992) см. выше; и патент США № 5945513). У пациентов, страдающих лимфолейкозами, аутоиммунными заболеваниями, сердечно-сосудистыми заболевания и идиопатической тромбоцитопенией, имеют место повышенные уровни растворимого CD40L (sCD40L) в сыворотке, отсутствующие у здоровых субъектов. Конститутивная экспрессия CD40L наблюдалась в подгруппе пациентов, страдающих несколькими В-клеточными лимфолейкозами, включающими лимфому клеток коры головного мозга, фолликулярную лимфому, лимфому маргинальной зоны, хронический лимфолейкоз (CLL), генерализованную В-клеточную лимфому (DLBCL), фолликулярную лимфому (FL) и ВИЧ-инфицированную В-клеточную лимфому. См., например, Clodi et al. (1998) Br. J. Haematol. 103:270-275; Schattner et al. (1998) Blood 91:2689-2697; Moses et al. (1997) Nat. Med. 3:1242-1249; Trentin et al. (1997) Cancer Res. 57:4940-4947; и Pham et al. (2002) Immunity 16:37-50). CD40L может играть важную роль в зависящем от контактирования клеток взаимодействии CD40-экспрессирующих опухолевых В-клеток в опухолевых фолликулах или CD40-экспрессирующих клетках Рида-Стернберга на участках, пораженных болезнью Ходжкина (Carbone et al. (1995) Am. J. Pathol. 147:912-922). Однако механизм CD40L-опосредованной передачи сигналов CD40, вызывающих выживание раковых В-клеток вместо их гибели, полностью не изучен. Например, объяснение механизмов выживания клеток фолликулярной лимфомы предполагало уменьшение вызывающих апоптоз молекул TRAIL (APO-2L) (Ribeiro et al. (1998) British J. Haematol. 103:684-689) и сверхэкспрессию bcl-2, а в случае В-CLL уменьшение CD95 (Fas/APO-1) (Laytragoon-Lewin et al. (1998) Eur. J. Haematol 61:266-271). В отличие от этого данные, полученные при исследовании фолликулярной лимфомы, показывают, что активация CD40 вызывает увеличение TNF (Worm et al. (1994) International Immunol. 6:1883-1890) и молекул CD95 (Plumas et al. (1998) Blood 91:2875-2885).

Моноклональные антитела против CD40 человека и различные применения указанных антител описаны в публикациях совместных заявок на патент WO 2005/044854, WO 2005/044304, WO 2005/044305, WO 2005/044306, WO 2005/044855, WO 2005/044307 и WO 2005/044294. В указанных заявках, в частности, описано моноклональное антитело против CD40 IgG₁ человека, получившее название CHIR-12.12, которое было создано в результате иммунизации трансгенных мышей, несущих локус тяжелой цепи IgG₁ человека и локус легкой κ-цепи человека (технология XenoMouse®; Abgenix, California).

Как показал анализ методом FACS, антитело CHIR-12.12 специфически связывается с CD40 человека и может предотвращать связывание CD40 с лигандом (CD40L). CHIR-12.12 может препятствовать предварительному связыванию CD40L с CD40 на клеточной поверхности. Моноклональное антитело CHIR-12.12 является сильным антагонистом и ингибирует in vitro CD40L-опосредуемую пролиферацию нормальных и раковых В-клеток. Моноклональное антитело CHIR-12.12 непосредственно ингибирует выживание и сигнальные пути, опосредуемые CD40L в нормальных В-лимфоцитах человека. Антитело CHIR-12.12 убивает in vitro первичные раковые клетки пациентов, страдающих NHL, под воздействием антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Противоопухолевое действие в зависимости от дозы наблюдалось в модели ксенотрансплантированной лимфомы человека. В настоящее время антитело CHIR-12.12 проходит испытания первой стадии для лечения В-клеточных лейкозов.

CD20 является антигеном клеточной поверхности, экспрессируемым в начале дифференцировки В-клеток, который остается на клеточной поверхности на протяжении всего развития В-клеток. CD20 участвует в активации В-клеток, экспрессирован в очень большом количестве в опухолевых В-клетках и является клинически признанной терапевтической мишенью (см., например, публикацию Hooijberg et al. (1995) Cancer Research 55:2627). Антитела, направленно воздействующие на CD20, такие как ритуксимаб (Rituxan®), были одобрены Управлением США по продуктам и лекарственным средствам для лечения неходжкинской лимфомы (см., например, публикацию Boye et al. (2003) Ann. Oncol. 14:520). Установлено, что Rituxan® позволяет эффективно лечить низко-, средне- и высокодифференцированную неходжкинскую лимфому (NHL) и оказывает активное действие в случае других В-клеточных злокачественностей (см., например, публикации Maloney et al. (1994) Blood 84:2457-2466), McLaughlin et al. (1998) J. Clin. Oncol. 16:2825-2833, Maloney et al. (1997) Blood 90:2188-2195, Hainsworth et al. (2000) Blood 95:3052-3056, Colombat et al. (2001) Blood 97:101-106, Coiffer et al. (1998) Blood 92:1927-1932), Foran et al. (2000) J. Clin. Oncol. 18:317-324, Anderson et al. (1997) Biochem. Soc. Trans. 25:705-708, или Vose et al. (1999) Ann. Oncol. 10:58a).

Несмотря на то, что точный механизм действия не известен, имеющиеся данные показывают, что противолимфомное действие ритуксана (Rituxan®) частично возникает вследствие комплемент-опосредованной цитотоксичности (СМС), антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC), ингибирования пролиферации клеток и, наконец, прямой индукции апоптоза. ADCC является основным механизмом действия многих представленных на рынке и исследуемых моноклональных антител. Однако у некоторых пациентов возникает устойчивость к лечению препаратом Rituxan® (см. публикации Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20:3262, Grillo-Lopez et al. (1998) J. Clin. Oncol. 16:2825 или Jazirehi et al. (2003) Mol. Cancer Ther. 2:1183-1193). Например, у некоторых пациентов прекращается экспрессия CD20 в раковых В-клетках после лечения антителом против CD20 (Davis et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5:611). Кроме того, у 30%-50% пациентов, страдающих низкодифференцированной NHL, не возникает клинической реакции на данное моноклональное антитело (Hainsworth et al. (2000) Blood 95:3052-3056; Colombat et al. (2001) Blood 97:101-106). Было также установлено, что клиническая активность ритуксимаба при лечении NHL зависит от генотипа FcγRIIIa пациента. Пациенты с полиморфизмом V/V или V/F FcγRIIIa 158aa более восприимчивы к воздействию ритуксимаба, чем пациенты с F/F (см., например, публикацию Cartron et al. (2002) Blood 99(3):754-758 или Dall'Ozzo et al. Cancer Res. (2004) 64:4664-4669). Пациентам, у которых возникла устойчивость к данному моноклональному антителу или страдающим В-клеточной лимфомой, устойчивой к первоначальному лечению указанным антителом, необходимы альтернативные формы терапевтического лечения.

Таким образом, существует постоянная потребность в новых лекарственных средствах и новых методах лечения рака и предраковых состояний. В частности, существует потребность в новых методах лечения пациентов, гомозиготных или гетерозиготных в отношении FcγRIIIa-158F, которые не поддаются лечению антителами против CD20, такими как ритуксимаб (Rituxan®). Кроме того, антитело, способное убивать раковые клетки без необходимости использования конъюгата, позволит получить более дешевое лекарственное средство и может оказывать меньше побочных эффектов.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способам лечения у пациента-человека рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками, когда указанный пациент-человек является гетерозиготным или гомозиготным в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F). Способы по настоящему изобретению включают введение пациенту-человеку терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40. Настоящее изобретение относится также к применению терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40 для приготовления лекарственного средства для лечения рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками, у пациента-человека, гетерозиготного или гомозиготного в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F).

Настоящее изобретение относится также к способам ингибирования продуцирования антител В-клетками у пациента-человека, гетерозиготного или гомозиготного в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F), которые включают введение указанному пациенту-человеку эффективного количества антитела против CD40. Настоящее изобретение относится также к применению эффективного количества антитела против CD40 для получения лекарственного средства для ингибирования продуцирования антител В-клетками у пациента-человека, гетерозиготного или гомозиготного в отношении FcγRIIIa-158F (V/F или F/F).

Настоящее изобретение относится к способам идентификации пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, подлежащем лечению антителом против CD40 и не поддающемся лечению ритуксимабом (Rituxan®), и к наборам для осуществления указанных способов. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные способы включают: а) идентификацию пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, ассоциированном с CD40-экспрессирующими клетками и не поддающемся лечению ритуксимабом (Rituxan®); и b) определение у указанного пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158 (V/V, V/F или F/F); при этом рак или предраковое состояние подлежат лечению антителом против CD40, если данный пациент-человек является гетерозиготным или гомозиготным в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F). Настоящее изобретение может далее включать стадию введения пациенту-человеку, идентифицированному указанным способом, терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40. Наборы по настоящему изобретению, с помощью которых может быть идентифицирован пациент-человек, страдающий раком или находящийся в предраковом состоянии, подлежащем лечению антителом против CD40, включают реагенты для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158.

Настоящее изобретение относится также к способам выбора терапии антителом для лечения пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, не поддающемся лечению ритуксимабом (Rituxan®), и к наборам для осуществления указанных способов. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные способы включают: а) идентификацию пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, ассоциированном с CD40-экспрессирующими клетками и не поддающемся лечению ритуксимабом (Rituxan®); и b) определение у указанного пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158 (V/V, V/F или F/F); при этом, если указанный пациент-человек является гетерозиготным или гомозиготным в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F), для лечения рака или предракового состояния выбирают антитело против CD40. Настоящее изобретение может включать стадию введения пациенту-человеку, идентифицированному указанным способом, терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40. Наборы по настоящему изобретению, позволяющие выбрать терапию антителом для лечения пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, ассоциированном с CD40-экспрессирующими клетками, включают реагенты для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158.

Настоящее изобретение относится также к способам лечения у пациента-человека рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками, которые включают введение указанному пациенту-человеку медленно интернализирующего антитела. В одном таком варианте осуществления изобретения терапевтически или профилактически эффективное количество антитела против CD40 вводят пациенту-человеку так, что указанное антитело против CD40 не подвергается значительной интернализации CD40-экспрессирующими клетками после введения. В другом таком варианте осуществления изобретения терапевтически или профилактически эффективное количество антитела против CD40 вводят пациенту-человеку так, что антитело против CD40 по существу равномерно распределяется по поверхности CD40-экспрессирующих клеток после введения. В другом таком варианте осуществления изобретения антитело против CD40 вводят пациенту-человеку так, что терапевтически или профилактически эффективное количество антитела против CD40 остается на поверхности CD40-экспрессирующих клеток пациента-человека после введения.

Антитела против CD40, предназначенные для применения в соответствии с настоящим изобретением, специфически связывают антиген CD40. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела против CD40, предназначенные для применения в способах по настоящему изобретению, в частности моноклональные антитела, обладают сильным сродством связывания с FcγRIIIa-158V человека, сильным сродством связывания с FcγRIIIa-158F человека или сильным сродством связывания с FcγRIIIa-158V и FcγRIIIa-158F человека. В некоторых указанных вариантах осуществления изобретения антитела против CD40 могут связываться с любым из двух аллотипов (V или F) аминокислоты FcγRIIIa 158 на естественных клетках-киллерах (NK) с характеристиками связывания, вызывающими сильную антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC). Приемлемые антитела против CD40 включают, не ограничиваясь ими, антитела против CD40, не обладающие значительной агонистической активностью, в том числе, например, антитела против CD40, которые являются антагонистами CD40-CD40L, передающими сигналы в CD40-экспрессирующие клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело против CD40 выбирают из группы, включающей: а) моноклональное антитело CHIR-12.12; b) моноклональное антитело, продуцированное линией клеток гибридомы 12.12; с) моноклональное антитело, содержащее аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из последовательности, показанной в SEQ ID NO:2, последовательности, показанной в SEQ ID NO:4, последовательности, показанной в SEQ ID NO:5, обеих последовательностей, показанных в SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4, и обеих последовательностей, показанных в SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:5; d) моноклональное антитело, содержащее аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из последовательности, показанной в SEQ ID NO:1, последовательности, показанной в SEQ ID NO:3 и обеих последовательностей, показанных в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:3; е) моноклональное антитело, которое связывается с эпитопом, способным связывать моноклональное антитело, продуцированное линией клеток гибридомы 12.12; f) моноклональное антитело, которое связывается с эпитопом, включающим остатки 82-87 последовательности CD40 человека, показанной в SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:9; g) моноклональное антитело, которое связывается с эпитопом, включающим остатки 82-89 последовательности CD40 человека, показанной в SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:9; h) моноклональное антитело, конкурирующее с моноклональным антителом CHIR-12.12 при выполнении конкурентно-связывающего анализа; i) моноклональное антитело по предшествующему пункту а) или моноклональное антитело по любому из предшествующих пунктов с)-h), причем указанное антитело получают рекомбинантными методами; и j) моноклональное антитело, являющееся антигенсвязывающим фрагментом моноклонального антитела по любому из предшествующих пунктов а)-i), которое сохраняет способность специфически связываться с антигеном CD40 человека.

Способы по настоящему изобретению находят применение при лечении разных типов рака и предраковых состояний, ассоциированных с CD40-экспрессирующими клетками. Примеры указанных заболеваний включают, не ограничиваясь ими, разные типы рака В-клеточной линии дифференцировки, не-В-клеточные гематологические злокачественности, например острый миелоцитарный лейкоз, солидные опухоли, разные типы рака или предраковые состояния, ассоциированные с CD20-экспрессирующими клетками. Способы по настоящему изобретению являются особенно эффективными в отношении разных типов рака и предраковых состояний, ассоциированных с клетками, экспрессирующими как CD40, так и CD20. Таким образом, настоящее изобретение позволяет лечить пациентов, страдающих раком или находящихся в предраковом состоянии, не поддающемся лечению другими противоопухолевыми средствами, включающими антитела против CD20 для пациентов, гомозиготных или гетерозиготных в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F).

Краткое описание чертежей

На фигуре 1А-1F показаны результаты анализа антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) в шести линиях клеток.

На фигуре 2А-2D показаны результаты анализа антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) в клетках пациентов, страдающих CLL (n=8).

На фигуре 3 суммированы результаты анализа ADCC в клетках пациентов, страдающих CLL (n=9).

На фигуре 4 показаны результаты анализа ADCC в клетках пациентов, страдающих CLL, с использованием эффекторных NK-клеток, полученных у двух разных доноров.

На фигуре 5 показаны результаты количественного определения экспрессии CD40 и CD20 на клеточной поверхности в клетках пациентов, страдающих CLL, и нормальных В-клетках.

На фигуре 6 суммированы результаты активности ADCC для клеток с подвергнутой количественному определению экспрессией CD40 и CD20 на клеточной поверхности.

На фигуре 7 изображена столбчатая диаграмма, показывающая уровни связанного с клеточной поверхностью антитела CHIR-12.12 в линиях клеток Дауди и ARH77.

На фигуре 8 показаны результаты исследования интернализации антитела CHIR-12.12 и ритуксимаба в клетках пациентов, страдающих CLL, при помощи анализа методом FACS.

На фигуре 9 показаны результаты исследования интернализации антитела CHIR-12.12 и ритуксимаба в нормальных В-клетках при помощи конфокальной микроскопии меченных флуоресцином антител.

На фигуре 10 показаны результаты исследования интернализации антитела CHIR-12.12 и ритуксимаба в клетках пациентов, страдающих CLL, при помощи конфокальной микроскопии Alexa488-меченных антител.

На фигуре 11 суммированы результаты взаимосвязи между активностью ADCC и интернализацией.

На фигуре 12 изображена столбчатая диаграмма, показывающая максимальное процентное значение специфического лизиса клеток Дауди антителом CHIR-12.12 или ритуксимабом под воздействием очищенных эффекторных NK-клеток, полученных у доноров с разными генотипами FcγRIIIa.

На фигуре 13 изображена столбчатая диаграмма, показывающая активность ADCC (ED₅₀) антитела CHIR-12.12 или ритуксимаба в клетках Дауди под воздействием очищенных эффекторных NK-клеток, полученых у доноров с разными генотипами FcγRIIIa.

На фигуре 14 суммированы сравнительные данные ADCC антитела CHIR-12.12 и ритуксимаба против клеток пациентов, страдающих CLL (n=9), под воздействием NK-клеток человека, полученных у нескольких генотипированных доноров.

Подробное описание изобретения

Авторы изобретения сделали удивительное открытие, состоящее в том, что антитела против CD40, такие как CHIR-12.12, способны опосредовать сильную антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) CD40-экспрессирующих клеток-мишеней в условиях, в которых другие ADCC-опосредующие антитела являются менее эффективными или сравнительно неэффективными. В отличие от других антител, таких как ритуксимаб (Rituxan®), антитела против CD40 по настоящему изобретению могут связываться с любым из двух аллотипов (V или F) аминокислоты FcγRIIIa 158 на естественных клетках-киллерах (NK) пациента-человека с характеристиками связывания, вызывающими сильную ADCC. Данное открытие является неожиданным и представляет собой прогресс в лечении разных типов рака и предраковых состояний у широкого круга пациентов.

Антитела против CD40, такие как CHIR-12.12, могут быть использованы для лечения разных типов рака и предраковых состояний, ассоциированных с CD40-экспрессирующими клетками, у пациентов-людей, гетерозиготных или гомозиготных в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F) помимо гомозиготных субъектов в отношении FcγRIIIa-158V (генотип V/V).

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения у пациента-человека рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками, когда указанный пациент-человек является гетерозиготным или гомозиготным в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F), который включает введение указанному пациенту-человеку терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40. Настоящее изобретение относится также к применению терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40 для приготовления лекарственного средства для лечения рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками, у пациента-человека, гетерозиготного или гомозиготного в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F).

Как было отмечено выше, клиническая активность ритуксимаба при лечении NHL соответствует генотипу FcγRIIIa пациента. Пациенты с полиморфизмом F/F FcγRIIIa-158aa менее восприимчивы к ритуксимабу, чем пациенты с V/V или V/F (см., например, публикацию Cartron et al. (2002) Blood 99(3):754-758 или Dall'Ozzo et al. (2004) Cancer Res. 64:4664-4669). Поэтому настоящее изобретение особенно пригодно для лечения разных типов рака и предраковых состояний, не поддающихся лечению антителом против CD20, таким как ритуксимаб (Rituxan®).

Антитела против CD40, такие как CHIR-12.12, могут быть использованы в способах ингибирования продуцирования антител В-клетками у пациента-человека, гетерозиготного или гомозиготного в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F) помимо гомозиготных пациентов-людей в отношении FcγRIIIa-158V (генотип V/V).

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу ингибирования продуцирования антител В-клетками у пациента-человека, гетерозиготного или гомозиготного в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F), который включает введение указанному пациенту-человеку эффективного количества антитела против CD40, такого как CHIR-12.12. Настоящее изобретение относится также к применению эффективного количества антитела против CD40 для приготовления лекарственного средства для ингибирования продуцирования антител В-клетками у пациента-человека, гетерозиготного или гомозиготного в отношении FcγRIIIa-158F (V/F или F/F).

Для специалиста в данной области должна быть неожиданной возможность ингибировать продуцирование антител В-клетками у пациента-человека, гетерозиготного или гомозиготного в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F).

Настоящее изобретение позволяет применять схему лечения, выбираемую на основе генотипа FcγRIIIa-158 конкретного пациента-человека, которая включает введение ADCC-опосредующего антитела против CD40.

Настоящее изобретение относится к способу идентификации пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, подлежащем лечению антителом против CD40 и не поддающемся лечению ритуксимабом (Rituxan®), который включает:

а) идентификацию пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, ассоциированном с CD40-экспрессирующими клетками и не поддающемся лечению ритуксимабом (Rituxan®);

b) определение у указанного пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158 (V/V, V/F или F/F);

причем указанный рак или предраковое состояние подлежит лечению антителом против CD40 в том случае, если указанный пациент-человек является гетерозиготным или гомозиготным в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F). Настоящее изобретение может далее включать стадию введения пациенту-человеку, идентифицированному с помощью указанному способа, терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40.

Вышеуказанный способ идентификации пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, подлежащем лечению антителом против CD40, может быть легко выполнен специалистом в данной области при помощи соответствующего диагностического набора. Указанный набор должен содержать реагенты, необходимые для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158. Таким образом, настоящее изобретение относится также к набору для идентификации пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, подлежащем лечению антителом против CD40, который включает реагенты для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158. Соответствующие наборы более подробно рассмотрены в настоящем описании изобретения.

Настоящее изобретение относится также к способу выбора терапии антителом для лечения пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, не поддающемся лечению ритуксимабом (Rituxan®), который включает:

а) идентификацию пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, ассоциированном с CD40-экспрессирующими клетками и не поддающемся лечению ритуксимабом (Rituxan®); и

b) определение у указанного пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158 (V/V, V/F или F/F);

причем антитело против CD40 выбирают для лечения указанного рака или предракового состояния в том случае, если данный пациент-человек является гетерозиготным или гомозиготным в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F). В частности, антитело против CD40 может быть использовано вместо ритуксимаба (Rituxan®). Настоящее изобретение может далее включать стадию введения пациенту-человеку, идентифицированному с помощью указанного способа, терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40.

Вышеуказанный способ выбора терапии антителом для лечения пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, может быть легко выполнен специалистом в данной области при помощи соответствующего диагностического набора. Указанный набор должен содержать реагенты, необходимые для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158. Таким образом, настоящее изобретение относится также к набору для выбора терапии антителом для лечения пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, ассоциированном с CD40-экспрессирующими клетками, который включает реагенты для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158.

Авторы настоящего изобретения сделали также удивительное открытие, состоящее в том, что антитела против CD40, такие как CHIR-12.12, не подвергаются значительной интернализации CD40-экспрессирующими клетками после введения. Наоборот антитела против CD40, такие как CHIR-12.12, по существу равномерно распределены по поверхности CD40-экспрессирующих клеток в течение значительного периода времени после введения. В этом состоит отличие от других антител, в частности антител против CD20, таких как ритуксимаб (Rituxan®).

Продолжительность связывания CD40 на поверхности CD40-экспрессирующих клеток и равномерное распределение антитела против CD40 по поверхности CD40-экспрессирующих клеток позволяет антителам против CD40 опосредовать сильную антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) CD40-экспрессирующих клеток-мишеней благодаря связыванию с FcR, таким как FcγRIIIa, на естественных клетках-киллерах (NK).

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения у пациента-человека рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками, который включает введение указанному пациенту-человеку терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40 без значительной интернализации антитела против CD40 CD40-экспрессирующими клетками после введения.

Настоящее изобретение относится также к способу лечения у пациента-человека рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками, который включает введение указанному пациенту-человеку терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40 с достижением равномерного распределения антитела против CD40 на поверхности CD40-экспрессирующих клеток после введения.

Настоящее изобретение относится также к способу лечения у пациента-человека рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками, который включает введение указанному пациенту-человеку антитела против CD40 с достижением на поверхности CD40-экспрессирующих клеток терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40 после введения.

Указанные аспекты по настоящему изобретению предполагают введение пациенту медленно интернализирующего антитела. Термин “медленно интернализирующее антитело” означает антитело, которое остается на клеточной поверхности в течение значительного периода времени. Как известно специалисту, данное свойство отличается от свойств, считающихся благоприятными для многих терапевтических применений, которые фактически требуют интернализации комплекса антитело-рецептор для достижения эффективного лечения. В данном контексте значительный период времени обычно превышает 3 часа, предпочтительно 6 часов, более предпочтительно 12 часов, более предпочтительно 24 часа, 36 часов, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 120 часов, 144 часа, 168 часов или более.

Предпочтительно по крайней мере 5%, по крайней мере 10%, по крайней мере 20%, по крайней мере 30%, по крайней мере 40%, по крайней мере 50%, по крайней мере 60%, по крайней мере 70%, по крайней мере 80%, по крайней мере 90% или более процентов антитела, первоначально находящегося на поверхности CD40-экспрессирующей клетки, остается на поверхности данной клетки по истечении вышеуказанного значительного периода времени.

Интернализацию антител можно определить при помощи разных анализов. Например, для оценки влияния связывания антитела-кандидата на интернализацию можно использовать такие линии клеток как линия клеток лимфомы Дауди или линия клеток ММ ARH77. Клетки инкубируют с IgG1 человека (контрольное антитело) или антителом-кандидатом на льду (с 0,1% азида натрия для блокирования интернализации) или при 37°С (без азида натрия) в течение периода времени, равного примерно 3 часам. Затем клетки промывают холодным буфером для окрашивания (например, PBS + 1% BSA + 0,1% азида натрия) и окрашивают, например, антителом козы против IgG человека, меченным флуоресцином (FITC), в течение 30 минут на льду. Затем можно определить степень окрашивания; в данном примере может быть зарегистрировано геометрическое среднее интенсивности флуоресценции (MFI) при помощи клеточного сортера с возбуждением флуоресценции Calibur. Специалистам в данной области должны быть известны другие приемлемые анализы (см., например,

http://www.abgenix.com/documents/SBS2003%20poster.pdf).

В экспериментах, описанных в примерах 4 и 5 настоящего описания изобретения, не было обнаружено разницы в MFI между клетками, инкубированными с антителом СН-12.12 на льду в присутствии азида натрия или при 37°С без азида натрия (см. фигуры 7-10). Приведенные данные показывают, что антитело СН-12.12 при связывании с CD40 не интернализируется и продолжает оставаться на клеточной поверхности в течение более продолжительного времени, чем ритуксимаб.

Ниже приведен краткий обзор стандартных методов и процедур, которые могут быть использованы при осуществлении настоящего изобретения. Очевидно, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными описанными методами, процедурами, линиями клеток, векторами и реагентами. Кроме того, очевидно, что терминология, использованная в настоящем описании изобретения, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не ограничивает объем настоящего изобретения. Объем изобретения ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

В настоящем описании изобретения использованы стандартные аббревиатуры для нуклеотидов и аминокислот.

При осуществлении настоящего изобретения за исключением особо оговоренных случаев могут быть использованы стандартные методы молекулярной биологии, микробиологии, методы рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые должны быть известны специалистам в данной области.

Такие методы всесторонне описаны в научной литературе. Для ознакомления с указанными методами можно обратиться к нижеследующим наиболее приемлемым публикациям: Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning; A Laboratory Manual (2d ed.); D.N. Glover, ed. (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; M.J. Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; B.D. Hames and S.J. Higgins, eds. (1984) Transcription and Translation; R.I. Freshney, ed. (1986) Animal Cell Culture; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especially vol. 154 & 155; J.H. Miller and M.P. Calos, eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (cold Spring Harbor Laboratory); Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes (1987) Protein Purification: Principles and Practice (2d ed.; Springer Verlag, N.Y.); and D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds. (1986) Handbook of Experimental Immunology, volumes I-IV.

Способы по настоящему изобретению предполагают использование антител против CD40 при лечении разных типов рака и предраковых состояний, ассоциированных с CD40-экспрессирующими клетками.

Термин “CD40”, “антиген CD40” или “рецептор CD40” означает трансмембранный гликопротеин длиной 50-55 кДа рецепторов семейства факторов некроза опухолей (TNF) (см., например, патенты США № 5674492 и 4708871; Stamenkovic et al. (1989) EMBO 8:1403; Clark (1990) Tissue Antigens 36:33; Barclay et al. (1997) The Leucocyte Antigen Facts Book (2d ed.; Academic Press, San Diego)). Идентифицированы две изоформы CD40 человека, кодированные альтернативно сплайсированными вариантами транскрипта данного гена. Первая изоформа (известная также как “длинная изоформа” или “изоформа 1”) экспрессирована полипептидом-предшественником, состоящим из 277 аминокислот (SEQ ID NO:9; впервые представлена под № доступа САА43045 в банке генов GenBank и идентифицирована как изоформа 1 под № доступа NP_001241 в банке генов GenBank), кодированным SEQ ID NO:8 (см. № доступа Х60592 и NM_001250 в банке генов GenBank), которая содержит сигнальную последовательность, представленную первыми 19 остатками. Вторая изоформа (известная также как “короткая изоформа” или “изоформа 2”) экспрессирована полипептидом-предшественником, состоящим из 203 аминокислот (SEQ ID NO:7; № доступа NP_690593 в банке генов GenBank), кодированным SEQ ID NO:6 (№ доступа NM_152854 в банке генов GenBank), которая также содержит сигнальную последовательность, представленную первыми 19 остатками. У полипептидов-предшественников двух указанных изоформ CD40 человека первые 165 остатков являются общими (то есть остатки 1-165 SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:9). Полипептид-предшественник короткой изоформы (показанной в SEQ ID NO:7) кодирован вариантом транскрипта (SEQ ID NO:6), в котором отсутствует кодирующий сегмент, вызывающий сдвиг рамки считывания; полученная изоформа CD40 содержит более короткий С-конец (остатки 166-203 SEQ ID NO:7), отличающийся от С-конца длинной изоформы CD40 (С-конец, соответствующий остаткам 166-277 SEQ ID NO:9). В соответствии с целями настоящего изобретения в определение термина “CD40” или “антиген CD40”, “антиген клеточной поверхности CD40” или “рецептор CD40” входят как короткая, так и длинная изоформы CD40. Антиген CD40 может быть полностью или частично гликозилирован.

Как указано в настоящем описании изобретения, CD40 обнаружен на поверхности как нормальных, так и раковых В-клеток человека, дендритных клеток, моноцитов, макрофагов, CD8⁺ Т-клеток, эндотелиальных клеток, моноцитов и эпителиальных клеток и многих солидных опухолей, включающих рак легкого, молочной железы, яичника, мочевого пузыря и ободочной кишки. Раковые В-клетки из опухолей В-клеточной линии дифференцировки экспрессируют CD40, и выживание и пролиферация указанных клеток, по-видимому, зависит от передачи сигналов CD40. Трансформированные клетки, полученные у пациентов, страдающих низко- и высокодифференцированной В-клеточной лимфомой, В-клеточным острым лимфолейкозом, множественной миеломой, хроническим лимфолейкозом, макроглобулинемией Вальденстрема и болезнью Ходжкина, экспрессируют CD40. Экспрессия CD40 обнаружена также в случае острого миелобластного лейкоза и в 50% случаев СПИД-ассоциированных лимфом. Некоторые карциномы и саркомы также характеризуются высокими уровнями экспрессии CD40, хотя роль передачи сигналов CD40 для экспрессии CD40 на указанных раковых клетках менее изучена. CD40-экспрессирующие карциномы включают рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак почки, недифференцированный рак носоглотки (UNPC), плоскоклеточный рак (SCC), папиллярные карциномы щитовидной железы, кожную злокачественную меланому, рак желудка и рак печени.

Термин “CD40-экспрессирующие клетки” означает любые нормальные или раковые клетки, экспрессирующие антиген CD40 на детектируемых уровнях. CD40-экспрессирующие клетки предпочтительно являются клетками, экспрессирующими на детектируемых уровнях антиген CD40 клеточной поверхности. Методы обнаружения экспрессии CD40 в клетках хорошо известны в данной области и включают, не ограничиваясь ими, методы ПЦР, иммуногистохимию, проточную цитометрию, вестерн-блоттинг, ELISA и тому подобные. Указанные методы позволяют обнаружить мРНК CD40, антиген CD40 и антиген CD40 клеточной поверхности. Экспрессию CD40 клеточной поверхности можно обнаружить в соответствии с описанием, приведенным в примере 3 настоящего описания изобретения, или другими приемлемыми методами.

Раковая клетка может быть раковой В-клеткой. Термин “раковая В-клетка” означает любую опухолевую В-клетку, которая включает, не ограничиваясь ими, В-клетки, выделенные из таких лимфом, как низко-, средне- и высокодифференцированные В-клеточные лимфомы, иммунобластные лимфомы, неходжкинские лимфомы, болезнь Ходжкина, лимфомы, вызванные вирусом Эпштейна-Барра (EBV), и СПИД-ассоциированные лимфомы, а также В-клеточные острые лимфобластные лейкозы, миеломы, хронические лимфоцитарные лейкозы и тому подобные.

Термин “лиганд CD40” или “CD40L” означает главным образом трансмембранный белок длиной 32-33 кДа, который также существует в двух биологически активных растворимых формах меньшей длины, соответственно равной 18 кДа и 31 кДа (Graf et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25:1749-1754; Mazzei et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:7025-7028; Pietravalle et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 5965-5967). CD40L человека известен также как CD154 или gp39. Термин “лиганд CD40” или “CD40L” означает также любой другой пептид, полипептид или белок, который может связываться с CD40 и активировать один или несколько сигнальных путей CD40. Таким образом “лиганды CD40” включают, не ограничиваясь ими, непроцессированные белки лиганда CD40, их варианты и фрагменты, обладающие достаточной активностью для связывания и стимуляции передачи сигналов CD40 в CD40-экспрессирующих клетках. Модификации нативного лиганда CD40, например, CD40L человека, включают, не ограничиваясь ими, замены, делеции, усечения, удлинения, слитые белки, фрагменты, миметики пептидов и тому подобные.

Термин “передача сигналов CD40” означает любую биологическую активность, возникающую в результате взаимодействия CD40 клеточной поверхности с лигандом CD40 или другим агонистом, таким как агонистическое антитело. Примерами передачи сигналов CD40 являются сигналы, которые вызывают пролиферацию и выживание CD40-экспрессирующих клеток и стимулируют один или несколько сигнальных путей CD40 в CD40-экспрессирующих клетках. Термин “сигнальный путь” CD40 или “путь трансдукции сигналов” означает по крайней мере одну биохимическую реакцию или группу биохимических реакций, происходящих при взаимодействии рецептора CD40 с лигандом CD40, например CD40L, в результате чего возникает сигнал, который, будучи переданным по сигнальному пути, активирует одну или несколько молекул, находящихся внизу сигнального пути. Пути трансдукции сигналов включают целый ряд молекул трансдукции сигналов, обеспечивающих передачу сигнала от рецептора CD40 клеточной поверхности через плазматическую мембрану клетки, одну или несколько последовательных молекул трансдукции сигналов, цитоплазму клетки и в некоторых случаях в ядро клетки. В соответствии с целями настоящего изобретения особый интерес представляют пути трансдукции сигналов CD40, включающие сигнальный путь АКТ, который активирует АКТ и в конечном счете активирует NF-κВ по сигнальному пути NF-κВ; и сигнальные пути митоген-активируемой протеинкиназы (МАРК), включающие сигнальный путь МЕК/ERK и сигнальный путь МЕК/p38, которые активируют соответственно ERK и р38.

Как было отмечено выше, настоящее изобретение относится к способу лечения у пациента-человека рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками, причем указанный пациент-человек является гетерозиготным или гомозиготным в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F), который включает введение указанному субъекту терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40.

Термин “ пациент-человек” означает пациента-человека, страдающего или подвергаемого риску возникновения или рецидива любого рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками.

Термин “рак или предраковое состояние, ассоциированное с CD40-экспрессирующими клетками” означает любой рак В-клеточной линии дифференцироваки, не-В-клеточные гематологические злокачественности и солидные опухоли, которые, как известно, ассоциированы с CD40-экспрессирующими клетками.

Способы по настоящему изобретению пригодны для терапевтического лечения разных типов рака В-клеточной линии дифференцировки. Разные типы рака В-клеточной линии дифференцировки, ассоциированные с CD40-экспрессирующими клетками, включают, не ограничиваясь ими, острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфолейкоз (CLL), пролимфоцитарный лейкоз (PLL), лейкоз малых лимфоцитов (SLL), волосатоклеточный лейкоз, болезнь Ходжкина, множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей и лимфомы, включающие, не ограничиваясь ими, генерализованную В-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, DLBCL, лимфому лимфоидной ткани слизистой оболочки, моноцитоидную В-клеточную лимфому, лимфому селезенки, лимфоматоидный гранулематоз, внутрисосудистый лимфоматоз, иммунобластную лимфому, СПИД-ассоциированную лимфому и тому подобные.

Таким образом, способы по настоящему изобретению могут найти применение при лечении субъектов, страдающих неходжкинской лимфомой, характеризующейся аномальной, неконтролируемой пролиферацией или аккумуляцией В-клеток. В соответствии с целями настоящего изобретения такие лимфомы определяются согласно схеме классификации, принятой в публикации Working Formulation, то есть указанные В-клеточные лимфомы классифицируются как низкодифференцированная, среднедифференцированная и высокодифференцированная лимфомы (см. публикацию “The Non-Hodgkin's Lymphoma Pathologic Classification Project”, Cancer 49 (1982): 2112-2135). Так, низкодифференцированные В-клеточные лимфомы включают мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, фолликулярную мелкоклеточную лимфому с рассеченными ядрами и фолликулярную смешанную мелкоклеточную лимфому с рассеченными ядрами и крупноклеточную лимфому; среднедифференцированные лимфомы включают фолликулярную крупноклеточную лимфому, генерализованную мелкоклеточную лимфому с рассеченными ядрами, генерализованную смешанную мелкоклеточную и крупноклеточную лимфому и генерализованную крупноклеточную лимфому; и высокодифференцированные лимфомы включают крупноклеточную иммунобластную лимфому, лимфобластную лимфому и мелкоклеточную лимфому с нерассеченными ядрами, относящуюся к типу Беркита и не относящуюся к типу Беркита.

Способы по настоящему изобретению пригодны для терапевтического лечения В-клеточных лимфом, классифицированных в соответствии с пересмотренной европейской и американской системой классификации лимфом (REAL). Такие В-клеточные лимфомы включают, не ограничиваясь ими, лимфомы, классифицированные как В-клеточные опухоли-предшественники, такие как В-клеточный лимфобластный лейкоз/лимфома, периферические В-клеточные опухоли, включающие В-клеточный хронический лимфолейкоз/мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, лимфоплазмацитоидную лимфому/иммуноцитому, лимфому клеток коры головного мозга (MCL), лимфому центральной части фолликул (фолликулярную) (включающую генерализованную мелкоклеточную лимфому, генерализованную смешанную мелкоклеточную и крупноклеточную лимфому и генерализованную крупноклеточную лимфому), В-клеточную лимфому маргинальной зоны (включающую экстранодальную лимфому, нодальную лимфому и лимфому селезенки), плазмоцитому/миелому, генерализованную крупноклеточную В-клеточную лимфому, относящуюся к подтипу первичной медиастинальной лимфомы (тимуса), лимфому Беркита и высокодифференцированную В-клеточную лимфому Беркита; и неклассифицируемые низкодифференцированные или высокодифференцированные В-клеточные лимфомы.

Способы по настоящему изобретению пригодны для терапевтического лечения предракового состояния, известного как MGUS (моноклональная гаммапатия неустановленной природы). Примерно у 25% пациентов с диагнозом MGUS в конечном счете развивается множественная миелома (ММ) или родственная плазмаклеточная миелома (Kyle (1993) Mayo Clinic. Proc. 68:26-36). Клиническими проявлениями множественной миеломы являются пролиферация раковых плазмацитов в костном мозге, обнаружение моноклонального белка в сыворотке или моче (М-белок), анемия, гиперкальциемия, почечная недостаточность и литические поражения костей, в то время как MGUS диагностируют в клинических условиях по наличию М-белка в сыворотке или моче без других клинических проявлений множественной миеломы (см., например, публикации Kyle and Lust (1989), Semin. Hematol. 26: 176-200; Greipp and Lust, Stem Cells (1995) 13:10-21). Пациенты с диагнозом MGUS не имеют выраженных симптомов и характеризуются устойчивыми уровнями М-белка (Kyle (1993) Mayo Clinic. Proc. 68: 26-36). После обнаружения у субъекта MGUS поддерживающая терапия соответствующим антителом против CD40, например, антагонистическим антителом против CD40, может блокировать развитие множественной миеломы у указанных пациентов.

Способы по настоящему изобретению пригодны также для терапевтического лечения не-В-клеточных гематологических злокачественностей, ассоциированных с CD40-экспрессирующими клетками, таких как острый миелоцитарный лейкоз и тому подобные.

Способы по настоящему изобретению пригодны также для терапевтического лечения солидных опухолей. Солидные опухоли, ассоциированные с CD40-экспрессирующими клетками, включают, не ограничиваясь ими, рак яичника, легкого (например, немелкоклеточный рак легкого, плоскоклеточный рак, аденокарциному, крупноклеточный рак и мелкоклеточный рак легкого), рак молочной железы, ободочной кишки, почки (включающий, например, почечно-клеточный рак), рак мочевого пузыря, печени (включающий, например, печеночно-клеточные карциномы), рак желудка, шейки матки, предстательной железы, носоглотки, щитовидной железы (например, папиллярные карциномы щитовидной железы), разные типы рака кожи, такие как меланома, и саркомы, включающие, например, остеосаркому и саркому Юинга.

Рак или предраковое состояние, ассоциированное с CD40-экспрессирующими клетками, может представлять собой рак или предраковое состояние, ассоциированное с нежелательным уровнем передачи сигналов CD40 в CD40-экспрессирующих клетках, либо указанный рак или предраковое состояние может быть лишь косвенно ассоциирован с CD40-экспрессирующими клетками. Термин “рак или предраковое состояние, ассоциированное с нежелательным уровнем передачи сигналов CD40” означает рак или предраковое состояние, развитие которого ассоциировано с нежелательным уровнем передачи сигналов CD40.

Термин “нежелательный уровень передачи сигналов CD40” означает любой физиологически нежелательный уровень передачи сигналов CD40, который может иметь место в CD40-экспрессирующих клетках пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии.

Рак или предраковое состояние может представлять собой рак или предраковое состояние, ассоциированное с CD20-экспрессирующими клетками. Такие типы рака или предраковых состояний включают, не ограничиваясь ими, В-клеточные лейкозы, представленные в настоящем описании изобретения.

Настоящее изобретение является особенно эффективным в отношении разных типов рака и предраковых состояний, ассоциированных с клетками, экспрессирующими как CD40, так и CD20, так как новые применения антител против CD40, таких как CHIR-12.12, описанных в настоящем описании изобретения, позволяют решать проблемы, связанные с использованием антител против CD20, таких как Rituxan®. Настоящее изобретение, в частности, позволяет лечить рак или предраковое состояние, не поддающееся лечению другими противораковыми средствами, включая антитела против CD20, такие как Rituxan®, у пациентов, которые являются гомозиготными или гетерозиготными в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F), как более подробно описано в настоящем описании изобретения.

При осуществлении терапевтических способов по настоящему изобретению, по крайней мере, одно антитело против CD40, описанное в настоящем описании изобретения, используют для стимуляции положительной терапевтической реакции в отношении рака или предракового состояния.

Термин “положительная терапевтическая реакция” применительно к раку или предраковому состоянию означает улучшение в развитии рака или предракового состояния, обусловленное терапевтической активностью антитела против CD40, и/или ослабление симптомов, связанных с раком или предраковым состоянием. То есть может наблюдаться антипролиферативное действие, предотвращение дальнейшего разрастания опухоли, уменьшение размера опухоли, сокращение числа раковых клеток и/или ослабление одного или нескольких симптомов, связанных с CD40-экспрессирующими клетками. Так, например, положительная терапевтическая реакция должна выражаться в одном или нескольких нижеследующих улучшениях в развитии болезни: (1) уменьшение размера опухоли; (2) сокращение числа раковых (то есть опухолевых) клеток; (3) увеличение гибели опухолевых клеток; (4) ингибирование выживания опухолевых клеток; (4) торможение (то есть некоторое замедление, предпочтительно прекращение) роста опухоли; (5) ингибирование (то есть некоторое замедление, предпочтительно прекращение) инфильтрации раковых клеток в периферические органы; (6) ингибирование (то есть некоторое замедление, предпочтительно прекращение) метастазирования опухоли; (7) предотвращение дальнейшего разрастания опухоли; (8) увеличение коэффициента выживаемости пациентов и (9) некоторое облегчение одного или нескольких симптомов, обусловленных раком.

Положительная терапевтическая реакция любого указанного злокачественного заболевания может быть определена на основании стандартизированных критериев реакции, специфичных для данного злокачественного заболевания. Реакцию опухоли можно определить по изменениям морфологии опухоли (то есть общая опухолевая масса, размер опухоли и тому подобные) при помощи таких методов исследования как ядерно-магнитно-резонансная (ЯМР) томография, рентгенологическое исследование, компьютерная томография (СТ), томография костей, эндоскопия и биопсия опухоли, включающая аспирацию костного мозга (ВМА) и подсчет раковых клеток в кровотоке. Помимо вышеуказанных положительных терапевтических реакций субъект, подвергаемый лечению лекарственным средством против CD40, может испытывать благоприятный эффект, выражающийся в ослаблении симптомов, связанных с данным заболеванием. Так, в случае В-клеточных опухолей субъект может испытывать ослабление так называемых В-клеточных симптомов, таких как ночная потливость, лихорадка, потеря массы тела и/или крапивница. В случае предракового состояния терапия лекарственным средством против CD40 может блокировать развитие болезни и/или продлевать время до развития родственного злокачественного заболевания, например, время до развития множественной миеломы у субъектов, страдающих моноклональной гаммапатией неустановленной природы (MGUS).

Улучшение в развитии заболевания может быть охарактеризовано как полная реакция. Термин “полная реакция” означает отсутствие клинически детектируемого заболевания с нормализацией ранее аномальных результатов радиографического исследования, костного мозга, цереброспинальной жидкости (CSF) или аномального моноклонального белка в случае миеломы. Такая реакция должна сохраняться в течение по крайней 4-8 недель и в случае специфического заболевания иногда в течение 6-8 недель после лечения в соответствии со способами по настоящему изобретению. Альтернативно, улучшение в развитии заболевания можно классифицировать как частичную реакцию. Термин “частичная реакция” означает, по крайней мере, примерно 50% уменьшение всей измеряемой опухолевой массы (то есть число раковых клеток, присутствующих в организме субъекта, измеренная опухолевая масса или количество аномального моноклонального белка) при отсутствии новых поражений, сохраняющееся в течение 4-8 недель. В случае миеломы нормальная реакция (25-50% уменьшение белка миеломы в моче) также считается реакцией. Такая реакция применима только к измеряемым опухолям.

Термин “терапевтически или профилактически эффективная доза” или “терапевтически или профилактически эффективное количество” означает количество антитела против CD40, которое при введении нуждающемуся пациенту вызывает положительную терапевтическую реакцию при лечении у пациента рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками. Приемлемые дозы более подробно описаны в настоящем описании изобретения. Способ лечения может включать однократное или многократное введение терапевтически эффективной дозы антитела против CD40 в соответствии с более подробным описанием, приведенным в настоящем описании изобретения.

Термин “опухоль” в используемом здесь значении означает рост и пролиферацию всех опухолевых клеток независимо от того, являются ли они злокачественными или доброкачественными, и все предраковые и раковые клетки и ткани. Термин “опухолевый” в используемом здесь значении означает любую форму плохо регулируемого или нерегулируемого роста злокачественных или доброкачественных клеток, в результате чего происходит аномальный рост ткани. Таким образом, термин “опухолевые клетки” означает злокачественные и доброкачественные клетки, характеризующиеся плохо регулируемым или нерегулируемым ростом.

Термины “рак” и “раковый” означают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака включают, не ограничиваясь ими, лимфому, лейкоз и солидные опухоли. Термин “В-клеточный рак” или “рак В-клеточной линии дифференцировки” означает рак любого типа, в котором плохо регулируемый или нерегулируемый рост клеток ассоциирован с В-клетками.

Термин “лечение” в используемом здесь значении означает применение или введение пациенту антитела против CD40 либо применение или введение антитела против CD40 в ткань или линию клеток, выделенную у пациента, у которого обнаружено заболевание, симптом заболевания или предрасположенность к заболеванию, с целью лечения, облегчения, ослабления, изменения, излечивания, уменьшения интенсивности, улучшения динамики заболевания и воздействия на симптомы заболевания или предрасположенность к заболеванию. Термин “лечение” означает также применение или введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей антитело против CD40, либо применение или введение фармацевтической композиции, содержащей антитело против CD40, в ткань или линию клеток, выделенную у пациента, у которого обнаружено заболевание, симптом заболевания или предрасположенность к заболеванию, с целью лечения, облегчения, ослабления, изменения, излечивания, уменьшения интенсивности, улучшения динамики заболевания и воздействия на симптомы заболевания или предрасположенность к заболеванию.

Термин “противоопухолевая активность” означает уменьшение степени пролиферации или накопления раковых CD40-экспрессирующих клеток и, следовательно, ослабление скорости роста существующей опухоли или опухоли, возникающей во время лечения, и/или разрушение имеющихся опухолевых клеток или вновь образовавшихся опухолевых клеток и сокращение общего размера опухоли во время лечения. Лечение по крайней мере одним антителом против CD40 вызывает физиологическую реакцию, которая является благоприятной в отношении лечения заболеваний, ассоциированных со стимуляцией передачи сигналов CD40 в CD40-экспрессирующих клетках человека.

Способы по настоящему изобретению особенно пригодны для лечения разных типов рака и предраковых состояний, включающих перечисленные выше заболевания, которые не поддаются первичному онкотерапевтическому лечению. Термин “онкотерапевтический” означает любое лечение рака, такое как хроматография, хирургическое вмешательство, терапию противораковыми антителами и комбинации указанных методов. Примеры онкотерапевтического лечения более подробно рассмотрены в настоящем описании изобретения. Термин “не поддающийся лечению” служит для определения определенного рака, устойчивого или невосприимчивого к лечению определенным противораковым средством. Рак может быть невосприимчив к лечению определенным лекарственным средством, полученным после начала лечения определенным лекарственным средством (то есть невосприимчив к первоначальному воздействию лекарственного средства), в результате развития устойчивости к лекарственному средству на протяжении первого периода лечения указанным лекарственным средством или во время последующего лечения лекарственным средством. Таким образом, настоящее изобретение пригодно для лечения пациента-человека, не поддающегося лечению противораковым средством, когда указанный пациент-человек устойчив к терапии или невосприимчив к терапии противораковым средством.

Способы по настоящему изобретению включают применение антител против CD40. “Антитела” обычно являются гетеротетрамерными гликопротеинами длиной около 150000 Да, состоящими из двух одинаковых легких (L) цепей и двух одинаковыми тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь присоединена к тяжелой цепи одной ковалентной дисульфидной связью, при этом число дисульфидных связей может быть различным для тяжелых цепей разных изотипов иммуноглобулина. Каждая тяжелая и легкая цепь также равномерно разделены внутрицепными дисульфидными мостиками. У одного конца каждой тяжелой цепи расположена вариабельная область (V_H), за которой следуют несколько константных областей. У одного конца каждой легкой цепи расположена вариабельная область (V_L), и у другого конца расположена константная область; константная область легкой цепи совмещена с первой константной областью тяжелой цепи, и вариабельная область легкой цепи совмещена с вариабельной областью тяжелой цепи. Считается, что конкретные аминокислотные остатки образуют границу между вариабельными областями легкой и тяжелой цепей. Термин “вариабельный” означает, что некоторые части вариабельных областей антител имеют сильно отличающиеся последовательности. Вариабельные области сообщают специфичность связывания антигена. Константные области непосредственно не участвуют в связывании антитела с антигеном, но выполняют разные эффекторные функции, такие как связывание Fc-рецептора (FcR), участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности, инициирование комплементзависимой цитотоксичности и дегрануляция мастоцитов.

“Легкие цепи” антител (иммуноглобулинов) позвоночного любого вида могут быть отнесены к одному из двух отличающихся типов, именуемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотных последовательностей константных областей.

В зависимости от аминокислотной последовательности константной области “тяжелых цепей” иммуноглобулины могут быть отнесены к разным классам. Существуют пять основных классов иммуноглобулинов человека: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из указанных иммуноглобулинов могут быть далее разделены на подклассы (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные области тяжелой цепи, соответствующие разным классам иммуноглобулинов, именуются соответственно альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации иммуноглобулинов разных классов хорошо известны. Разные изотипы выполняют разные эффекторные функции. Например, изотипы IgG1 и IgG3 человека обладают активностью ADCC (антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью). Антитела IgG1, в частности антитела IgG1 человека, особенно пригодны для использования в способах по настоящему изобретению.

“Эффекторные клетки человека” являются лейкоцитами, которые экспрессируют один или несколько FcR и выполняют эффекторные функции. Указанные клетки предпочтительно экспрессируют, по крайней мере, FcγRIII и выполняют эффекторную функцию антигензависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Примеры лейкоцитов человека, опосредующих ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), естественные клетки-киллеры (NK), моноциты, макрофаги, эозинофилы и нейтрофилы, при этом предпочтительными клетками являются РВМС и NK-клетки. Антитела, обладающие активностью ADCC, обычно относятся к изотипу IgG1 или IgG3. Следует отметить, что помимо выделения антител IgG1 и IgG3 такие ADCC-опоредующие антитела могут быть получены путем создания вариабельной области из антитела, не обладающего активностью ADCC, или фрагмента вариабельной области к константной области изотипа IgG1 или IgG3.

Термины “Fc-рецептор” или “FcR” служат для определения рецептора, связывающегося с Fc-областью антитела. Предпочтительным FcR является FcR с нативной последовательностью человека. Кроме того, предпочтительным FcR является рецептор, который связывает антитело IgG (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, в том числе аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы указанных рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA (“активирующий рецептор”) и FcγRIIB (“ингибирующий рецептор”), которые имеют одинаковые аминокислотные последовательности, отличающиеся главным образом цитоплазматическими областями. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит активирующий фрагмент на основе тирозина иммунорецептора (ITAM) в цитоплазматической области. Ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит ингибирующий фрагмент на основе тирозина иммунорецептора (ITIM) в цитоплазматической области (см. публикацию Daeron (1997) Annu. Rev. Immunol. 15:203-234). Fc-Рецепторы описаны в публикациях Ravetch and Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel et al. (1994) Immunomethods 4:25-34; и de Haas et al. (1995) J. Lab. Clin. Med. 126:330-341. В определение термина “FcR” входят также другие Fc-рецепторы, в том числе рецепторы, которые могут быть идентифицированы в будущем. Указанный термин означает также неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG плоду (Guyer et al. (1976) J. Immunol. 117:587 и Kim et al. (1994) J. Immunol. 24: 249 (1994)).

Термин “антитело” использован в настоящем описании изобретения в самом широком смысле и включает полностью собранные антитела, фрагменты антител, сохраняющие способность специфически связываться с антигеном CD40 (например, Fab, F(ab')₂, Fv и другие фрагменты), одноцепочечные антитела, диантитела, химеры антител, гибридные антитела, биспецифические антитела, гуманизированные антитела и тому подобные), и рекомбинантные пептиды, содержащие вышеуказанные фрагменты. Термин “антитело” означает как поликлональные, так и моноклональные антитела.

В используемом здесь значении термин “антитело против CD40” означает любое антитело, которое специфически распознает антиген CD40. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела против CD40, предназначенные для использования в способах по настоящему изобретению, в частности моноклональные антитела против CD40 обладают сильным сродством связывания на одном сайте к антигену CD40. Такие моноклональные антитела обладают сродством к CD40 (K_D), равным по крайней мере 10^-5 М, по крайней мере 3 × 10^-5 М, предпочтительно по крайней мере 10^-6 М или по крайней мере 10^-7 М, более предпочтительно по крайней мере 10^-8 М или по крайней мере 10^-12 М при измерении с помощью стандартного анализа, такого как Biacore^TM. Анализ Biacore известен в данной области и подробно описан в публикации “BIAapplications handbook”. Способы, описанные в WO 01/27160, могут быть использованы для модуляции сродства связывания.

Термин “специфически распознает” или “специфически связывается” означает, что антитело против CD40 не связывается с неродственными антигенами, такими как антиген CD20.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела против CD40, предназначенные для использования в способах по настоящему изобретению, в частности моноклональные антитела, обладают сильным сродством связывания к FcγRIIIa-158V человека. Антитело против CD40, предназначенное для использования в способах по настоящему изобретению, предпочтительно связывается с FcγRIIIa-158V человека со сродством (K_D), равным по крайней мере примерно 0,5 мкМ, при измерении с помощью стандартного анализа, такого как Biacore^TM. Как показано в примере 6, антитело CHIR-12.12 связывается с FcγRIIIa-158V человека со сродством (K_D), равным 492 нМ.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела против CD40, предназначенные для использования в способах по настоящему изобретению, в частности моноклональные антитела, обладают сильным сродством связывания к FcγRIIIa-158F человека. Антитело против CD40, предназначенное для использования в способах по настоящему изобретению, связывается с FcγRIIIa-158F человека со сродством (K_D), равным по крайней мере примерно 12 мкМ, при измерении с помощью стандартного анализа, такого как Biacore^TM. Антитело против CD40, предназначенное для использования в способах по настоящему изобретению, предпочтительно связывается с FcγRIIIa-158F человека со сродством (K_D), равным по крайней мере примерно 10 мкМ, по крайней мере примерно 8 мкМ, по крайней мере примерно 6 мкМ, по крайней мере примерно 5 мкМ, по крайней мере примерно 4 мкМ или по крайней мере примерно 3 мкМ. Как показано в примере 6, антитело CHIR-12.12 связывается с FcγRIIIa-158F человека со сродством (K_D), равным 2,8 мкМ.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела против CD40, предназначенные для использования в способах по настоящему изобретению, в частности моноклональные антитела, обладают сильным сродством связывания к FcγRIIIa-158V и FcγRIIIa-158F человека. Антитело против CD40, предназначенное для использования в способах по настоящему изобретению, предпочтительно связывается с FcγRIIIa-158V человека со сродством (K_D), равным по крайней мере примерно 0,5 мкМ, и связывается с FcγRIIIa-158F человека со сродством (K_D), равным по крайней мере примерно 12 мкМ, при измерении с помощью стандартного анализа, такого как Biacore^TM.

Антитела, предназначенные для использования в способах по настоящему изобретению, могут быть получены любым приемлемым методом продуцирования антител, известным специалистам в данной области.

Антитело против CD40, используемое в способах по настоящему изобретению, может быть поликлональным антителом. Поликлональная сыворотка может быть получена стандартными методами. Как правило, раствор, содержащий представляющий интерес антиген (в данном случае антиген CD40), сначала используют для иммунизации соответствующего животного, предпочтительно мыши, крысы, кролика или козы. Кролики или козы являются предпочтительными животными для получения поликлональной сыворотки благодаря объему получаемой сыворотки и наличию меченых антител против кролика и козы.

Сыворотка, полученная у иммунизированных животных, может быть исследована в отношении реактивности антител против первичного антигена. Лимфоциты могут быть выделены из лимфатических узлов или клеток селезенки и могут быть далее исследованы в отношении В-клеток путем отбора CD138-отрицательных и CD19-положительных клеток. В соответствии с одним аспектом изобретения такие культуры В-клеток (ВСС) могут быть гибридизированы с миеломными клетками для получения гибридом, подробно рассмотренных в настоящем описании изобретения.

Поликлональная сыворотка может быть также получена у трансгенного животного, предпочтительно мыши, несущей локусы иммуноглобулина человека. В предпочтительном варианте осуществления изобретения в качестве иммуногена использованы клетки Sf9, экспрессирующие представляющий интерес белок (в данном случае антиген CD40). Иммунизацию можно также выполнить путем смешивания или эмульгирования антигенсодержащего раствора в физиологическом растворе, предпочтительно в адъюванте, таком как полный адъювант Фрейнда, и парентерального введения полученной смеси или эмульсии (обычно подкожно или внутримышечно). Доза, равная 50-200 мкг/инъекцию, обычно является достаточной. Иммунизацию обычно повторяют через 2-6 недель в виде одной или нескольких инъекций белка в физиологическом растворе, предпочтительно используя неполный адъювант Фрейнда. Антитела альтернативно могут быть получены путем иммунизации in vitro методами, известными в данной области, которые в соответствии с целями настоящего изобретения считаются эквивалентыми иммунизации in vivo. Поликлональную антисыворотку получают, собирая кровь иммунизированного животного в стакан или пластиковый контейнер и инкубируя собранную кровь при 25°С в течение одного часа с последующей инкубацией при 4°С в течение 2-18 часов. Сыворотку выделяют центрифугированием (например, с ускорением 1000 × g в течение 10 минут). У кроликов можно получить примерно 20-50 мл при одном отборе крови.

Получение клеток Sf9 (Spodoptera frugiperda) описано в патенте США № 6004552, включенном в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. В случае CD40 последовательности, кодирующие CD40 человека, рекомбинировали с бакуловирусом, используя векторы переноса. Плазмиды котрансфецировали с ДНК бакуловируса дикого типа в клетки Sf9. Рекомбинантные клетки Sf9, инфицированные бакуловирусом, идентифицировали и очищали клонированием.

Антитело против CD40, используемое в способах по настоящему изобретению, может быть моноклональным антителом. Термин “моноклональное антитело” (и “mAb”) в используемом здесь значении означает антитело, полученное по существу из гомогенной популяции антител, то есть отдельные антитела, образующие популяцию, являются идентичными за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Данный термин не ограничен определенным видом антитела и не требует продуцирования антитела каким-либо конкретным методом.

В отличие от препаратов на основе поликлональных антител, которые обычно включают разные антитела против разных антигенных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело действует против одной детерминанты (эпитопа) антигена.

Термин “эпитоп” означает часть молекулы антигена, в отношении которой продуцировано антитело и с которой связывается данное антитело. Эпитопы могут содержать линейные аминокислотные остатки (то есть остатки в эпитопе расположены последовательно друг за другом в виде линейной цепи), нелинейные аминокислотные остатки (определяемые в настоящем описании изобретения как “нелинейные эпитопы”; указанные эпитопы расположены непоследовательно) или как линейные, так и нелинейные аминокислотные остатки. Моноклональное антитело против CD40, пригодное для использования в способах по настоящему изобретению, способно специфически связываться с эпитопом антигена CD40 человека, экспрессированным на поверхности клетки человека, то есть с эпитопом, расположенным снаружи клетки.

Моноклональные антитела, пригодные для использования в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены методом гибридом, впервые описанным в публикации Kohler et al. (1975) Nature 256:495, или могут быть получены методами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). Моноклональные антитела могут быть также выделены из библиотек антител на фаге, созданных методами, описанными, например, в публикации McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554 (1990) и в патенте США № 5514548. В публикациях Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628 и Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597 описано соответственно выделение антител мыши и человека с использованием библиотек на фаге. В приведенных ниже публикациях описано продуцирование высокоаффинных (диапазон нМ) антител человека путем перестановки цепи (Marks et al. (1992) Bio/Technology 10:779-783), комбинаторного инфицирования и рекомбинации in vivo в качестве методов создания очень больших библиотек на фаге (Waterhouse et al. (1993) Nucleic. Acids Res. 21:2265-2266). Указанные методы являются действенными альтернативами традиционным методам гибридом моноклональных антител для выделения моноклональных антител.

В соответствии с традиционным методом, описанным в публикации Kohler et al. (1975) Nature 256:495-496, мышь иммунизируют раствором, содержащим антиген. Иммунизация может быть выполнена путем смешивания или эмульгирования антигенсодержащего раствора в физиологическом растворе, предпочтительно в адъюванте, таком как полный адъювант Фрейнда, и парентерального введения полученной смеси или эмульсии. Для получения моноклональных антител по настоящему изобретению может быть использован любой метод иммунизации, известный в данной области. После иммунизации у животного удаляют селезенку (и необязательно несколько больших лимфатических узлов) и диссоциируют на отдельные клетки. Клетки селезенки могут быть исследованы путем введения взвеси клеток в чашку или лунку, сенсибилизированную представляющим интерес антигеном. В-клетки, экспрессирующие мембраносвязанный иммуноглобулин, специфичный к данному антигену, связываются с чашкой и не вымываются. Полученные В-клетки или все диссоциированные клетки селезенки гибридизируют с миеломными клетками с образованием гибридом и культивируют в селективной среде. Полученные клетки культивируют путем серийного разведения и анализируют в отношении продуцирования антител, которые специфически связываются с представляющим интерес антигеном (и не связываются с неродственными антигенами). Гибридомы, секретирующие отобранное моноклональное антитело (mAb), затем культивируют in vitro (например, во флаконах с культурой ткани или в ферментерах с системой полых волокон) или in vivo (в виде асцитов у мышей).

В соответствии с другим аспектом изобретения культуры В-клеток могут быть далее исследованы в отношении реактивности против первичного антигена. Такое исследование включает выполнение твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием белка-мишени/антигена, конкурентного анализа с использованием известных антител, связывающихся с представляющим интерес антигеном, и анализа связывания in vitro с временно трансфецированными клетками СНО или другими клетками, экспрессирующими антиген-мишень.

Если антитела против CD40, предназначенные для использования в способах по настоящему изобретению, необходимо получить методами рекомбинантных ДНК, выделяют ДНК, кодирующую моноклональные антитела, и секвенируют стандартными методами (например, при помощи олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антител мыши). Клетки гибридомы, описанные в настоящем описании изобретения, служат в качестве предпочтительного источника такой ДНК. Выделенная ДНК может быть введена в экспрессирующие векторы, которые затем трансфецируют в клетки-хозяева, такие как клетки E.coli, клетки COS обезьян, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или миеломные клетки, не продуцирующие белок иммуноглобулина, для синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Рекомбинантная экспрессия в бактериях ДНК, кодирующей антитело, описана в статьях Skerra et al. (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5:256 и Phickthun (1992) Immunol. Revs. 130:151. Альтернативно антитело может быть продуцировано в такой линии клеток, как линия клеток СНО, в соответствии с описанием, приведенным в патентах США № 5545403, 5545405 и 5998144, которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Линию клеток трансфецируют векторами, способными экспрессировать соответственно легкую цепь и тяжелую цепь. В результате трансфекции двух белков в разные векторы могут быть получены химерные антитела. Другим преимуществом данного метода является правильное гликозилирование антитела.

Термин “клетка-хозяин” в используемом здесь значении означает микроорганизм, эукариотическую клетку или линию клеток, культивируемую как одноклеточный организм, которые могут быть или были использованы в качестве реципиента для рекомбинантного вектора или других транспортных полинуклеотидов и включают потомство первичной трансфецированной клетки. Очевидно, что потомство одной клетки не может быть полностью идентично по своей морфологии, геному или общему комплементу ДНК клетке-предшественнику вследствие естественной, случайной или искусственной мутации.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело против CD40, такое как CHIR-12.12, может быть продуцировано в клетках СНО при помощи системы экспрессии генов GS (Lonza Biologics, Portsmouth, New Hampshire), в которой в качестве маркера использована глутаминсинтетаза. См. также патенты США № 5122464, 5591639, 5658759, 5770359, 5827739, 5879936, 5891693 и 5981216, которые полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

Моноклональные антитела к CD40 известны в данной области. См., например, разделы, посвященные В-клеточному антигену, в публикациях McMichael, ed. (1987, 1989) Leukocyte Typing III and IV (Oxford University Press, New York); патенты США № 5674492, 5874082, 5677165, 6056959; международные публикации № WO 02/28905 и WO 02/28904; Gordon et al. (1988) J. Immunol. 140:1425; Valle et al. (1989) Eur. J. Immunol. 19:1463; Clark et al. (1986) PNAS 83:4494; Paulie et al. (1989) J. Immunol. 142:590; Gordon et al. (1987) Eur. J. Immunol. 17:1535; Jabara et al. (1990) J. Exp. Med. 172:1861; Zhang et al. (1991) J. Immunol. 146:1836; Gascan et al. (1991) J. Immunol. 147:8; Banchereau et al. (1991) Clin. Immunol. Spectrum 3:8; и Banchereau et al. (1991) Science 251:70, которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

Как было отмечено выше, в определение термина “антитело” в используемом здесь значении входят химерные антитела. Термин “химерные” антитела означает антитела, которые предпочтительно выделены методами рекомбинантной дезоксирибонуклеиновой кислоты и включают человеческие компоненты (в частности, иммунологически “родственного” вида, например, шимпанзе) и компоненты, отличные от человеческих. Таким образом, константная область химерного антитела наиболее предпочтительно идентична константной области естественного антитела человека; вариабельная область химерного антитела наиболее предпочтительно выделена из источника, отличного от человека, и обладает требуемой антигенной специфичностью к представляющему интерес антигену (CD40). Источник, отличный от человека, может быть любым позвоночным животным, которое может быть использовано для создания антител к антигену CD40. Такие источники, отличные от человека, включают, не ограничиваясь ими, грызунов (например, кролика, крысу, мышь и т.д.; см., например, патент США № 4816567, который включен в настоящее описание изобретения в качестве ссылки) и приматов кроме человека (например, низших узконосых обезьян, человекообразных обезьян и т.д.; см., например, патенты США № 5750105 и 5756096, которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки).

Как было отмечено выше, в определение термина “антитело” входят гуманизированные антитела. Термин “гуманизированные антитела” означает формы антител, содержащие минимальную последовательность, выделенную из последовательностей иммуноглобулина, отличных от человеческих. Гуманизированные антитела в основном являются иммуноглобулинами человека (реципиентное антитело), в которых остатки из гипервариабельного участка (известного также как определяющая комплементарность область или CDR) реципиента заменены остатками из гипервариабельного участка вида, отличного от человека (донорское антитело), такого как мышь, крыса, кролик или примат кроме человека, обладающего требуемой специфичностью, сродством и способностью. Термин “гипервариабельный участок” означает аминокислотные последовательности, которые вместе определяют сродство связывания и специфичность естественной Fv-области сайта связывания нативного иммуноглобулина. См., например, публикации Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Kabat et al. (1991) U.S. Dept. of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Термин “константная область” означает часть молекулы антитела, сообщающую эффекторные функции. В предыдущей работе, посвященной созданию неиммуногенных антител для использования при лечении болезни человека, константные области мыши были заменены константными областями человека. Константные области гуманизированных антител субъекта были выделены из иммуноглобулинов человека. Однако указанные гуманизированные антитела могут вызывать нежелательную и потенциально опасную иммунную реакцию у человека и утрату сродства.

Антитело можно гуманизировать методом, разработанным Уинтером с соавторами (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), путем замены гипервариабельных участков или последовательностей гипервариабельных участков антитела человека соответствующими последовательностями грызунов или мутантных грызунов. См. также патенты США № 5225539, 5585089, 5693761, 5693762, 5859205, которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. В некоторых случаях остатки в остовных областях одной или нескольких вариабельных областей иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками, отличными от человеческих (см., например, патенты США № 5585089, 5693761, 5693762 и 6180370). Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, отсутствующие в реципиентном антителе или донорском антителе. Указанные модификации выполняют для дальнейшего улучшения характеристик антитела (например, для достижения требуемого сродства). Как правило, гуманизированное антитело содержит по существу все за исключением, по крайней мере, одной или обычно двух вариабельных областей, в которых все или по существу все гипервариабельные участки соответствуют гипервариабельным участкам иммунноглобулина, отличного от человеческого, и все или по существу все остовные области представляют собой последовательность иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также необязательно содержит, по крайней мере, часть константной области (Fc) иммуноглобулина, обычно иммуноглобулина человека. Для более подробного ознакомления с данным вопросом см. публикации Jones et al. (1986) Nature 331:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; и Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Таким образом, такие “гуманизированные” антитела могут включать антитела, в которых по существу почти вся интактная вариабельная область человека заменена соответствующей последовательностью, выделенной из вида, отличного от человека. На практике гуманизированные антитела обычно являются антителами человека, в которых некоторые остатки гипервариабельного участка и, возможно, некоторые остатки остова заменены остатками из аналогичных сайтов в антителах грызунов. См., например, патенты США № 5225539, 5585089, 5693761, 5693762, 5859205. См. также патент США № 6180370 и международную публикацию № WO 01/27160, в которых описаны гуманизированные антитела и методы получения гуманизированных антител с лучшим сродством к заранее определенному антигену.

Гуманизированные антитела против CD40 могут быть также получены по технологии Human Engineering^TM (Xoma Ltd., Berkeley, California).

Гуманизированные моноклональные антитела против CD40 включают такие антитела, как SGN-40 (Tai et al. (2004) Cancer Res. 64: 2846-52; патент США № 6838261), которое является гуманизированной формой антитела против CD40 мыши SGN-14 (Francisco et al. (2000) Cancer Res. 60:3225-31), и антитела, описанные в публикации заявки на патент США № 2004/0120948, которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

Настоящее изобретение может быть также осуществлено с использованием ксеногенных или модифицированных антител, продуцированных млекопитающим-хозяином, отличным от человека, в частности трансгенной мышью, которые характеризуются наличием локусов инактивированного эндогенного иммуноглобулина (Ig). У таких трансгенных животных компетентные эндогенные гены, необходимые для экспрессии субъединиц легкой и тяжелой цепей иммуноглобулинов хозяина, были сделаны нефункциональными или заменены аналогичными локусами иммуноглобулина человека. Указанные трансгенные животные продуцируют антитела человека при отсутствии субъединиц легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина хозяина. См., например, патенты США № 5877397 и 5939598, которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения полностью человеческие антитела к CD40 получают, например, путем иммунизации трансгенных мышей. Одна такая мышь была получена по технологии XenoMouse® (Abgenix; Fremont, California) и описана в патентах США № 6075181, 6091001 и 6114598, которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Например, для получения антитела CHIR-12.12 трансгенных мышей в отношении локуса тяжелой цепи IgG₁ человека и локуса легкой κ-цепи человека, иммунизировали клетками Sf9, экспрессирующими CD40 человека. Мыши могут быть также трансгенными в отношении других изотипов. Полностью человеческие антитела против CD40, пригодные для использования в способах по настоящему изобретению, обладают такими же свойствами связывания, что и моноклональное антитело CHIR-12.12.

Как было отмечено выше, в определение термина “антитело” в используемом здесь значении входят также фрагменты антитела, которые могут связывать антиген. “Фрагменты антитела” включают часть интактного антитела, предпочтительно антигенсвязывающую или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антитела включают Fab-, Fab'-, F(ab')₂- и Fv-фрагменты, диантитела, линейные антитела (Zapata et al. (1995) Protein Eng. 10:1057-1062), одноцепочечные молекулы антитела и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антитела. Расщепление антител папаином позволяет получить два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, именуемых “Fab”-фрагментами, каждый из которых имеет один антигенсвязывающий центр, и остаточный “Fc”-фрагмент, название которого отражает его способность легко кристаллизоваться. В результате обработки пепсином образуется F(ab')₂-фрагмент, который имеет два антигенсвязывающих центра и способен перекрестно связывать антиген.

“Fv” является минимальным фрагментом антитела, содержащим полный сайт узнавания и связывания антигена. Данная область состоит из димера вариабельной области одной тяжелой и одной легкой цепи, связанных прочной нековалентной связью. Именно в такой конфигурации взаимодействуют три гипервариабельных участка каждой вариабельной области, образуя антигенсвязывающий центр на поверхности димера V_H-V_L. В общей сложности шесть гипервариабельных участков сообщают антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако даже одна вариабельная область (или половина Fv, содержащая только три гипервариабельных участка, специфичных к антигену) способна узнавать и связывать антиген, хотя и с более низким сродством, чем весь антигенсвязывающий центр.

Fab-фрагмент также содержит константную область легкой цепи и первую константную область (С_Н1) тяжелой цепи. Fab-фрагменты отличаются от Fab'-фрагментов добавлением нескольких остатков у карбоксильного конца С_Н1-области тяжелой цепи, включающих один или несколько цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH является обозначением Fab'-фрагмента, в котором один или несколько остатков цистеина константных областей имеют свободную тиоловую группу. Fab'-фрагменты получают путем восстановления дисульфидного мостика тяжелой цепи F(ab')₂-фрагмента. Также известны другие химические связи фрагментов антитела.

Фрагменты антитела против CD40 пригодны для использования в способах по настоящему изобретению, если они сохраняют требуемое сродство непроцессированного антитела. Так, например, фрагмент антитела против CD40 сохраняет способность связываться с антигеном CD40. Такие фрагменты обладают такими же свойствами, что и соответствующее непроцессированное антитело. Так, например, фрагмент непроцессированного антагонистического антитела против CD40 предпочтительно способен специфически связывать антиген CD40 человека, экспрессированный на поверхности человеческой клетки, и не обладает значительной агонистической активностью, а оказывает антагонистическое действие, будучи связанным с антигеном CD40 на CD40-экспрессирующей клетке человека. Такие фрагменты определяются в настоящем описании изобретения как “антигенсвязывающие” фрагменты. Фрагменты антитела против CD40, пригодные для использования в способах по настоящему изобретению, также предпочтительно сохраняют способность связываться с родственными Fc-рецепторами. Так, например, фрагмент антитела против CD40 может сохранять способность связываться с FcγRIIIa. Фрагмент непроцессированного антитела против CD40 способен специфически связываться с антигеном CD40 клеточной поверхности, а также может связываться с FcγRIIIa на эффекторных клетках человека, таких как естественные клетки-киллеры (NK). Такие фрагменты определяются в настоящем описании изобретения как “FcR-связывающие” фрагменты. Такие фрагменты обычно содержат, по крайней мере, часть константной области тяжелой цепи.

Были разработаны разные методы продуцирования фрагментов антитела. Такие фрагменты традиционно получают путем протеолитического расщепления интактных антител (см., например, публикации Morimoto et al. (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) и Brennan et al. (1985) Science 229:81). Однако в настоящее время указанные фрагменты могут быть продуцированы непосредственно рекомбинантными клетками-хозяевами. Например, фрагменты антитела могут быть выделены из рассмотренных выше библиотек антител на фаге. Альтернативно Fab'-SH фрагменты могут быть непосредственно выделены из E.coli и химически связаны с образованием F(ab')₂-фрагментов (Carter et al. (1992) Bio/Technology 10:163-167). В соответствии с другим методом F(ab')₂-фрагменты могут быть выделены непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Специалисту в данной области должны быть известны другие методы получения фрагментов антитела.

Приемлемые антигенсвязывающие фрагменты антитела включают часть непроцессированного антитела, обычно антигенсвязывающую или вариабельную область антитела. Примеры фрагментов антитела включают, не ограничиваясь ими, Fab-, F(ab')2- и Fv-фрагменты и одноцепочечные молекулы антител. “Fab” означает одновалентный антигенсвязывающий фрагмент иммуноглобулина, который состоит из легкой цепи и части тяжелой цепи. F(ab')₂ означает двухвалентный антигенсвязывающий фрагмент иммуноглобулина, который содержит обе легкие цепи и часть обеих тяжелых цепей. “Одноцепочечный Fv” или “sFv” фрагмент антитела означает фрагмент, содержащий V_H- и V_L-области антитела, в котором указанные области присутствуют в одной полипептидной цепи. См., например, патенты США № 4946778, 5260203, 5455030 и 5856456, которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Fv-полипептид обычно далее содержит полипептидный линкер между V_H- и V_L-областями, который позволяет sFv образовывать требуемую структуру для связывания антигена. Для ознакомления с sFv см. публикацию Pluckthun (1994) in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, ed. Rosenburg and Moore (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315. Антигенсвязывающие фрагменты антагонистических антител против CD40, рассмотренных в настоящем описании изобретения, могут быть также конъюгированы с цитотоксином для уничтожения раковых клеток-мишеней в соответствии с приведенным ниже описанием.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело против CD40 является антагонистическим антителом против CD40. Когда такие антитела связывают CD40, расположенный на поверхности клеток человека, таких как В-клетки человека, они не проявляют значительную агонистическую активность. В некоторых вариантах осуществления изобретения связывание таких антител с антигеном CD40, расположенным на поверхности клеток человека, ингибирует пролиферацию и дифференцировку указанных клеток человека. Антитела против CD40, пригодные для использования в способах по настоящему изобретению, включают антитела, оказывающие антагонистическое действие в отношении нормальных и раковых клеток человека, экспрессирующих антиген CD40 клеточной поверхности.

Термин “агонистическая активность” означает действие вещества в качестве агониста. Агонист связывается с рецептором на клетке и инициирует реакцию или активность, которая подобна или аналогична активности, инициируемой естественным лигандом рецептора. Агонист CD40 вызывает, не ограничиваясь ими, любые или все следующие реакции: пролиферацию и/или дифференцировку В-клеток; увеличение межклеточной адгезии при помощи таких молекул как ICAM-1, Е-селектин, VCAM и тому подобные; секрецию провоспалительных цитокинов, таких как IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF и тому подобные; трансдукцию сигналов через рецептор CD40 по таким путям как TRAF (например, TRAF2 и/или TRAF3), МАР-киназы, такие как NIK (NF-κВ-индуцирующая киназа), I-каппа-В-киназы (IKK α/β), NF-κВ фактора транскрипции, Ras и путь МЕК/ERK, путь PI3K/AKT, путь МАРК Р38 и тому подобные; трансдукцию сигнала подавления апоптоза такими молекулами, как XIAP, mcl-1, bcl-x и тому подобные; формирование В- и/или Т-клеточной памяти; продуцирование В-клеточного антитела; переключение В-клеточного изотипа, повышение экспрессии МНС класса II и CD80/86 на клеточной поверхности и тому подобные.

“Значительная” агонистическая активность означает агонистическую активность, которая по крайней мере на 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% выше агонистической активности, индуцируемой нейтральным веществом или отрицательным контрольным веществом при измерении с помощью анализа гуморальной иммунной реакции. “Значительная” агонистическая активность предпочтительно означает агонистическую активность, которая по крайней мере в 2 раза выше или по крайней мере в 3 раза выше, чем агонистическая активность, индуцированная нейтральным веществом или отрицательным контрольным веществом, при выполнении анализа гуморальной иммунной реакции. Так, например, когда представляющая интерес гуморальная иммунная реакция относится к пролиферации В-клеток, “значительная агонистическая активность” является показателем уровня пролиферации В-клеток, которая по крайней мере в 2 раза выше или по крайней мере в 3 раза выше уровня пролиферации В-клеток, вызываемой нейтральным веществом или отрицательным контрольным веществом. В одном варианте осуществления изобретения отрицательным контрольным веществом является неспецифический иммуноглобулин, например IgG1, который не связывается с CD40. Вещество, “не обладающее значительной агонистической активностью”, должно обладать агонистической активностью, которая не более чем примерно на 25% превышает агонистическую активность, вызываемую нейтральным веществом или отрицательным контрольным веществом, предпочтительно не более чем примерно на 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5% или даже не более чем примерно на 0,1% превышает агонистическую активность, вызываемую нейтральным веществом или отрицательным контрольным веществом, при измерении с помощью анализа гуморальной иммунной реакции.

Термин “антагонистическая активность” означает, что данное вещество действует в качестве антагониста. Антагонист CD40 предотвращает или уменьшает индукцию любых реакций, вызываемых в результате связывания рецептора CD40 с лигандом-агонистом, в частности CD40L. Антагонист может уменьшать индукцию одной или нескольких реакций на связывание агониста на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, предпочтительно на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, более предпочтительно на 70%, 80%, 85% и наиболее предпочтительно на 90% 95%, 99% или 100%. Методы измерения специфичности связывания лиганда CD40 и антагонистической активности лекарственного средства против CD40, например антитела против CD40, известны в данной области и включают, не ограничиваясь ими, стандартные конкурентно-связывающие анализы, анализы контроля секреции иммуноглобулина В-клетками, анализы пролиферации В-клеток, анализы пролиферации В-клеток методом Banchereau, анализы Т-клеток-хелперов в отношении продуцирования антител, анализы костимуляции пролиферации В-клеток и анализы увеличения маркеров активации В-клеток. См., например, анализы, описанные в WO 00/75348 и патенте США № 6087329, которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. См., также WO 2005/044854, WO 2005/044304, WO 2005/044305, WO 2005/044306, WI 2005/044855, WO 2005/044307 и WO 2005/044294, которые полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

Антагонистическую активность/отсутствие агонистической активности можно определить при помощи анализов, показывающих, что антитело CHIR-12.12 не обладает агонистической активностью. Приемлемые анализы описаны в патенте США № 5677165 (Chiron Corporation).

В одном варианте осуществления изобретения антагонистическое антитело против CD40 не обладает значительной агонистической активностью в отношении одной клеточной реакции. В другом варианте осуществления изобретения антагонистическое антитело против CD40 не обладает значительной агонистической активностью при выполнении анализов нескольких клеточных реакций (например, пролиферация и дифференцировка или пролиферация, дифференцировка и, в случае В-клеток, продуцирование антител).

Особый интерес представляют антагонистические антитела против CD40, не обладающие значительной агонистической активностью, а проявляющие антагонистическую активность при связывании с антигеном CD40 на В-клетках человека. В одном варианте осуществления изобретения антагонистическое антитело против CD40 не обладает значительной агонистической активностью в отношении одной гуморальной иммунной реакции. В другом варианте осуществления изобретения антагонистическое антитело против CD40 не обладает значительной агонистической активностью при анализе нескольких гуморальных иммунных реакций (например, пролиферация и дифференцировка или пролиферация, дифференцировка и продуцирование антител).

Для определения способности антитела против CD40 действовать в качестве антагониста одной или нескольких гуморальных иммунных реакций можно использовать любые анализы, известные в данной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело против CD40 действует в качестве антагониста по крайней мере одной гуморальной иммунной реакции, выбираемой из группы, включающей пролиферацию В-клеток, дифференцировку В-клеток, продуцирование антител, межклеточную адгезию, образование В-клеточной памяти, переключение изотипа, увеличение экспрессии МНС класса II и CD80/86 на клеточной поверхности и секрецию провоспалительных цитокинов, таких как IL-8, IL-12 и TNF. Особый интерес представляют антагонистические антитела против CD40, не обладающие значительной агонистической активностью в отношении пролиферации В-клеток при связывании с антигеном CD40 человека на поверхности В-клетки человека.

Антитело против CD40 может быть антагонистом пролиферации В-клеток, вызываемой растворимым или поверхностным CD40L, по результатам анализа пролиферации В-клеток. В данной области известны приемлемые анализы пролиферации В-клеток. Приемлемые анализы пролиферации В-клеток также рассмотрены ниже в настоящем описании изобретения. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонистическое антитело против CD40 стимулирует пролиферацию В-клеток на уровне не более примерно 25% пролиферации В-клеток, вызываемой нейтральным веществом или отрицательным контрольным веществом, предпочтительно не более примерно 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5% или даже не более примерно 0,1% пролиферации В-клеток, вызываемой нейтральным веществом или отрицательным контрольным веществом.

В других вариантах осуществления изобретения антитело против CD40 является антагонистом пролиферации В-клеток, вызываемой другим антителом против CD40, например, антителом против CD40 S2C6, по результатам измерения пролиферации В-клеток, при этом уровень пролиферации В-клеток, стимулированной другим антителом против CD40 в присутствии антагонистического антитела против CD40, составляет не более примерно 25% пролиферации В-клеток, вызываемой другим антителом против CD40 при отсутствии антагонистического антитела против CD40 (то есть ингибирование, равное по крайней мере 75%), предпочтительно не более примерно 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5% или даже не более примерно 0,1% пролиферации В-клеток, вызываемой другим антителом против CD40 при отсутствии антагонистического антитела против CD40.

В других вариантах осуществления изобретения антитело против CD40 является антагонистом пролиферации В-клеток, вызываемой линией клеток EL4B5, по результатам измерения при помощи анализа активации В-клеток, при этом уровень пролиферации В-клеток, стимулированный линией клеток EL4B5 в присутствии антагонистического антитела против CD40, составляет не более примерно 25% пролиферации В-клеток, вызываемой указанной линией клеток при отсутствии антагонистического антитела против CD40 (то есть ингибирование, равное по крайней мере 75%), предпочтительно не более примерно 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5% или даже не более примерно 0,1% пролиферации В-клеток, вызываемой указанной линией клеток при отсутствии антагонистического антитела против CD40.

В других вариантах осуществления изобретения антитело против CD40 является антагонистом продуцирования антител В-клетками человека, индуцируемого Т-клетками человека, по результатам измерения при помощи анализа Т-клеток-хелперов человека в отношении продуцирования антител В-клетками. В данном случае уровень продуцирования антитела IgG, антитела IgM или антител IgG и IgM В-клетками, стимулируемыми Т-клетками, в присутствии антагонистического антитела против CD40 составляет не более примерно 50% соответствующего продуцирования антител В-клетками, стимулируемыми Т-клетками, при отсутствии антагонистического антитела против CD40 (то есть ингибирование, равное по крайней мере 75%), предпочтительно не более примерно 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5% или даже не более примерно 0,1% соответствующего продуцирования антител В-клетками, стимулируемыми Т-клетками, при отсутствии антагонистического антитела против CD40. Дополнительные антагонистические антитела против CD40 включают моноклональные антитела, определяемые как 5D12, 3A8 и 3С6, которые секретированы гибридомой, депонированной в АТСС соответственно под номерами доступа НВ 11339, НВ 12024 и НВ 11340. См., например, патент США № 6315998, который полностью включен в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

Например, для оценки антагонистической активности антитела против CD40 могут быть использованы следующие анализы. В-клетки человека для указанных анализов могут быть выделены, например, из миндалин, полученных у субъектов, подвергнутых тонзиллэктомии, в соответствии с описанием, приведенным в публикации De Groot et al. (1990) Lymphokine Research (1990) 9:321. Ткань диспергируют при помощи скальпеля-бритвы, фагоциты и NK-клетки элиминируют, производя обработку 5 мМ метилового эфира с L-лейцином, и Т-клетки удаляют в результате одного цикла розеткообразования эритроцитами овцы (SRBC), обработанными бромидом 2-аминоэтилизотиоурония. Чистоту полученных препаратов на основе В-лимфоцитов можно проверить путем непрямого иммунофлуоресцентного мечения моноклональным антителом против (CD20) В1 (Coulter Clone, Hialeah, FA) или моноклональным антителом против (CD3) ОКТ3 (Ortho, Raritan, NJ) и меченным флуоресцином F(ab')₂-фрагментом антитела кролика против Ig мыши (Zymed, San Francisco, CA) и при помощи анализа FACS.

Анализ пролиферации В-клеток

В-клетки (4 × 10⁴ на лунку) культивируют в 200 мкл среды IMDM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, на 96-луночных титрационных микропланшетах с плоским основанием. В-клетки стимулируют, добавляя иммобилизованные антитела против (IgM) (иммуногранулы; 5 мкг/мл; BioRad, Richmond, California). При желании добавляют 100 ед/мл рекомбинантного IL-2. В начале культивирования в микрокультуры добавляют испытуемые моноклональные антитела (mAb) в разных концентрациях и на 3-й день оценивают пролиферацию, измеряя включение (³Н)-тимидина после генерации импульсов в течение 18 часов. Антагонистическое антитело против CD40 не стимулирует в значительной степени пролиферацию В-клеток человека в присутствии иммобилизованного антитела против IgM или в присутствии иммобилизованного антитела против IgM и IL-2.

Анализ пролиферации В-клеток методом Banchereau

Для испытания способности моноклональных антител против CD40 стимулировать пролиферацию В-клеток в культуральной системе, аналогичной описанной в публикации Banchereau et al. (1991) Science (1991) 251:70, используют трансфецированные клетки 3Т6 мыши, экпрессирующие аллельную форму HR FcγRII человека. В-клетки (2 × 10⁴ на лунку) культивируют в микролунках с плоским основанием в присутствии 1 × 10⁴ трансфецированных клеток (облученных 5000 рад) в 200 мкл среды IMDM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и 100 ед/мл рекомбинантного IL-4. До добавления В-клеток клетки 3Т6 оставляют для сцепления с пластиком для культуры в течение по крайней мере 5 часов. Моноклональные антитела против CD40 добавляют в концентрациях от 15 нг/мл до 2000 нг/мл и оценивают пролиферацию В-клеток, измеряя включение тимидина на 7-й день после генерации импульсов [³H]-тимидином в течение 18 часов.

Ингибирование S2C6-стимулированной пролиферации В-клеток при помощи антагонистических моноклональных антител против CD40

Антагонистические моноклональные антитела (mAb) против CD40 могут быть также охарактеризованы по их способности ингибировать стимуляцию пролиферации В-клеток антителом против CD40, таким как S2C6 (который известен также как SGN-14 и считается агонистом стимуляции пролиферации нормальных В-клеток под воздействием CD40; Francisco et al. (2000) Cancer Res. 60:3225-3231), при помощи вышеописанного анализа пролиферации В-клеток. В-клетки миндалин человека (4 × 10⁴ на лунку) культивируют в 200 мкл среды в микролунках в присутствии антитела против IgM, сцепленного с сефарозными гранулами (5 мкг/мл), и mAb против CD40 S2C6 (1,25 мкг/мл). Добавляют представляющее интерес моноклональное антитело против CD40 в разных концентрациях и оценивают включение [³H]-тимидина через 3 дня. В качестве контрольного антитела может быть добавлено моноклональное антитело против глюкоцереброзидазы 8Е4 в аналогичных концентрациях. Barneveld et al. (1983) Eur. J. Biochem. 134:585. Антагонистическое антитело против CD40 может ингибировать костимуляцию индуцированной антителом против IgM пролиферации В-клеток человека под воздействием mAb S2C6, например, по крайней мере на 75% или больше (то есть S2C6-стимулированная пролиферация в присутствии антагонистического антитела против CD40 составляет не более 25% пролиферации, имеющей место при отсутствии антагонистического антитела против CD40). В отличие от этого не наблюдается значительного ингибирования эквивалентными количествами неродственного моноклонального антитела 8Е4 против β-глюкоцереброзидазы. Barneveld et al., см. выше. Такой результат показывает, что моноклональные антитела против CD40 не стимулируют пролиферацию В-клеток человека, а наоборот могут подавлять стимулирующие сигналы, возникающие в результате запуска CD40 другим моноклональным антителом.

Анализ активации В-клеток с использованием клеток EL4B5

В публикации Zubler et al. (1985) J. Immunol. (1985) 134:3662 указано, что мутантный субклон линии EL-4 тимомы мыши, известный как EL4B5, может значительно стимулировать пролиферацию и дифференцировку В-клеток мышей и человека с образованием плазмацитов, секретирующих иммуноглобулин, in vitro. Установлено, что указанная активация не зависит от антигена и не ограничена главным комплексом гистосовместимости (МНС). Для оптимальной стимуляции В-клеток человека необходимо присутствие супернатанта из активированных Т-клеток человека, но гуморальная иммунная реакция также возникала в том случае, когда клетки EL4B5 предварительно активировали форбол-12-миристат-13-ацетатом (РМА) или IL-1. Zubler et al. (1987) Immunological Reviews 99:281; и Zhang et al. (1990) J. Immunol. 144:2955. При выполнении экспериментов с ограниченным разведением было установлено, что при активации В-клеток в данной культуральной системе большинство В-клеток человека может пролиферировать и дифференцировать с образованием клеток, секретирующих антитела. Wen et al. (1987) Eur. J. Immunol. 17:887.

В-клетки (1000 на лунку) культивируют вместе с облученными (5000 рад) клетками EL4B5 (5 × 10⁴ на лунку) на титрационных микропланшетах с плоским основанием в 200 мкл среды IMDM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, инактивированной нагреванием, 5 нг/мл форбол-12-миристат-13-ацетата (Sigma) и 5% супернатанта Т-клеток человека. Моноклональные антитела добавляют в разных концентрациях в начале культивирования и оценивают включение тимидина на 6-й день после генерации импульсов [³H]-тимидином в течение 18 часов. Для получения Т-клеточного супернатанта очищенные Т-клетки культивируют с плотностью 10⁶/мл в течение 36 часов в присутствии 1 мкг/мл РНА и 10 нг/мл РМА. Wen et al. (1987) Eur. J. Immunol. (1987) 17:887. Т-клеточный супернатант получают, центрифугируя клетки, и хранят при -20°С. Затем испытывают эффективноть Т-клеточных супернатантов для усиления пролиферации В-клеток человека в культурах В-клеток EL4B5 и наиболее эффективные супернатанты собирают для использования в экспериментах. При оценке воздействия антитела против CD40 на EL4B5-индуцированную пролиферацию В-клеток человека может быть добавлено моноклональное антитело, такое как МОРС-141 (IgG2b), в качестве контрольного антитела.

Антагонистическое антитело против CD40 может ингибировать пролиферацию В-клеток, стимулированную линией клеток EL4B5, например, по крайней мере на 75% или больше (то есть EL4B5-индуцированная пролиферация В-клеток в присутствии антагонистического антитела против CD40 составляет не более 25% пролиферации, наблюдаемой при отсутствии антагонистического антитела против CD40). В отличие от этого контрольное антитело, такое как МОРС-141, не оказывает значительного воздействия на EL4B5-индуцированную пролиферацию В-клеток.

Анализ Т-клеток-хелперов человека в отношении продуцирования антител В-клетками

Антагонистическое антитело против CD40 может действовать в качестве антагониста продуцирования иммуноглобулина В-клетками. Антитело против CD40 можно испытать в отношении данного типа антагонистической активности путем оценки способности антитела ингибировать продуцирование иммуноглобулина В-клетками, стимулированными контактированием с активированными Т-клетками при выполнении анализа Т-клеток-хелперов. 96-луночные планшеты для культуры ткани сенсибилизируют моноклональным антителом против CD3 CLB-T3/3 (CLB, Amsterdam, The Netherlands), разведенным в асцитической жидкости в отношении 1:500. Добавляют костимулирующие моноклональные антитела: mAb против CD2 CLB-T11.1/1 и CLB-T11.2/1 (CLB, Amsterdam, The Netherlands), разведенные в асцитической жидкости в отношении 1:1000, и mAb против CD28 CLB-28/1 (CLB, Amsterdam, The Netherlands). Затем добавляют Т-клетки миндалин (облученные, 3000 рад; 10⁵ на лунку), В-клетки миндалин (10⁴ на лунку) и rIL-2 (20 ед/мл). Конечный объем каждой культуры клеток равен 200 мкл. Через 8 дней клетки осаждают и собирают бесклеточный супернатант. Концентрации IgM и IgG человека в (разведенных) образцах определяют описанным ниже методом ELISA.

В одном варианте осуществления изобретения В-клетки миндалин человека (10⁴/лунку) культивируют вместе с облученными очищенными Т-клетками (3000 рад, 10⁵/лунку) на 96-луночных планшетах, сенсибилизированных mAb против CD3, в присутствии или отсутствии других моноклональных антител для костимуляции Т-клеток. Через 8 дней культивирования супернатанты собирают для определения продуцирования иммуноглобулина В-клетками. Продуцирование иммуноглобулина В-клетками определяют описанным ниже методом ELISA. Представляющее интерес антитело против CD40 добавляют в разных концентрациях в начале культивирования. В качестве контрольного антитела может быть добавлено моноклональное антитело МОРС-141.

Антагонистическое антитело против CD40 может ингибировать продуцирование антител IgG и IgM В-клетками, стимулированными Т-клетками человека по крайней мере на 50% или больше (то есть индуцированное Т-клетками продуцирование антител В-клетками в присутствии антагонистического антитела против CD40 составляет не более 50% продуцирования, наблюдаемого при отсутствии антагонистического антитела против CD40). В отличие от этого контрольное антитело, такое как МОРС-141, не оказывает значительного воздействия на индуцированное Т-клетками продуцирование антител В-клетками.

Анализ ELISA для количественного определения иммуноглобулина

Концентрации IgM и IgG человека определяют методом ELISA. 96-луночные планшеты для ELISA сенсибилизируют 4 мкг/мл моноклонального антитела мыши против IgG человека МН 16-01 (CLB, Amsterdam, The Netherlands) или 1,2 мкг/мл моноклонального антитела мыши против IgM человека 4102 (Tago, Burlingame, CA) в 0,05 М карбонатного буфера (рН 9,6), инкубируя в течение 16 часов при 4°С. Планшеты трижды промывают PBS-0,05% твина-20 (PBS-твин) и насыщают BSA в течение 1 часа. Планшеты дважды промывают и инкубируют в течение 1 часа при 37°С с испытуемыми образцами в разных разведениях. После 3 промывок детектируют связанный Ig, производя инкубацию в течение 1 часа при 37°С с 1 мкг/мл меченного пероксидазой моноклонального агнтитела мыши против IgG человека МН 16-01 (CLB) или моноклонального антитела мыши против IgM человека 15-01 (CLB). Планшеты промывают 4 раза и выявляют активность связанной пероксидазы, добавляя О-фенилендиамин в качестве субстрата. Стандартную человеческую сыворотку (Н00, CLB) используют для построения стандартной кривой для каждого анализа.

В данной области известны антагонистические антитела против CD40. См., например, антитело против CD40 человека, продуцированное гибридомой, получившей название F4-465, которое описано в публикациях заявок на патент США № 2002/0142358 и 2003/0059427, которые полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Антитело F4-465 было получено у мыши НАС (Kuroiwa et al. (2000) Nature Biotech. 10:1086 (2000)) и поэтому экспрессирует легкую лямбда-цепь человека. См. также WO 2005/044854, WO 2005/044304, WO 2005/044305, WO 2005/044306, WO 2005/044855, WO 2005/044307 и WO 2005/044294, которые полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

Помимо антагонистической активности антитело против CD40, применяемое в способах по настоящему изобретению, предпочтительно обладает другим механизмом воздействия на клетку-мишень. Например, антитело против CD40 предпочтительно обладает активностью ADCC. Альтернативно вариабельные области антитела против CD40 могут быть экспрессированы в другом изотипе антитела, обладающего активностью ADCC. Кроме того, нативные формы, рекомбинантные формы или антигенсвязывающие фрагменты антител против CD40 могут быть конъюгированы с цитотоксином, лекарственным средством, ионом радиоактивного металла или радиоизотопом, как описано в настоящем описании изобретения.

Как указано в настоящем описании изобретения, было сделано удивительное открытие, состоящее в том, что в отличие от других антител антитела против CD40, такие как CHIR-12.12, способны опосредовать сильную антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) CD40-экспрессирующих клеток-мишеней в результате связывания с любым из двух аллотипов (V или F) аминокислоты 158 FcγRIIIa на естественных клетках-киллерах (NK) пациента-человека. Таким образом, антитела против CD40, такие как CHIR-12.12, могут быть использованы для лечения разных типов рака и предраковых состояний, ассоциированных с CD40-экспрессирующими клетками у пациентов-людей гетерозиготных или гомозиготных в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F), помимо гомозиготных пациентов-людей в отношении FcγRIIIa-158V (генотип V/V). Настоящее изобретение является особенно перспективным для лечения разных типов рака и предраковых состояний, не реагирующих на лечение ритуксимабом (Rituxan®), так как известно, что клиническая активность ритуксимаба в NHL соответствует генотипу FcγRIIIa пациента.

Таким образом, особенно предпочтительными антителами против CD40, предназначенными для использования в способах по настоящему изобретению, являются антитела, которые помимо антагонистической активности, способны опосредовать ADCC CD40-экспрессирующих клеток под воздействием эффекторных клеток человека, таких как естественные клетки-киллеры (NK-клетки), экспрессирующие FcγRIIIa. Наиболее предпочтительными антителами являются антитела против CD40, способные связывать FcγRIIIa-158F и FcγRIIIa-158V с высоким сродством, как описано в настоящем описании изобретения.

Особенно предпочтительными антителами против CD40 являются антитела, описанные в WO 2005/044854, WO 2005/044304, WO 2005/044305, WO 2005/044306, WO 2005/044855, WO 2005/044307 и WO 2005/044294, которые полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

Особый интерес для настоящего изобретения представляют антагонистические антитела против CD40, которые обладают характеристиками связывания моноклонального антитела CHIR-12.12, описанного в WO 2005/044854, WO 2005/044304, WO 2005/044305, WO 2005/044306, WO 2005/044855, WO 2005/044307 и WO 2005/044294. Такие антитела включают, не ограничиваясь ими, нижеследующие антитела:

a) моноклональное антитело CHIR-12.12;

b) моноклональное антитело, продуцированное линией клеток гибридомы 12.12;

с) моноклональное антитело, содержащее аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из последовательности, показанной в SEQ ID NO:2, последовательности, показанной в SEQ ID NO:4, последовательности, показанной в SEQ ID NO:5, обеих последовательностей, показанных в SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4, и обеих последовательностей, показанных в SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:5.

d) моноклональное антитело, содержащее аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из последовательности, показанной в SEQ ID NO:1, последовательности, показанной в SEQ ID NO:3, и обеих последовательностей, показанных в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:3;

е) моноклональное антитело, которое связывается с эпитопом, способным связывать моноклональное антитело, продуцируемое линией клеток гибридомы 12.12;

f) моноклональное антитело, которое связывается с эпитопом, включающим остатки 82-87 последовательности CD40 человека, показанной в SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:9;

g) моноклональное антитело, которое связывается с эпитопом, включающим остатки 82-89 последовательности CD40 человека, показанной в SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:9;

h) моноклональное антитело, которое конкурирует с моноклональным антителом CHIR-12.12 в конкуретно-связывающем анализе;

i) моноклональное антитело по предшествующему пункту а) или моноклональное антитело по любому из предшествующих пунктов с)-h), причем указанное антитело получают рекомбинантными методами; и

j) моноклональное антитело, являющееся антигенсвязывающим фрагментом моноклонального антитела по любому из предшествующих пунктов а)-i), если указанный фрагмент сохраняет способность специфически связываться с антигеном CD40 человека.

Моноклональное антитело CHIR-12.12 является особенно предпочтительным антителом для использования в способах по настоящему изобретению.

Моноклональное антитело CHIR-12.12 подробно описано в WO 2005/044854, WO 2005/044304, WO 2005/044305, WO 2005/044306, WO 2005/044855, WO 2005/044307 и WO 2005/044294. Антитело CHIR-12.12 является полностью человеческим моноклональным антителом против CD40 изотипа IgG₁, продуцированным из линии клеток гибридомы 153.8Е2.D10.D6.12.12 (определяемой как линия клеток 12.12). Указанная линия клеток была создана с использованием спленоцитов, полученных у иммунизированных ксенотипических мышей, содержащих локус тяжелой цепи IgG₁ человека и локус κ-цепи человека (технология XenoMouse®; Abgenix; Fremont; Calofornia). Клетки селезенки гибридизировали с миеломными клетками мыши SP2/0 (Sierra BioSource). Полученные гибридомы субклонировали несколько раз для создания линии устойчивых моноклональных клеток 12.12. Другие антитела, пригодные для использования в способах по настоящему изобретению, могут быть получены аналогичным образом с использованием мышей, трансгенных в отношении локусов иммуноглобулина человека, как описано в настоящем описании изобретения.

Моноклональное антитело CHIR-12.12 связывает растворимый CD40 при выполнении анализов методом ELISA, предотвращает связывание лиганда CD40 с CD40 клеточной поверхности и замещает предварительно связанный лиганд CD40 по результатам анализов методом проточной цитометрии. Антитела CHIR-5.9 и CHIR-12.12 конкурируют друг с другом за связывание с CD40, а не с моноклональным антителом против CD40 15В8, описанным в предварительной заявке на патент США № 60/237556, озаглавленной “Антитела против CD40 человека”, поданной 2 октября 2000 г., и в международной заявке РСТ № РСТ/US01/30857, также озаглавленной “Антитела против CD40 человека”, поданной 2 октября 2001 г. (№ реестра поверенного РР16092.003), и опубликованной как WO 2002/028904, которые полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. При испытании in vitro в отношении воздействия на пролиферацию В-клеток у здоровых субъектов-людей антитело CHIR-12.12 действует в качестве антагонистического антитела против CD40. Кроме того, антитело CHIR-12.12 не вызыает сильной пролиферации лимфоцитов человека у здоровых субъектов. Указанное антитело способно уничтожать CD40-экспрессирующие клетки-мишени под воздействием антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Сродство связывания антитела CHIR-12.12 в отношении CD40 человека равно 5 × 10^-10 М по результатам анализа Biacore^TM.

В настоящем описании изобретения представлены нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных областей антитела CHIR-12.12. В частности, аминокислотные последовательности для лидерной, вариабельной и константной областей легкой и тяжелой цепи моноклонального антитела CHIR-12.12 показаны в SEQ ID NO:2 (полная последовательность для легкой цепи моноклонального антитела CHIR-12.12), SEQ ID NO:4 (полная последовательность для тяжелой цепи моноклонального антитела CHIR-12.12) и SEQ ID NO:5 (полная последовательность для варианта тяжелой цепи моноклонального антитела CHIR-12.12, показана в SEQ ID NO:4, где вариант включает замену остатка аланина серином в положении 153 SEQ ID NO:4). Нуклеотидные последовательности, кодирующие легкую и тяжелую цепь моноклонального антитела CHIR-12.12, показаны в SEQ ID NO:1 (кодирующая последовательность для легкой цепи моноклонального антитела CHIR-12.12) и SEQ ID NO:3 (кодирующая последовательность для тяжелой цепи моноклонального антитела CHIR-12.12). Гибридомы, экспрессирующие антитело CHIR-12.12, были депонированы в АТСС с обозначением депозита патента РТА-5543.

Антитела против CD40, используемые в способах по настоящему изобретению, включают антитела, отличающиеся от моноклонального антитела CHIR-12.12, но сохраняющие гипервариабельные участки, и антитела с добавлением, делецией или заменой одной или нескольких аминокислот. Антитела против CD40, используемые в способах по настоящему изобретению, могут быть также деиммунизированными антителами, в частности деиммунизированными антагонистическими антителами против CD40, которые могут быть получены в соответствии с описанием, приведенным, например, в международных публикациях № WO 98/52976 и WO 0034317, которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Остатки в антагонистических антителах против CD40 по настоящему изобретению модифицируют так, чтобы сделать антитела неиммуногенными или менее иммуногенными для людей, сохраняющих свою антагонистическую активность в отношении CD40-экспрессирующих клеток человека, причем такую активность измеряют при помощи анализов, описанных в настоящем описании изобретения. В объем настоящего изобретения входят также слитые белки, содержащие представляющее интерес антитело, например антагонистическое антитело против CD40, антагонистическое антитело против CD40L или его фрагмент, которые могут быть синтезированы или экспрессированы из соответствующих полинуклеотидных векторов, известных в данной области. Такие слитые белки описаны со ссылкой на конъюгацию антител, как указано в настоящем описании изобретения.

Любое известное антитело с представляющей интерес специфичностью связывания может включать изменения последовательности, полученные методами, описанными, например, в публикациях патентов № ЕР 0983303 А1, WO 00/34317 и WO 98/52976, которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Например, установлено, что последовательности в CDR могут вызывать связывание антитела с МНС класса II и запускать нежелательную реакцию Т-клеток-хелперов. Консервативные замены позволяют антителу сохранить связывающую активность, утратив при этом способность запускать нежелательную Т-клеточную иммунную реакцию. Любые такие консервативные или неконсервативные замены могут быть произведены известными в данной области методами, описанными в настоящем описании изобретения, и полученные антитела могут быть также использованы в способах по настоящему изобретению. Вариантные антитела могут быть испытаны в отношении конкретной активности, например антагонистической активности, сродства и специфичности при помощи методов, описанных в настоящем описании изобретения.

Например, варианты аминокислотной последовательности антагонистического антитела против CD40, в частности моноклонального антитела CHIR-12.12, могут быть получены путем мутаций в клонированной последовательности ДНК, кодирующей предтавляющее интерес антитело. В данной области хорошо известны методы мутагенеза и изменения нуклеотидной последовательности. См., например, публикации Walker and Gaastra (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154:367-382; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York); патент США № 4873192 и приведенные в нем ссылки, которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Руководство по выполнению соответствующих замен аминокислот, не влияющих на биологическую активность представляющего интерес полипептида, можно найти в модели, описанной Dayhoff et al. (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Предпочтительными могут быть консервативные замены, например замена одной аминокислоты другой аминокислотой с подобными свойствами. Примеры консервативных замен включают, не ограничиваясь ими, Gly⇔Ala, Val⇔Ile⇔Leu, Asp⇔Glu, Lys⇔Arg, Asn⇔Gln и Phe⇔Trp⇔Tyr.

При создании вариантов представляющего интерес антитела, например, представляющего интерес полипептида антагонистического антитела против CD40, выполняют модификации, позволяющие сохранить требуемую активность варианта, то есть аналогичное сродство связывания, и в случае антагонистических антител против CD40 способность специфически связываться с антигеном CD40 человека, экспрессированным на поверхности клетки человека, и не проявлять значительной агонистической активности, а оказывать антагонистическое действие при связывании с антигеном CD40 на CD40-экспрессирующей клетке человека. Очевидно, что любые мутации, выполненные в ДНК, кодирующей вариантный полипептид, не должны выводить последовательность из рамки считывания и предпочтительно не должны создавать комплементарных областей, которые могут продуцировать вторичную структуру мРНК. См. публикацию заявки на европейский патент № 75444.

Кроме того, константная область антитела, например антагонистического антитела против CD40, может быть мутирована с изменением эффективной функции разными способами. См., например, патент США № 6737056В1 и публикацию заявки на патент США № 2004/0132101A1, в которых описаны Fc-мутации, оптимизирующие связывание антитела с Fc-рецепторами.

Варианты эталонного антитела, например антагонистического антитела против CD40, предпочтительно содержат аминокислотные последовательности, которые по крайней мере на 70% или 75%, предпочтительно по крайней мере на 80% или 85%, более предпочтительно по крайней мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94% или 95% идентичны аминокислотной последовательности эталонного антитела, например молекуле антагонистического антитела против CD40, в частности моноклональному антителу CHIR-12.12 по настоящему изобретению, или более короткой части молекулы эталонного антитела. Более предпочтительно молекулы характеризуются по крайней мере 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательностей. В соответствии с целями настоящего изобретения процентную идентичность последовательностей определяют при помощи алгоритма поиска гомологии Смита-Ватермана с выявлением подобных пробелов и наложением штрафа за открытый пробел в 12 очков и штрафа за удлинение пробела в 2 очка с использованием матрицы BLOSUM из 62 очков. Алгоритм поиска гомологии Смита-Ватермана описан в публикации Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489. Вариант может отличаться от эталонного антитела, например антагонистического антитела против CD40, 1-15 аминокислотными остатками, 1-10 аминокислотными остатками, например, 6-10, 5, 4, 3, 2 или даже 1 аминокислотным остатком.

Что касается оптимального совмещения двух аминокислотных последовательностей, то смежный сегмент вариантой аминокислотной последовательности может иметь дополнительные аминокислотные остатки или удаленные аминокислотные остатки по сравнению с эталонной аминокислотной последовательностью. Смежный сегмент, используемый для сравнения с эталонной аминокислотной последовательностью, должен включать по крайней мере 20 смежных аминокислотных остатков и может содержать 30, 40, 50 или более аминокислотных остатков. Может быть поизведена коррекция идентичности последовательностей, связанная с заменами консервативных остатков или пробелами (см. алгоритм поиска гомологии Смита-Ватермана).

Точная химическая структура полипептида, способного специфически связывать CD40 и сохранять антагонистическую активность, в частности, при связывании с антигеном CD40 на раковых В-клетках, зависит от ряда факторов. Так как в молекуле присутствуют ионизируемые аминогруппы и карбоксильные группы, то конкретный полипептид может быть получен в виде кислой или основной соли либо в нейтральной форме. В определение антагонистических антител против CD40 по настоящему изобретению входят все препараты, сохраняющие свою биологическую активность при нахождении в приемлемых окружающих условиях. Кроме того, главная аминокислотная последовательность полипептида может быть увеличена с образованием производной цепи благодаря использованию сахарных частей (гликозилирование) или других дополнительных молекул, таких как липиды, фосфат, ацетильные группы и тому подобные. Аминокислотная последовательность может быть также увеличена путем конъюгирования с сахаридами. Определенные аспекты такого увеличения достигаются при помощи посттрансляционных процессирующих систем продуцирующего хозяина; другие подобные модификации могут быть выполнены in vitro. В любом случае такие модификации входят в определение антитела против CD40 по настоящему изобретению, если не нарушаются антагонистические свойства антитела против CD40. Считается, что такие модификации могут оказывать количественное или качественное влияние на активность, усиливая или ослабляя активность полипептида, при выполнении разных анализов. Кроме того, отдельные аминокислотные остатки в цепи могут быть модифицированы окислением, восстановлением или другими методами, и полипептид может быть расщеплен для получения фрагментов, сохраняющих активность. Такие изменения, не нарушающие антагонистическую активность, не исключают полипептидную последовательность из определения представляющих интерес антител против CD40 по настоящему изобретению.

В данной области существуют всесторонние руководства по получению и применению полипептидных вариантов. При получении вариантов антитела против CD40 специалист в данной области может легко определить, какие модификации нуклеотидной или аминокислотной последовательности нативного белка позволят получить вариант, пригодный для использования в качестве терапевтически активного компонента фармацевтической композиции, используемой в способах по настоящему изобретению.

Антитело против CD40, пригодное для использования в способах по настоящему изобретению, предпочтительно обладает по крайней мере одной из нижеследующих биологических активностей in vitro и/или in vivo, включающих ингибирование секреции иммуноглобулина нормальными периферическими В-клетками человека, стимулируемыми Т-клетками; ингибирование выживания и/или пролиферации нормальных периферических В-клеток человека, стимулируемых CD40L-экспрессирующими клетками или растворимым лигандом CD40 (sCD40L); ингибирование выживания и/или пролиферации нормальных периферических В-клеток человека, стимулируемых Т-клетками Юрката; ингибирование “выживания” внутриклеточных сигналов, препятствующих апоптозу, в любой клетке, стимулируемой sCD40L или твердофазным CD40L; ингибирование трансдукции сигналов CD40 в любой клетке при лигировании с sCD40L или твердофазным CD40L; делецию, иммунологическую толерантность и/или индукцию толерантности CD40-несущих клеток-мишеней или клеток, несущих лиганды, родственные CD40, которые включают, не ограничиваясь ими, Т-клетки и В-клетки, индукцию размножения или активации CD4⁺CD25⁺ регуляторных Т-клеток (см., например, отторжение аллоантигенспецифической ткани донора под воздействием CD40-CD40L в публикации Maurik et al. (2002) J. Immunol. 169:5401-5404), цитотоксичность под воздействием любого механизма (который включает, не ограничиваясь ими, антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), комплементзависимую цитотоксичность (CDC), уменьшение пролиферации и/или апоптоза клеток-мишеней), модуляцию секреции цитокинов клеткой-мишенью и/или экспрессию молекулы на клеточной поверхности и их комбинации.

Такие биологически активные действия могут быть исследованы методами, рассмотренными в настоящем описании изобретения и описанными в предварительных заявках, озаглавленных “Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use”, поданных 4 ноября 2003 г., 26 ноября 2003 г. и 27 апреля 2004 г., в переданных заявках на патент США № 60/517337 (№ дела поверенного РР20107.001 (035784/258442), 60/525579 (№ дела поверенного РР20107.002 (035784/271525) и 60/565710 (№ дела поверенного РР20107.003 (035784/277214) и в международной заявке на патент № РСТ/US20004/037152 (№ дела поверенного РР20107.004 (035784/282916)), опубликованной как WO 2005/044854 и озаглавленной также “Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use”, поданной 4 ноября 2004 г., которые полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. См. также анализы, описанные в публикациях Schultze et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:8200-8204; Denton et al. (1998) Pediatr. Transplant. 2:6-15; Evans et al. (2000) J. Immunol. 164:688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49:17-22; Lederman et al. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:77-86; Coligan et al. (1991) Current Protocols in Immunology 13:12; Kwekkeboom et al. (1993) Immunology 79:439-444; и в патентах США № 5674492 и 5847082, которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

Типичным анализом для обнаружения антагонистических антител против CD40, специфичных к эпитопам антигена CD40, идентифицированным в настоящем описании изобретения, является “конкурентно-связывающий анализ”. Конкурентно-связывающие анализы являются серологическими анализами, при выполнении которых обнаруживают неизвестные вещества, которые подвергают количественному определению по их способности ингибировать связывание известного меченого лиганда со специфичным к нему антителом. Указанный анализ также определяется как конкурентно-ингибирующий анализ. В типичном конкурентно-связывающем анализе меченый полипептид CD40 осаждают антителами-кандидатами в образце, например в комбинации с моноклональными антителами, созданными против одного или нескольких эпитопов моноклональных антител по настоящему изобретению. Антитела против CD40, которые специфически взаимодействуют с представляющим интерес эпитопом, могут быть идентифицированы в результате исследования серии антител, полученных против белка CD40 или фрагмента указанного белка, содержащего определенный эпитоп представляющего интерес белка CD40. Например, для CD40 человека представляющими интерес эпитопами являются эпитопы, содержащие линейные и/или нелинейные аминокислотные остатки короткой изоформы CD40 человека (см. № доступа в банке генов GenBank NP_690593), показанные в SEQ ID NO:10 и кодированные последовательностью, показанной в SEQ ID NO:9; см. также № доступа в банке генов GenBank NM_152854) или аминокислотные остатки длинной изоформы CD40 человека (см. № доступа в банке генов GenBank № САА43045 и NP_001241, показанные в SEQ ID NO:12 и кодированные последовательностью, показанной в SEQ ID NO:11; см. № доступа в банке генов GenBank Х60592 и NM_001250). Альтернативно анализы конкурентного связывания с ранее идентифицированными приемлемыми антагонистическими антителами против CD40 могут быть использованы для отбора моноклональных антител, сравнимых с ранее идентифицированными антителами.

Антитела, используемые в таких иммуноанализах, могут быть мечеными или немечеными. Немеченые антитела могут быть использованы для агглютинации; меченые антитела могут быть использованы в целом ряде анализов с широким разнообразием меток. Обнаружение образования комплекса антитело-антиген между антителом против CD40 и представляющим интерес эпитопом можно облегчить путем присоединения к антителу обнаруживаемого вещества. Приемлемые средства обнаружения включают использование меток, таких как радиоактивные изотопы, ферменты, коферменты, флуоресцентные вещества, хемилюминесцентные вещества, хромогены, ферментные субстраты или кофакторы, ингибиторы ферментов, комплексы с искусственно введенными группами, свободные радикалы, частицы, красители и тому подобные. Примеры приемлемых ферментов включают пероксидазу из хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры приемлемых комплексов с искусственно введенными группами включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры приемлемых флуоресцентных веществ включают умбеллиферон, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, дихлортриазиниламинофлуоресцеин, данзилхлорид или фикоэритрин; примером люминесцентного вещества является люминол; примеры биолюминесцентных веществ включают люциферазу, люциферин и экворин; и примеры приемлемых радиоактивных веществ включают ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S или ³Н. Такие меченые реагенты могут быть использованы при выполнении разных хорошо известных анализов, таких как радиоиммуноанализы, ферментные иммуноанализы, например ELISA, флуоресцентные иммуноанализы и тому подобные. См., например, патенты США № 3766162, 3791932, 3817837 и 4233402.

Кроме того, можно создать антитело, обладающее повышенной активностью ADCC. В частности, карбоксиконцевая половина СН2-области имеет важное значение для ADCC, опосредуемой рецептором FcRIII. Так как СН2 и шарнирная области играют важную роль в эффекторных функциях, можно создать серию многодоменных антител, содержащих дополнительные СН2 и/или шарнирные области, и исследовать их в отношении любых изменений эффекторной активности (см. публикацию Greenwood, J., Gorman, S.D., Routledge, E.G., Lloyd, I.S. & Waldmann, H., Ther. Immunol. 1994 Oct; 1(5):247-55). Альтернативным подходом может быть параллельное создание дополнительных областей, например, в результате создания димеров путем введения цистеина в Н-цепь химерного Ig (см. публикацию Shopes B. (1992) J. Immunol. 1992 1; 148(9):2918-22). Кроме того, изменения, способствующие повышению активности ADCC, могут быть созданы путем введения мутаций в Fc-область (см., например, патент США № 6737056 В1), экспрессии клеток в линиях клеток с отсутствием фукозилтрансферазы (см., например, патент США № 2003/0115614) или введения других изменений в гликозилирование антитела (см., например, патент США № 6602684).

Настоящее изобретение позволяет эффективно лечить разные типы CD40-экспрессирующего рака и предраковые состояния, когда пациент является гомозиготным или гетерозиготным в отношении генотипа FcγRIIIa-158F.

В используемом здесь значении термин “антитело против CD20” означает любое антитело, которое специфически узнает антиген CD20 клеточной поверхности, включая поликлональные антитела, моноклональные антитела, одноцепочечные антитела и их фрагменты, такие как Fab, F(ab')₂, F_v и другие фрагменты, сохраняющие антигенсвязывающую функцию исходного антитела против CD20. Особый интерес в связи со способами по настоящему изобретению представляют антитела против CD20 или их антигенсвязывающие фрагменты, которые обладают свойствами связывания, присущими моноклональному антителу IDEC-C2B8 (Biogen IDEC Inc., Cambridge, MA).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела против CD40, используемые в способах по настоящему изобретению, оказывают более сильное терапевтическое действие, чем химерное моноклональное антитело против CD20 IDEC-C2B8, противоопухолевую активность которых исследуют, используя эквивалентные количества указанных антител в модели ксенотрансплантированной опухоли у мышей с использованием линий клеток лимфомы или миеломы человека. IDEC-C2B8 (IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, California; продаваемое под торговым названием Rituxan®, известным также как ритуксимаб) является химерным моноклональным антителом против CD20, содержащим константные области каппа-цепи IgG1 человека с вариабельными областями мыши, выделенными из моноклонального антитела против CD20 мыши, IDEC-2B8 (Reff et al. (1994) Blood 83:435-445). Препарат Rituxan® получил лицензию на лечение рецидивирующей В-клеточной низкодифференцированной или фолликулярной неходжкинской лимфомы (NHL). Открытие антител с более высокой терапевтической, в частности, противоопухолевой активностью по сравнению с препаратом Rituxan® может значительно улучшить методы лечения рака и предраковых состояний, таких как В-клеточные лимфомы, в частности В-клеточная неходжкинская лимфома.

Приемлемыми моделями ксенотрансплантированной опухоли у “голых” мышей являются модели с использованием линий клеток лимфомы Беркита человека, известных как клетки Намальвы и Дауди. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения анализ противоопухолевой активности в модели ксенотрансплантированной опухоли у “голых” мышей с использованием линии клеток лимфомы человека Дауди выполняют в соответствии с описанием, приведенным в примере 7. Стадийная модель ксенотрансплантированной опухоли у “голых” мышей с использованием линии клеток лимфомы Дауди позволяет более эффективно выявить терапевтическую эффективность данного антитела по сравнению с нестадийной моделью, так как в стадийной модели антитело начинают вводить только после того, как опухоль достигнет измеряемой величины. В нестадийной модели антитело начинают вводить обычно примерно через 1 день после инокуляции опухоли и до появления пальпируемой опухоли. Превосходство антитела по сравнению с препаратом Rituxan® (то есть наличие повышенной терапевтической активности) в стадийной модели является серьезным свидетельтвом того, что данное антитело обладает большей терапевтической эффективностью, чем Rituxan®. Кроме того, в модели Дауди CD20, являющийся мишенью для препарата Rituxan®, экспрессирован на клеточной поверхности в большем количестве, чем CD40.

Термин “эквивалентное количество” антитела против CD40 по настоящему изобретению и препарата Rituxan® означает одинаковую дозу в мг, вводимую с учетом массы тела. Таким образом, когда антитело против CD40 вводят в дозе 0,01 мг/кг массы тела мыши, используемой в модели опухоли, Rituxan® также вводят в дозе 0,01 мг/кг массы тела мыши. Аналогичным образом, когда антитело против CD40 вводят в дозе 0,1, 1 или 10 мг/кг массы тела мыши, используемой в модели опухоли, Rituxan® также вводят в дозе 0,1, 1 или 10 мг/кг массы тела мыши.

При введении в модель ксенотрансплантированной опухоли у “голых” мышей некоторые антитела против CD40 вызывают значительное уменьшение объема опухоли по сравнению с эквивалентным количеством препарата Rituxan®. Например, полностью человеческое моноклональное антитело CHIR-12.12 характеризуется, по крайней мере, 20% увеличением противоопухолевой активности по сравнению с активностью, наблюдаемой при введении эквивалентной дозы препарата Rituxan®, при исследовании в стадийной модели ксенотрансплантированной опухоли у “голой” мыши с использованием линии клеток лимфомы человека Дауди в соответствии с описанием, приведенным в примере 7, и увеличение противоопухолевой активности при выполнении данного анализа может достигать 50%-60%. Повышенная противоопухолевая активность антитела против CD40 по настоящему изобретению позволяет в большей степени уменьшить объем опухоли по сравнению с эквивалентной дозой препарата Rituxan® или индуцирует более полные реакции. Так, например, в зависимоти от продолжительности периода времени после инокуляции опухоли моноклональное антитело CHIR-12.12 может уменьшить объем опухоли примерно от одной трети до около половины по сравнению с эквивалентной дозой препарата Rituxan®.

Другим отличием эффективности антитела является измерение in vitro концентрации антитела, необходимой для достижения максимального лизиса опухолевых клеток in vitro в присутствии NK-клеток. Например, антитела против CD40 по настоящему изобретению обеспечивают максимальный лизис клеток Дауди при ЕС50 менее 1/2, предпочтительно 1/4 и наиболее предпочтительно 1/10 концентрации препарата Rituxan®. Подобный тип измерения описан также в примерах, приведенных в настоящем описании изобретения.

Антитела против CD40, преимуществом которых является значительно более высокая эффективность по сравнению с эквивалентными количествами препарата Rituxan® при выполнении вышеуказанных анализов, могут включать:

а) моноклональное антитело CHIR-12.12;

b) моноклональное антитело, продуцированное линией клеток гибридомы 12.12;

с) моноклональное антитело, содержащее аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из последовательности, показанной в SEQ ID NO:2, последовательности, показанной в SEQ ID NO:4, последовательности, показанной в SEQ ID NO:5, обеих последовательностей, показанных в SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4, и обеих последовательностей, показанных в SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:5;

d) моноклональное антитело, содержащее аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из последовательности, показанной в SEQ ID NO:1, последовательности, показанной в SEQ ID NO:3 и обеих последовательностей, показанных в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:3;

е) моноклональное антитело, которое связывается с эпитопом, способным связывать моноклональное антитело, продуцированное линией клеток гибридомы 12.12;

f) моноклональное антитело, которое связывается с эпитопом, включающим остатки 82-87 последовательности CD40 человека, показанной в SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8;

g) моноклональное антитело, которое связывается с эпитопом, включающим остатки 82-89 последовательности CD40 человека, показанной в SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8;

h) моноклональное антитело, которое конкурирует с моноклональным антителом CHIR-12.12 в конкурентно-связывающем анализе;

i) моноклональное антитело по предшествующему пункту а) или моноклональное антитело по любому из предшествующих пунктов с)- h), причем указанное антитело получают рекомбинантными мептодами; и

j) моноклональное антитело, которое является антигенсвязывающим фрагментом моноклонального антитела по любому из предшествующих пунктов а)-i), сохраняющим способность специфически связываться с антигеном CD40 человека.

Настоящее изобретение относится к способу идентификации пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, подлежащем лечению антителом против CD40, который включает:

а) идентификацию пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, ассоциированном с CD40-экспрессирующими клетками; и

b) определение у данного пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158 (V/V, V/F или F/F);

где указанный рак или предраковое состояние можно лечить антителом против CD40, если данный пациент-человек является гетерозиготным или гомозиготным в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F). Указанный рак или предраковое состояние может не поддаваться лечению ритуксимабом (Rituxan®).

После идентификации пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, подлежащем лечению антителом против CD40, данный пациент-человек может быть подвергнут лечению антителом против CD40. Указанный способ может включать последующую стадию (с) введения идентифицированному пациенту-человеку, гетерозиготному или гомозиготному в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F) терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40.

Указанный способ идентификации пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, подлежащем лечению антителом против CD40, может быть легко выполнен специалистом в данной области при помощи соответствующего диагностического набора. Указанный набор должен включать реагенты, пригодные для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158. Таким образом, настоящее изобретение относится также к набору для идентификации пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, подлежащем лечению антителом против CD40, который включает реагенты для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158.

Настоящее изобретение относится также к способу выбора терапии антителом для лечения пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, который включает:

а) идентификацию пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, ассоциированном с CD40-экспрессирующими клетками; и

b) определение у данного пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158 (V/V, V/F или F/F);

причем антитело против CD40 выбирают для лечения указанного рака или предракового состояния, если данный пациент-человек является гетерозиготным или гомозиготным в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F). Указанный рак или предраковое состояние может не поддаваться лечению ритуксимабом (Rituxan®).

После выбора терапии антителом против CD40 для лечения пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, данный пациент-человек может быть подвергнут лечению антителом против CD40. Указанный способ может включать последующую стадию (с) введения идентифицированному пациенту-человеку, гетерозиготному или гомозиготному в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F) терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40.

Указанный способ выбора терапии антителом для лечения пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, может быть также легко выполнен специалистом в данной области при помощи соответствующего диагностического набора. Указанный набор должен включать реагенты, пригодные для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158. Таким образом, настоящее изобретение относится также к набору для выбора терапии антителом для лечения пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, ассоциированном с CD40-экспрессирующими клетками, который включает реагенты для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158.

Термин “подлежащий лечению антителом против CD40” означает, что пациент-человек (то есть человек, страдающий раком или находящийся в предраковом состоянии) при лечении антителом против CD40 должен получить пользу от “положительной терапевтической реакции” (в соответствии с определением, приведенным в настоящем описании изобретения) в отношении рака или предракового состояния, являющегося целью лечения.

В объем настоящего изобретения входит любой способ определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158 с использованием биологического образца, полученного у данного пациента-человека.

Например, настоящее изобретение относится к набору для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158, который включает микроматрицу, содержащую по крайней мере один зонд длиной 10 или более нуклеотидов, последовательность которого пригодна для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158. Меченую РНК или ДНК гибридизируют к комплементарными зондами в матрице и детектируют путем лазерного сканирования. Определяют интенсивность гибридизации для каждого зонда в матрице и полученный результат преобразуют в количественное значение, показывающее относительные уровни экспрессии гена. Квалифицированный специалист может легко выбрать последовательности и длины зондов. Известна нуклеотидная последовательность гена и мРНК человека, кодирующая аллотипы F и V FcγRIIIa-158. Таким образом, квалифицированный специалист может выбрать зонды, которые в соответствующих экспериментальных условиях позволяют определить генотип FcγRIIIa-158 последовательностей-мишеней.

Методы механического синтеза указанных матриц описаны, например, в патенте США № 5384261, который полностью включен в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Несмотря на то, что предпочтительной является планарная поверхность матрицы, указанная матрица может быть создана на поверхности практически любой формы или даже на большом числе поверхностей. Матрицы могут представлять собой пептиды или нуклеиновые кислоты на гранулах, гелях, полимерных поверхностях, волокнах, таких как оптическое волокно, стекле или любом другом приемлемом субстрате; см. патенты США № 5770358, 5789162, 5708153, 6040193 и 5800992, которые полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Матрицы могут быть упакованы с возможностью диагностики или выполнения других манипуляций с универсальным устройством. См., например, патенты США № 5856174 и 5922591, которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

Например, настоящее изобретение относится также к набору для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158, который включает олигонуклеотиды, пригодные для использования в качестве праймеров в катализируемой полимеразой амплификации области гена или мРНК, кодирующей аминокислоту 158 FcγRIIIa. Квалифицированный специалист может легко выбрать последовательности и длины праймеров. Известна нуклеотидная последовательность гена или мРНК человека, кодирующей аллотипы F и V FcγRIIIa-158. Таким образом, квалифицированный специалист может выбрать праймеры, которые в соответствующих экспериментальных условиях, позволяют амплифицировать область гена или мРНК, кодирующую аминокислоту 158 FcγRIIIa. Амплифицированная последовательность затем может быть секвенирована известными методами для определения у пациента генотипа FcγRIIIa-158.

Другим методом определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158 является метод на основе нуклеиновой кислоты, позволяющий обнаружить фрагментацию ДНК, присущую генотипу FcγRIIIa-158 пациента-человека. После разделения методом электрофореза в агарозном геле ДНК каждого генотипа FcγRIIIa-158 имеет характерный паттерн. Таким образом, настоящее изобретение относится также к набору для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158, который включает один или несколько рестрикционных ферментов, пригодных для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158. В данной области известны приемлемые рестрикционные ферменты (см., например, публикацию Koene et al. (1997) Blood 90(3):1109-1114).

Наборы по настоящему изобретению могут также включать инструкции с указаниями по применению данного набора для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158. Указанный набор может также включать, например, буфер, консервант или агент, стабилизирующий белок. Каждый компонент набора обычно находится в отдельном контейнере, и все контейнеры помещены в одну упаковку с инструкциями по применению указанного набора для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158.

Настоящее изобретение относится к использованию антител против CD40 для производства лекарственных средств, предназначенных для лечения рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками, в соответствии с настоящим описанием изобретения.

Антитела против CD40 по настоящему изобретению вводят в концентрации, которая является терапевтически эффективной для предотвращения или лечения рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками. Для достижения указанной цели антитела могут быть получены с использованием разных приемлемых носителей и/или наполнителей, известных в данной области. Антитело против CD40 можно вводить парентерально. Антитела обычно вводят в виде внутривенной или подкожной инъекции. Специалисту в данной области должны быть известны такие способы введения.

Внутривенное введение предпочтительно выполняют путем вливания в течение периода времени от около 1 часа до примерно 10 часов (менее 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 часов). Последующие вливания могут быть произведены в течение периода времени от менее 1 часа до около 6 часов, в том числе, например, от около 1 часа до около 4 часов, от около 1 часа до около 3 часов, от около 1 до около 2 часов или менее одного часа. Альтернативно доза может быть введена подкожно.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению должна соответствовать предполагаемому способу введения. Растворы или суспензии, используемые для парентерального введения, могут включать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций; физиологический раствор; антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатообразователи, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Значение рН может быть отрегулировано кислотами или основаниями, такими как хлористоводородная кислота или гидроксид натрия. Препарат для парентерального применения может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы и флаконы для многократного применения, изготовленные из стекла или пластика.

Антитела против CD40 обычно получают стандартным методом в фармацевтически приемлемом буфере, таком как, например, стерильный физиологический раствор, стерильная вода с буфером, комбинации вышеуказанных веществ и т.д. Методы получения парентерально вводимых средств описаны в публикации Remington's Pharaceutical Sciences (18^th ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania). См., также, например, публикацию WO 98/56418, в которой описаны фармацевтические препараты на основе стабилизированного антитела, которые пригодны для использования в способах по настоящему изобретению.

Квалифицированный специалист может легко определить количество по крайней мере одного вводимого антитела против CD40. Факторы, влияющие на способ введения и соответствующее количество по крайней мере одного антитела против CD40 включают, не ограничиваясь ими, тяжесть заболевания, историю болезни, возраст, рост, массу тела, состояние здоровья, тип заболевания и физическое состояние субъекта, подвергаемого лечению, или реакцию на введение антитела. Аналогичным образом количество вводимого антитела против CD40 зависит от способа введения и приема субъектом однократной дозы или многократных доз данного противоопухолевого средства. Как правило, подвергаемому лечению субъекту с большой массой тела предпочтительно вводят более высокую дозу антитела против CD40.

Однократная доза вводимого антитела против CD40 составляет от около 0,3 мг/кг до около 50 мг/кг, от около 0,1 мг/кг до около 40 мг/кг, от около 0,01 мг/кг до около 30 мг/кг, от около 0,1 мг/кг до около 30 мг/кг, от около 0,5 мг/кг до около 30 мг/кг, от около 1 мг/кг до около 30 мг/кг, от около 3 мг/кг до около 30 мг/кг, от около 3 мг/мг до около 25 мг/кг, от около 3 мг/кг до около 20 мг/кг, от около 5 мг/кг до около 15 мг/кг.

Так, например, доза может быть равна 0,3 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 1,5 мг/кг, 2 мг/кг, 2,5 мг/кг, 3 мг/кг, 5 мг/кг, 7 мг/кг, 10 мг/кг, 15 мг/кг, 20 мг/кг, 25 кг/кг, 30 мг/кг, 35 мг/кг, 40 мг/кг, 45 мг/кг, 50 мг/кг или другим таким дозам, находящимся в диапазоне от около 0,3 мг/кг до около 50 мг/кг.

Лечение субъекта терапевтически эффективным количеством антитела может включать одократное лечение или предпочтительно несколько последовательных лечений. Таким образом, другой вариант осуществления изобретения относится к способу, который включает введение нескольких доз антитела против CD40. Указанный способ может включать введение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 или более терапевтически эффективных доз фармацевтической композиции, содержащей антитело против CD40. Специалист в данной области может легко определить без ненужного экспериментирования частоту и продолжительноть введения многократных доз фармацевтических композиций, содержащих антитело против CD40. На протяжении всего курса лечения может быть использована одинаковая терапевтически эффективная доза антитела против CD40. Альтернативно на протяжении всего курса лечения могут быть использованы разные терапевтически эффективные дозы антитела против CD40.

В одном примере субъекту вводят антитело против CD40 в диапазоне от около 0,1 до 20 мг/кг массы тела один раз в неделю в течение примерно 1-10 недель, предпочтительно в течение примерно 2-8 недель, более предпочтительно в течение примерно 3-7 недель и еще предпочтительнее в течение примерно 4, 5 или 6 недель. Лечение может быть произведено с интервалами от 2 до 12 месяцев для предотвращения рецидива или при обнаружении рецидива. Кроме того, хорошие результаты дает увеличение или уменьшение эффективной дозы антитела, используемого для лечения, в течение конкретного курса лечения. Изменения дозы могут быть оценены по результатам диагностических анализов, рассмотренных в настоящем описании изобретения.

Так, в одном варианте осуществления изобретения схема введения включает первое введение терапевтически эффективной дозы по крайней мере одного антитела против CD40 в 1-й, 8-й, 15-й и 22-й день курса лечения.

В другом варианте осуществления изобретения схема введения включает ежедневное введение терапевтически эффективной дозы по крайней мере одного антитела против CD40 или введение в 1-й, 3-й, 5-й и 7-й день недели курса лечения; другая схема введения включает первое введение терапевтически эффективной дозы по крайней мере одного антитела против CD40 в 1-й и 3-4-й день недели курса лечения; и предпочтительный режим введения включает первое введение терапевтически эффективной дозы по крайней мере одного антитела против CD40 в 1-й день недели курса лечения. Курс лечения может продолжаться 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 6 месяцев или год. Курсы лечения могут быть последовательными или с перерывами в одну неделю, 2 недели, 1 месяц, 3 месяца, 6 месяцев или один год.

В других вариантах осуществления изобретения начальная терапевтически эффективная доза антитела против CD40 по настоящему изобретению может быть более низкой (то есть от около 0,3 мг/кг до около 20 мг/кг) и последующие дозы могут быть более высокими (то есть от около 20 мг/кг до около 50 мг/кг).

В альтернативных вариантах осуществления изобретения начальная терапевтически эффективная доза антитела против CD40 по настоящему изобретению может быть более высокой (то есть от около 20 мг/кг до около 50 мг/кг) и последующие дозы могут быть более низкими (то есть от 0,3 мг/кг до около 20 мг/кг). Так, в некоторых вариантах осуществления изобретения лечение антителом против CD40 может быть начато с введения нуждающемуся в лечении субъекту “ударной дозы” антитела. Термин “ударная доза” означает более высокую начальную дозу антитела против CD40, вводимую субъекту (то есть от около 20 мг/кг до около 50 мг/кг). “Ударную дозу” можно вводить однократно, например, в виде однократного внутривенного вливания антитела, или многократно, например, в виде нескольких внутривенных вливаний антитела до полного введения “ударной дозы” в течение примерно 24 часов. После введения “ударной дозы” субъекту вводят одну или несколько дополнительных терапевтически эффективных доз антитела против CD40. Последующие терапевтически эффективные дозы можно вводить, например, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели или один раз в четыре недели. В таких вариантах осуществления изобретения последующие терапевтически эффективные дозы обычно являются более низкими (то есть от 0,3 мг/кг до около 20 мг/кг).

Альтернативно в некоторых вариантах осуществления изобретения после введения “ударной дозы” последующие терапевтически эффективные дозы антитела против CD40 вводят в соответствии с “поддерживающей схемой введения”, которая предполагает введение терапевтически эффективной дозы антитела один раз в месяц, один раз в 6 недель, один раз в два месяца, один раз в 10 недель, один раз в три месяца, один раз в 14 недель, один раз в четыре месяца, один раз в 18 недель, один раз в пять месяцев, один раз в 22 недели, один раз в шесть месяцев, один раз в 7 месяцев, один раз в 8 месяцев, один раз в 9 месяцев, один раз в 10 месяцев, один раз в 11 месяцев или один раз в 12 месяцев. В таких вариантах осуществления изобретения терапевтически эффективные дозы антитела против CD40 являются более низкими (то есть от 0,003 мг/кг до окло 20 мг/кг), в частности, когда последующие дозы вводят через более короткие интервалы, например от одного раза в две недели до одного раза в месяц, или более высокими (то есть от около 20 мг/кг до около 50 мг/кг), в частности, когда последующие дозы вводят через более продолжительные интервалы, например от около одного месяца до около 12 месяцев.

Антитела против CD40, присутствующие в фармацевтических композициях, рассмотренных в настоящем описании изобретения и предназначенных для использования в способах по настоящему изобретению, могут быть природными или полученными рекомбинантными методами и могут быть выделены из любого источника, включающего млекопитающих, таких как, например, мышь, крыса, кролик, примат, свинья и человек. Такие полипептиды предпочтительно выделяют у человека, и более предпочтительно указанные полипептиды являются рекомбинантными белками человека, полученными из линий клеток гибридомы.

Фармацевтические композиции, пригодные для использования в способах по настоящему изобретению, могут содержать биологически активные варианты антагонистических антител против CD40 по настоящему изобретению, рассмотренные в настоящем описании изобретения.

В способах по настоящему изобретению может быть использована любая фармацевтическая композиция, содержащая в качестве терапевтически активного компонента антитело против CD40, обладающее свойствами связывания, рассмотренными в настоящем описании изобретения. Таким образом, жидкие, лиофилизованные или высушенные распылением композиции, содержащие одно или несколько антител против CD40, могут быть получены в виде водного или неводного раствора или суспензии для последующего введения субъекту в соответствии со способами по настоящему изобретению. Каждая из указанных композиций должна содержать по крайней мере одно антитело против CD40 в качестве терапевтически или профилактически активного компонента. Термин “терапевтически или профилактически активный компонент” означает антитело против CD40, специально введенное в композицию для достижения требуемой терапевтической или профилактической реакции на лечение, предотвращение или диагностику заболевания или состояния у субъекта при введении данной фармацевтической композиции указанному субъекту. Фармацевтические композиции предпочтительно содержат соответствующие стабилизирующие агенты, наполнители или те и другие вместе для сведения к минимуму проблем, связанных с утратой устойчивости белка и биологической активности в процессе получения и хранения.

В фармацевтические композиции, содержащие антитело против CD40 по настоящему изобретению, могут быть добавлены другие компоненты. Указанные компоненты могут включать, не ограничиваясь ими, масла, полимеры, витамины, углеводы, аминокислоты, соли, буферы, альбумин, поверхностно-активные вещества или наполнители. Углеводы предпочтительно включают сахар или сахарные спирты, такие как моно-, ди- или полисахариды, или водорастворимые глюканы. Сахариды или глюканы могут включать фруктозу, глюкозу, маннозу, сорбозу, ксилозу, мальтозу, сахарозу, декстран, пуллулан, декстрин, α- и β-циклодекстрин, растворимый крахмал, гидроксиэтилкрахмал и карбоксиметилцеллюлозу или их смеси. Термин “сахарный спирт” означает С₄-С₈ углерод, содержащий гидроксильную группу, который включает галактит, инозит, маннит, ксилит, сорбит, глицерин и арабит. Указанные сахара или сахарные спирты могут быть использованы отдельно или в комбинации. Концентрация сахара или сахарного спирта находится в пределах от 1,0% до 7% мас./об., более предпочтительно от 2,0% до 6,0% мас./об. Аминокислоты предпочтительно включают левовращающие (L) формы карнитина, аргинина и бетаина; однако могут быть добавлены и другие аминокислоты. Предпочтительные полимеры включают поливинилпирролидон (PVP) со средней молекулярной массой от 2000 до 3000 или полиэтиленгликоль (PEG) со средней молекулярной массой от 3000 до 5000. Поверхностно-активные вещества, которые могут быть добавлены в препарат, представлены в европейских патентах № 270799 и 268110.

Кроме того, антитела могут быть химически модифицированы путем ковалентной конъюгации с полимером, например, для увеличения периода полувыведения из кровотока. Предпочтительные полимеры и способы их присоединения к пептидам описаны в патентах США № 4766106, 4179337, 4495285 и 4609546, которые полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Предпочтительными полимерами являются полиоксиэтилированные полиолы и полиэтиленгликоль (PEG). Полиэтиленгликоль растворяется в воде при комнатной температуре и имеет общую формулу: R(O-CH₂-CH₂)_nO-R, где R может означать водород или защитную группу, такую как алкильная или алканоильная группа. Защитная группа предпочтительно содержит 1-8 атомов углерода и более предпочтительно означает метил. Символ n означает положительное целое число, предпочтительно от 1 до 1000, более предпочтительно от 2 до 500. Полиэтиленгликоль имеет предпочтительную среднюю молекулярную массу от 1000 до 40000, более предпочтительно от 2000 до 20000, наиболее предпочтительно от 3000 до 12000. Полиэтиленгликоль предпочтительно содержит, по крайней мере, одну гидроксильную группу, которая более предпочтительно является концевой гидроксильной группой. Указанная гидроксильная группа предпочтительно активируется для взаимодействия со свободной аминогруппой в ингибиторе. Однако очевидно, что тип и количество реакционноспособных групп может изменяться для получения ковалентно конъюгированного PEG/антитела по настоящему изобретению.

Водорастворимые полиоксиэтилированные полиолы также могут быть использованы в настоящем изобретении. Указанные полиолы включают полиоксиэтилированный сорбит, полиоксиэтилированную глюкозу, полиоксиэтилированный глицерин (POG) и тому подобные. Одной причиной использования таких полиолов является то, что глицериновый остов полиоксиэтилированного глицерина соответствует остову в природных моно-, ди- и триглицеридах животных и человека. Поэтому такая разветвленная цепь не обязательно будет признана чужеродной в организме. POG имеет такую же предпочтительную молекулярную массу, что и PEG. Структура POG представлена в публикации Knauf et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:15064-15070, и конъюгаты POG/IL-2 рассмотрены в патенте США № 4766106, которые полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

Другой системой доставки лекарственного средства, обеспечивающей более продолжительный период полувыведения из кровотока, являются липосомы. Методы получения липосомных систем доставки описаны в публикациях Gabizon et al. (1982) Cancer Research 42:4734; Cafiso (1981) Biochem. Biophys. Acta 649:129; и Szoka (1980) Ann. Rev. Biophys. Eng. 9:467. В данной области известны другие системы доставки лекарственных средств, которые описаны, например, в публикациях Poznansky et al. (1980) Drug Delivery Systems (R.L. Juliano, ed., Oxford, N.Y.) pp. 253-315; Poznansky (1984) Pharm. Revs. 36:277.

Компоненты, вводимые в фармацевтическую композицию, должны обеспечивать устойчивость антитела против CD40. То есть антитело против CD40 должно сохранять физическую и/или химическую стойкость и оказывать требуемое биологическое действие, в частности одно или несколько вышеописанных антагонистических действий, которые включают, не ограничиваясь ими, ингибирование секреции иммуноглобулина нормальными периферическими В-клетками человека, стимулируемыми Т-клетками; ингибирование выживания и/или пролиферации нормальных периферических В-клеток человека, стимулируемых Т-клетками Юрката; ингибирование выживания и/или пролиферации нормальных периферических В-клеток человека, стимулируемых CD40L-экспрессирующими клетками или растворимым лигандом CD40 (sCD40L); ингибирование “выживания” внутриклеточных сигналов, препятствующих апоптозу, в любой клетке, стимулируемой sCD40L или твердофазным CD40L; ингибирование трансдукции сигнала CD40 в любой клетке при лигировании с sCD40L или твердофазным CD40L; и ингибирование пролиферации раковых В-клеток человека, как указано в настоящем описании изобретения.

В данной области известны методы контроля устойчивости белка. См., например, публикации Jones (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90; Lee, ed. (1991) Peptide and Protein Drug Delivery (Marcel Dekker, Inc., New York, New York); и анализы устойчивости, рассмотренные в настоящем описании изобретения. Устойчивость белка обычно измеряют при выбранной температуре в течение определенного периода времени. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения фармацевтический препарат, содержащий устойчивое антитело, обеспечивает устойчивость антитела против CD40 при хранении при комнатной температуре (около 25°С) в течение по крайней мере 1 месяца, по крайней мере 3 месяцев или по крайней мере 6 месяцев и/или устойчивость при температуре около 2-8°С в течение по крайней мере 6 месяцев, по крайней мере 9 месяцев, по крайней мере 12 месяцев, по крайней мере 18 месяцев, по крайней мере 24 месяцев.

Считается, что белок, такой как антитело, введенный в фармацевтическую композиции, сохраняет физическую устойчивость в течение данного периода времени при отсутствии визуальных признаков (то есть обесцвечивание или помутнение) или измеряемых признаков (например, при помощи вытеснительной хроматографии (SEC) или УФ-сканирования) осаждения, агрегации и/или денатурации в данной фармацевтической композиции. Что касается химической устойчивости, то считается, что белок, такой как антитело, введенный в фармацевтическую коапозицию, сохраняет химическую устойчивость в течение данного периода времени, если измерения химической устойчивости показывают, что данный белок (то есть антитело) сохраняет представляющую интерес биологическую активность в данной фармацевтической композиции. В данной области хорошо известны методы контроля изменений химической устойчивости, которые включают, не ограничиваясь ими, методы обнаружения химически измененных форм белка, возникающих в результате расщепления, при помощи SDS-PAGE, SEC и/или лазерной десорбционной ионизации с помощью матрицы/времени масс-спектрометрии в видимой области; и разложения, обусловленного изменениями молекулярного заряда (например, вызванного деамидированием), при помощи ионообменной хроматографии. См., например, методы, рассмотренные в настоящем описании изобретения.

Считается, что антитело против CD40, введенное в фармацевтическую композицию, сохраняет требуемую биологическую активность в течение данного периода времени, если требуемая биологическая активность в указанное время составляет примерно 30%, предпочтительно примерно 20% от требуемой биологической активности, имевшей место во время получения фармацевтической композиции, при определении с помощью соответствующего анализа требуемой биологической активности. Анализы требуемой биологической активности антител против CD40 могут быть выполнены в соответствии с примерами, приведенными в настоящем описании изобретения. См. также анализы, описанные в публикациях Schultze et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:8200-8204; Denton et al. (1998)Pediatr. Transplant. 2:6-15; Evans et al. (2000) J. Immunol. 164:688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49:17-22; Lederman et al. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:77-86; Coligan et al. (1991) Current Protocols in Immunology 13:12; Kwekkeboom et al. (1993) Immunology 79:439-444; и патентах США № 5674492 и 5847082, которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело против CD40 вводят в жидкий фармацевтический препарат. Антитело против CD40 может быть получено любым методом, известным в данной области, включая рассмотренные выше методы. В одном варианте осуществления изобретения антитело против CD40 получают методом рекомбинантных ДНК в линии клеток СНО.

Антитело против CD40, которое подлежит хранению до приготовления препарата, может быть заморожено, например, при ≤-20°С и затем оттаяно при комнатной температуре для дальнейшего приготовления. Жидкий фармацевтический препарат содержит терапевтически эффективное количество антитела против CD40. Количество антитела, входящего в состав препарата, определяют в зависимости от способа введения и требуемой дозы.

Жидкая фармацевтическая композиция содержит антитело против CD40 в концентрации от около 0,1 мг/мл до около 50,0 мг/мл, от около 0,5 мг/мл до около 40,0 мг/мл, от около 1,0 мг/мл до около 30,0 мг/мл, от около 5,0 мг/мл до около 25,0 мг/мл, от около 5,0 мг/мл до около 20,0 мг/мл или от около 15,0 мг/мл до около 25,0 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция содержит антитело против CD40 в концентрации от около 0,1 мг/мл до около 5,0 мг/мл, от около 5,0 мг/мл до около 10,0 мг/мл, от около 10,0 мг/мл до около 15,0 мг/мл, от около 15,0 мг/мл до около 20,0 мг/мл, от около 20,0 мг/мл до около 25,0 мг/мл, от около 25,0 мг/мл до около 30 мг/мл, от около 30,0 мг/мл до около 35,0 мг/мл, от около 35,0 мг/мл до около 40,0 мг/мл, от около 40,0 мг/мл до около 45,0 мг/мл или от около 45,0 мг/мл до около 50 мг/мл. В других вариантах осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция содержит антитело против CD40 в концентрации около 15,0 мг/мл, около 16,0 мг/мл, около 17,0 мг/мл, около 18 мг/мл, около 19 мг/мл, около 20,0 мг/мл, около 21,0 мг/мл, около 22,0 мг/мл, около 23,0 мг/мл, около 24,0 мг/мл или около 25,0 мг/мл. Жидкая фармацевтическая композиция содержит антитело против CD40 и буфер, сохраняющий значение рН препарата в пределах от около рН 5,0 до около рН 7,0, включая рН около 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0 и другие значения в пределах от около рН 5,0 до около рН 7,0. В некоторых вариантах осуществления изобретения буфер сохраняет значение рН препарата в пределах от около рН 5,0 до около рН 6,5, от около рН 5,0 до около рН 6,0, от около рН 5,0 до около рН 5,5, от около рН 5,5 до около 7,0, от около рН 5,5 до около рН 6,5 или от около рН 5,5 до около рН 6,0.

В препарате может быть использован любой приемлемый буфер, сохраняющий значение рН жидкого препарата, содержащего антитело против CD40, в пределах от около рН 5,0 до около рН 7,0, при сохранении вышеуказанной физико-химической устойчивости и требуемой биологической активности антитела. Приемлемые буферы включают, не ограничиваясь ими, стандартные кислоты и их соли, в которых противоион может быть, например, ионом натрия, калия, аммония, кальция или магния. Примеры стандартных кислот и их солей, которые могут быть использованы в качестве буфера в фармацевтическом жидком препарате, включают, не ограничиваясь ими, янтарную кислоту или сукцинат, лимонную кислоту или цитрат, уксусную кислоту или ацетат, винную кислоту или тартрат, фосфорную кислоту или фосфат, глюконовую килоту или глюконат, глутаминовую кислоту или глутамат, аспарагиновую кислоту или аспартат, малеиновую кислоту или малеат, яблочную кислоту или малат. Концентрация буфера в препарате может составлять от около 1 мМ до около 50 мМ, в том числе около 1 мМ, 2 мМ, 5 мМ, 8 мМ, 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ, 25 мМ, 30 мМ, 35 мМ, 40 мМ, 45 мМ, 50 мМ, или равна другим подобным значениям в пределах от около 1 мМ до около 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения концентрация буфера в препарате составляет от около 5 мМ до около 15 мМ, в том числе около 5 мМ, 6 мМ, 7 мМ, 8 мМ, 9 мМ, 10 мМ, 11 мМ, 12 мМ, 13 мМ, 14 мМ, 15 мМ, или равна другим подобным значениям в пределах от около 5 мМ до около 15 мМ.

В некоторых вариантах осуществления изобретения жидкий фармацевтический препарат содержит терапевтически эффективное количество антитела против CD40 и сукцинатный или цитратный буфер в концентрации, сохраняющей значение рН препарата в пределах от около рН 5,0 до около рН 7,0, предпочтительно от около рН 5,0 до около рН 6,5. Термин “сукцинатный буфер” или “цитратный буфер” означает буфер, содержащий соответственно соль янтарной кислоты или соль лимонной кислоты. В предпочтительном варианте осуществления изобретения сукцинатный или цитратный противоион является катионом натрия, и, таким образом, буфер является соответственно сукцинатом натрия или цитратом натрия. Однако считается, что любой катион является эффективным. Другие возможные сукцинатные или цитратные катионы включают, не ограничиваясь ими, катионы калия, аммония, кальция и магния. Как было указано выше, концентрация сукцинатного или цитратного буфера в препарате может составлять от около 1 мМ до около 50 мМ, в том числе около 1 мМ, 2 мМ, 5 мМ, 8 мМ, 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ, 25 мМ, 30 мМ, 35 мМ, 40 мМ, 45 мМ, 50 мМ, или может быть равна другим подобным значениям в пределах от около 1 мМ до около 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения концентрация буфера в препарате составляет от около 5 мМ до около 15 мМ, в том числе около 5 мМ, 6 мМ, 7 мМ, 8 мМ, 9 мМ, 10 мМ, 11 мМ, 12 мМ, 13 мМ, 14 мМ или около 15 мМ. В других вариантах осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция содержит антитело против CD40 в концентрации от около 0,1 мг/мл до около 50 мг/мл или от около 5,0 мг/мл до около 25,0 мг/мл и сукцинатный или цитратный буфер, например, сукцинат натрия или цитрат натрия, в концентрации от около 1 мМ до около 20 мМ, от около 5 мМ до около 15 мМ, предпочтительно около 10 мМ.

Если желательно, чтобы жидкий фармацевтический препарат, содержащий антитело против CD40 и буфер, был почти изотоническим раствором, в него может быть добавлен агент, сообщающий изотоничность, в количестве, достаточном для получения почти изотонического препарата. Термин “почти изотонический” означает водный препарат с осмотической концентрацией раствора от около 240 ммоль/кг до около 360 ммоль/кг, предпочтительно от около 240 до около 340 ммоль/кг, более предпочтительно от около 250 до около 330 ммоль/кг, еще предпочтительнее от около 260 до около 320 ммоль/кг, еще предпочтительнее от около 270 до около 310 ммоль/кг. В данной области известны методы определения изотоничности раствора. См., например, публикацию Setnikar et al. (1959) J. Am. Pharm. Assoc. 48:628.

Специалистам в данной области известны разные фармацевтически приемлемые растворимые вещества, используемые для обеспечения изотоничности в фармацевтических композициях. Агент, сообщающий изотоничность, может быть любым реагентом, способным довести осмотическое давление жидкого фармацевтического препарата по настоящему изобретению до значения, почти равного аналогичному показателю жидкости организма. Желательно использовать физиологически приемлемый агент, сообщающий изотоничность. Таким образом, жидкий фармацевтический препарат, содержащий терапевтически эффективное количество антитела против CD40 и буфер, может далее включать компоненты, сообщающие изотоничность, например хлорид натрия; аминокислоты, такие как аланин, валин и глицин; сахара и сахарные спирты (полиолы), включающие, не ограничиваясь ими, глюкозу, декстрозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, маннит, трегалозу, глицерин, сорбит и ксилит; уксусную кислоту, другие органические кислоты и их соли, и относительно небольшие количества цитратов или фосфатов. Специалисту в данной области должны быть известны дополнительные агенты, приемлемые для достижения оптимальной тоничности жидкого препарата.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения жидкий фармацевтический препарат, содержащий антитело против CD40 и буфер, далее включает хлорид натрия в качестве агента, сообщающего изотоничность. Концентрация хлорида натрия в препарате зависит от сообщения тоничности другими компонентами. В некоторых вариантах осуществления изобретения концентрация хлорида натрия составляет от около 50 мМ до около 300 мМ, от около 50 мМ до около 250 мМ, от около 50 мМ до около 200 мМ, от около 50 мМ до около 175 мМ, от около 50 мМ до около 150 мМ, от около 75 мМ до около 175 мМ, от около 75 мМ до около 150 мМ, от около 100 мМ до около 175 мМ, от около 100 мМ до около 200 мМ, от около 100 мМ до около 150 мМ, от около 125 мМ до около 175 мМ, от около 125 мМ до около 150 мМ, от около 130 мМ до около 170 мМ, от около 130 мМ до около 160 мМ, от около 135 мМ до около 155 мМ, от около 140 мМ до около 155 мМ или от около 145 мМ до около 155 мМ. В одном таком варианте осуществления изобретения концентрация хлорида натрия равна примерно 150 мМ. В других таких вариантах осуществления изобретения концентрация хлорида натрия равна примерно 150 мМ, буфером является сукцинат натрия или цитрат натрия в концентрации от около 5 мМ до около 15 мМ, жидкий фармацевтический препарат содержит терапевтически эффективное количество антитела против CD40 и имеет значение рН от около рН 5,0 до около рН 7,0, от около рН 5,0 до около рН 6,0 или от около рН 5,5 до около рН 6,5. В других вариантах осуществления изобретения жидкий фармацевтический препарат содержит антитело против CD40 в концентрации от около 0,1 мг/мл до около 50,0 мг/мл или от около 5,0 мг/мл до около 25,0 мг/мл, примерно 150 мМ хлорида натрия и примерно 10 мМ сукцината натрия или цитрата натрия при рН около 5,5.

Разрушение белка вследствие замораживания и оттаивания или механического фрагментирования в процессе обработки жидких фармацевтических препаратов по настоящему изобретению можно предотвратить путем введения в препарат поверхностно-активных веществ для снижения поверхностного натяжения на поверхности раздела раствор - воздух. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения жидкий фармацевтический препарат содержит терапевтически эффективное количество антитела против CD40, буфер и поверхностно-активное вещество. В других вариантах осуществления изобретения жидкий фармацевтический препарат содержит антитело против CD40, буфер, агент, сообщающий изотоничность, и поверхностно-активное вещество.

Типичные поверхностно-активные вещества, используемые в настоящем изобретении, являются неионогенными поверхностно-активными веществами, включающими сложные эфиры полиоксиэтиленсорбита, такие как полисорбат 80 (твин 80) и полисорбат 20 (твин 20); сложные эфиры полиоксипропилена-полиоксиэтилена, такие как плюроник F68; полиоксиэтиленовые спирты, такие как Brij 35; симетикон; полиэтиленгликоль, такой как PEG400; лизофосфатидилхолин и полиоксиэтилен-п-трет-октилфенол, такой как тритон Х-100. Классическая стабилизация фармацевтических препаратов поверхностно-активными веществами или эмульгаторами описана, например, в публикации Levine et al. (1991) J. Parenteral Sci. Technol. 45(3): 160-165, которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Предпочтительным поверхностно-активным веществом, используемым при осуществлении настоящего изобретения, является полисорбат 80. Поверхностно-активное вещество, в случае его использования, обычно добавляют в количестве от около 0,001% до около 1,0% (мас/об), от около 0,001% до около 0,5%, от около 0,001% до около 0,4%, от около 0,001% до около 0,3%, от около 0,001% до около 0,2%, от около 0,005% до около 0,5%, от около 0,005% до около 0,2%, от около 0,01% до около 0,5%, от около 0,01% до около 0,2%, от около 0,03% до около 0,5%, от около 0,03% до около 0,3%, от около 0,05% до около 0,5% или от около 0,05% до около 0,2%.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения жидкий фармацевтический препарат содержит терапевтически эффективное количество антитела против CD40, буфер, являющийся сукцинатом натрия или цитратом натрия, в концентрации от около 1 мМ до около 50 мМ, от около 5 мМ до около 25 мМ или от около 5 мМ до около 15 мМ; имеет значение рН от около рН 5,0 до около рН 7,0, от около рН 5,0 до около рН 6,0 или от около рН 5,5 до около рН 6,5; и далее включает поверхностно-активное вещество, например, полисорбат 80, в количестве от около 0,001% до около 1,0% или от около 0,001% до около 0,5%. Такие препараты могут необязательно включать агент, сообщающий изотоничность, такой как хлорид натрия, в концентрации от около 50 мМ до около 300 мМ, от около 50 мМ до около 200 мМ или от около 50 мМ до около 150 мМ. В других вариантах осуществления изобретения жидкий фармацевтический препарат содержит антитело против CD40 в концентрации от около 0,1 мг/мл до около 50,0 мг/мл или от около 5,0 мг/мл до около 25,0 мг/мл, в том числе около 20,0 мг/мл; от около 50 мМ до около 200 мМ хлорида натрия, в том числе около 150 мМ хлорида натрия; сукцинат натрия или цитрат натрия в количестве от около 5 мМ до около 20 мМ, в том числе около 10 мМ сукцината натрия или цитрата натрия; хлорид натрия в концентрации от около 50 мМ до около 200 мМ, в том числе около 150 мМ; и необязательно поверхностно-активное вещество, например, полисорбат 80, в количестве от около 0,001% до около 1,0%, в том числе от около 0,001% до около 0,5%; при этом жидкий фармацевтический препарат имеет значение рН от около рН 5,0 до около рН 7,0, от около рН 5,0 до около рН 6,0, от около рН 5,0 до около рН 5,5, от около рН 5,5 до около рН 6,5 или от около рН 5,5 до около рН 6,0.

Жидкий фармацевтический препарат может по существу не содержать любых консервантов и других носителей, наполнителей или стабилизаторов, указанных выше. Альтернативно препарат может содержать один или несколько консервантов, таких как антибактериальные агенты, фармацевтически приемлемых носителей, наполнителей или стабилизаторов, приведенных выше, при условии, что они не оказывают вредного влияния на физико-химическую устойчивость антитела против CD40. Примеры приемлемых носителей, наполнителей и стабилизаторов включают, не ограничиваясь ими, дополнительные буферы, сорастворители, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота и метионин, хелатообразователи, такие как EDTA, комплексы металла (например, комплексы Zn-белок) и биологически разлагаемые полимеры, такие как сложные полиэфиры. Приготовление препаратов и выбор фармацевтически приемлемых носителей, стабилизаторов и изомолитов всесторонне рассмотрено в публикации Remington's Pharmaceutical Sciences (18^th ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990), которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

Термин “носители” в используемом здесь значении означает фармацевтически приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы, которые являются нетоксичными для клетки или млекопитающего в используемых дозах и концентрациях. Физиологически приемлемый носитель часто является водным раствором с буфером, регулирующим значение рН. Примеры физиологически приемлемых носителей включают такие буферы, как фосфат, цитрат, сукцинат и другие органические кислоты; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота; низкомолекулярные (менее примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, такие как глюкоза, манноза или декстрины; хелатообразователи, такие как EDTA; сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как твин, полиэтиленгликоль (PEG) и плюроник.

Введение “в комбинации с” одним или несколькими другими лекарственными средствами означает одновременное или последовательное введение в любом порядке.

Полученный жидкий фармацевтический препарат или другие фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть лиофилизованы для предотвращения разрушения. Специалистам в данной области известны методы лиофилизации жидких композиций. Композиция может быть восстановлена непосредственно перед применением при помощи стерильного разбавителя (такого как, например, раствор Рингера, дистиллированная вода или стерильный физиологический раствор), который может содержать дополнительные ингредиенты. Восстановленную композицию предпочтительно вводят субъектам способами, известными специалистам в данной области.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела против CD40 могут быть введены в комбинации, по крайней мере, с одной другой противораковой терапией, которая включает, не ограничиваясь ими, хирургическое вмешательство, лучевую терапию, химиотерапию, лечение цитокином или другим моноклональным антителом, предназначенным для использования при лечении представляющей интерес солидной опухоли, при этом дополнительную противораковую терапию проводят до, во время или после терапии антителом против CD40. Таким образом, если комбинированная терапия включает введение антитела против CD40 в комбинации с другим лекарственным средством при проведении химиотерапии, лечении цитокином или другим моноклональным антителом, способы по настоящему изобретению предполагают совместное введение с использованием раздельных препаратов или одного фармацевтического препарата и последовательное введение в любом порядке, при этом предпочтительно должен быть период времени, когда оба (или все) активные агенты одновременно оказывают терапевтическое действие. Когда способы по настоящему изобретению включают комбинированные схемы лечения, указанную терапию можно проводить одновременно с другой противораковой терапией, то есть антитело против CD40 вводят одновременно или в тех же временных рамках (то есть разные виды лечения выполняют одновременно, но антитело против CD40 необязательно вводят во время проведения другой противораковой терапии). Альтернативно антитело против CD40 по настоящему изобретению можно также вводить до или после другой противораковой терапии. Разные противораковые терапии могут быть выполнены последовательно независимо от реакции подвергаемого лечению субъекта на первый курс терапии, для уменьшения вероятности ремиссии или рецидива. Комбинированные терапии включают введение антитела против CD40 совместно с введением цитотоксического средства, причем антитело против CD40 предпочтительно вводят до введения цитотоксического средства.

Антитело против CD40 вводят в комбинации по крайней мере с одной другой противораковой терапией, которая включает, не ограничиваясь ими, хирургическое вмешательство или хирургические процедуры (например, спленэктомию, гепатэктомию, лимфаденэктомию, лейкофорез, трансплантацию костного мозга и тому подобные); лучевую терапию; химиотерапию, необязательно в комбинации с аутотрансплантатом костного мозга, при этом приемлемые химиотерапевтические средства включают, не ограничиваясь ими, флударабин или фосфат флударабина, хлорамбуцил, винкристин, пентостатин, 2-хлордезоксиаденозин (кладрибин), циклофосфамид, доксорубицин, преднизон и их комбинации, например, схемы введения с использованием антрациклина, такие как САР (циклофосфамид, доксорубицин и преднизон), СНОР (циклофосфамид, винкристин, преднизон и доксорубицин), VAD (винкристин, доксорубицин и дексаметазон), МР (мелфалан и преднизон) и другие цитотоксические и/или лекарственные средства, используемые в химиотерапии, такие как митоксантрон, даунорубицин, идарубицин, аспарагиназа и антиметаболиты, которые включают, не ограничиваясь ими, цитарабин, метотрексат, 5-фторурацилдекарбазин, 6-тиогуанин, 6-меркаптопурин и неларабин; терапию другими противораковыми моноклональными антителами (например, алемтузумаб (Campath®), другим антителом против CD52, направленно воздействующим на гликопротеин клеточной поверхности CD52 в раковых В-клетках; ритуксимаб (Rituxan®), полностью человеческое антитело HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, тозитумомаб/I-131 тозитумомаб (Bexxar®), ибритумомабтиуксетан (Zevalin®) или любое другое терапевтическое антитело против CD20, направленно воздействующее на антиген CD20 в раковых В-клетках; антитело против CD19 (например, МТ103, биспецифическое антитело); антитело против CD22 (например, гуманизированное моноклональное антитело эпратузумаб); бевацизумаб (Avastin®) или другое противораковое антитело, направленно воздействующее на эндотелиальный фактор роста сосудов человека; антитело против CD22, направленно воздействующее на антиген CD22 в раковых В-клетках (например, моноклональное антитело BL-22, токсин альфа-CD22); антитело α-М-CSF, направленно воздействующее на колониестимулирующий фактор макрофагов; антитела, направленно воздействующие на активатор рецептора ядерного фактора-каппа В (RANK) и его лиганда (RANKL), которые сверхэкспрессированы во множественной миеломе; антитело против CD23, направленно воздействующее на антиген CD23 в раковых В-клетках (например, IDEC-152); антитело против CD80, направленно воздействующее на антиген CD80 (например, IDEC-114); антитело против CD38, направленно воздействующее на антиген CD38 в раковых В-клетках; антитела, направленное воздействующие на рецепторы главного комплекса гистосовместимости класса II (антитела против МНС), экспрессированные на раковых В-клетках; другие антитела против CD40 (например, SGN-40), направленно воздействующие на антиген CD40 в раковых В-клетках; и антитела, направленно воздействующие на рецептор 1 индуцирующего апоптоз лиганда, родственный фактору некроза опухолей (TRAIL-R1) (например, агонистическое моноклональное антитело человека HGS-ETR1) и TRAIL-R2, экспрессированный в ряде солидных опухолей и опухолей гемопоэтического происхождения); терапию мелкомолекулярного рака, которая включает, не ограничиваясь ими, ингибиторы микротрубочек и/или топоизомеразы (например, митотический ингибитор доластатин и аналоги доластатина; тубулинсвязывающее средство Т900607; XL119 и ингибитор топоизомеразы аминокамптотецин), SDX-105 (гидрохлорид бендамустина), иксабепилон (аналог эпотилона, определяемый также как BMS-247550), ингибиторы протеинкиназы С, например, мидостаурин ((РКС-412, CGP 41251, N-бензоилстауроспорин), пиксантрон, элоксатин (противоопухолевое средство), ганит (нитрат галлия), Thalomid® (талидомид), иммуномодулирующие производные талидомида (например, ревлимид (ранее ревимид)), Affinitak^TM (антисмысловой ингибитор протеинкиназы С-альфа), SDX-101 (R-этодолак, индуцирующий апоптоз раковых лимфоцитов), аналоги нуклеозида пурина второго поколения, такие как клофарабин, ингибиторы продуцирования белка Bcl-2 раковыми клетками (например, антисмысловые средства облимерсен и Genasense®), ингибиторы протеосомы (например, Velcade^TM (бортезомиб)), мелкомолекулярные ингибиторы киназы (например, CHIR-258), мелкомолекулярные ингибиторы VEGF (например, ZD-6474), мелкомолекулярные ингибиторы хитшокового белка (HSP) 90 (например, 17-AAG), мелкомолекулярные ингибиторы гистондезацетилаз (например, гибрид/НРС полярной цитодифференцировки), такие как суберанилогидроксамовая кислота (SAHA) и FR-901228) и вызывающие апоптоз средства, такие как Trisenox® (триоксид мышьяка) и Xcytrin® (мотексафингадолиний); противораковая вакцинотерапия/ иммунотерапия, которая включает, не ограничивась ими, вакцины (например, Id-KLH, онкофаг, виталетин), индивидуальную иммунотерапию или активную иммунотерапию идиотипическими антителами (например, индивидуальную иммунотерапию MyVax®, официально именуемую GTOP-99), Promune® (CpG 7909, синтетический агонист toll-подобного рецептора 9 (TLR9), терапию альфа-интерфероном, терапию интерлейкином-2 (IL-2), терапию IL-12, терапию IL-15 и терапию IL-21; терапию стероидными средствами или другую противораковую терапию, при этом дополнительную противораковую терапию выполняют до, во время или после проведения терапии антагонистическим антителом против CD40.

В одном варианте осуществления изобретения антитела против CD40 вводят в комбинации с бортезомибом (VELCADE®), в частности, для лечения множественной миеломы. В публикации WO 2005/044855 A2 указано, что комбинированное лечение CHIR-12.12 вместе с бортезомибом повышает эффективность ингибирования роста опухоли в экспериментальных моделях множественной миеломы.

В одном варианте осуществления изобретения антитела против CD40 вводят в комбинации с IL-2, в частности, для лечения В-клеточной лимфомы. В публикации WO 2005/044294 A2 указано, что комбинированное лечение CHIR-12.12 вместе с IL-2 оказывает аддитивное противоопухолевое действие на опухоли Намальвы.

Таким образом, настоящее изобретение относится к использованию терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40 для приготовления лекарственного средства для лечения рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками у пациента-человека, гетерозиготного или гомозиготного в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F), причем введение указанного лекарственного средства координируют с проведением, по крайней мере, одной другой противораковой терапии.

Термин “координировать” означает, что лекарственное средство, содержащее антитело против CD40, используют до, во время или после лечения субъекта с применением, по крайней мере, одной другой противораковой терапии.

Настоящее изобретение относится также к использованию антитела против CD40 для приготовления лекарственного средства для лечения у пациента-человека рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками, причем указанный пациент-человек является гетерозиготным или гомозиготным в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F) и ранее был подвергнут лечению, по крайней мере, один другим противораковым средством.

Термин “предварительное лечение” означает, что субъект прошел один или несколько курсов противораковой терапии (то есть был подвергнут, по крайней мере, одной другой противораковой терапии) до введения лекарственного средства, содержащего антитело против CD40. В определение термина “предварительное лечение” входят субъекты, которые были подвергнуты по крайней мере одной другой противораковой терапии за 2 года, 18 месяцев, 1 год, 6 месяцев, 2 месяца, 6 недель, 1 месяц, 4 недели, 3 недели, 2 недели, 1 неделю, 6 дней, 5 дней, 4 дня, 3 дня, 2 дня или даже 1 день до начала лечения лекарственным средством, содержащим антитело против CD40. Необязательно, чтобы субъект прореагировал на предварительное противораковое лечение. Таким образом, субъект, принимающий лекарственное средство, содержащее антагонистическое антитело против CD40, мог прореагировать или не прореагировать (то есть рак не поддался лечению) на предварительное противораковое лечение, включающее несколько видов противораковой терапии. Примеры других противораковых терапий, которым может быть подвергнут субъект до введения лекарственного средства, содержащего антитело против CD40, включают, не ограничиваясь ими, хирургическое вмешательство, лучевую терапию, химиотерапию необязательно в комбинации с аутотрансплантацией костного мозга, с использованием приемлемых химиотерапевтических средств, которые включают, не ограничиваясь ими, средства, представленные в настоящем описании изобретения и в публикациях WO 2005/044854, WO 2005/044304, WO 2005/044305, WO 2005/044306, WO 2005/044855, WO 2005/044307 и WO 2005/044294; терапию другими противораковыми моноклональными антителами, которая включает, не ограничиваясь ими, противораковые антитела, представленные в настоящем описании изобретения и в публикациях WO 2005/044854, WO 2005/044304, WO 2005/044305, WO 2005/044306, WO 2005/044855, WO 2005/044307 и WO 2005/044294; противораковую терапию мелкомолекулярными средствами, которая включает, не ограничиваясь ими, мелкие молекулы, представленные в настоящем описании изобретении и в публикациях WO 2005/044854, WO 2005/044304, WO 2005/044305, WO 2005/044306, WO 2005/044855, WO 2005/044307 и WO 2005/044294; противораковую вакцинотерапию/ иммунотерапию, которая включает, не ограничиваясь ими, средства, представленные в настоящем описании изобретения и в публикациях WO 20005/044854, WO 2005/044304, WO 2005/044305, WO 2005/044306, WO 2005/044855, WO 2005/044307 и WO 2005/044294; терапию стероидными средствами; другую противораковую терапию или любую их комбинацию.

Термин “лечение” в контексте координированного применения антитела против CD40 вместе с одной или несколькими другими противораковыми терапиями означает введение антитела против CD40 или применение другой противораковой терапии для лечения пациента-человека, введение в ткань или линию клеток, выделенную у пациента-человека, в том случае, когда у пациента-человека обнаружено заболевание, симптом заболевания или предрасположенность к заболеванию, с целью лечения, облегчения, ослабления, изменения, излечивания, уменьшения интенсивности, улучшения динамики заболевания и воздействия на симптомы заболевания или предрасположенность к заболеванию. Термин “лечение” означает также применение или введение пациенту-человеку фармацевтической композиции, содержащей антитело против CD40, либо применение или введение фармацевтической композиции, содержащей антитело против CD40, в ткань или линию клеток, выделенную у пациента-человека, у которого обнаружено заболевание, симптом заболевания или предрасположенность к заболеванию, с целью лечения, облегчения, ослабления, изменения, излечивания, уменьшения интенсивности, улучшения динамики заболевания и воздействия на симптомы заболевания или предрасположенность к заболеванию.

В некоторых вариантах осуществления изобретения комбинированная терапия оказывает синергическое действие, усиливая терапевтический эффект, по сравнению с отдельно вводимыми лекарственными средствами. Термин “синергизм” служит для определения объединенного действия двух или более активных агентов, которое превышает сумму отдельных эффектов каждого активного агента. Таким образом, когда объединенное действие двух или более агентов вызывает “синергическое ингибирование” активности или процесса, например, роста опухоли, считается, что ингибирование активности или процесса превышает сумму ингибирующих эффектов каждого активного агента. Термин “синергический терапевтический эффект” означает терапевтический эффект, наблюдаемый в результате применения комбинации двух или более терапий, который (при измерении на основании любого из ряда параметров) превышает сумму отдельных терапевтических эффектов, достигаемых при применении отдельных терапий.

Разные объекты и варианты осуществления настоящего изобретения далее более подробно описаны только на основании примеров. Возможны модификации изобретения, не выходящие за пределы объема изобретения.

Экспериментальный раздел

В приведенных ниже примерах использовано антитело против CD40 CHIR-12.12. Получение, секвенирование и исследование антитела CHIR-12.12 подробно описано в публикациях международных заявок на патент WO 2005/044854, WO 2005/044304, WO 2005/044305, WO 2005/044306, WO 2005/044855, WO 2005/044307 и WO 2005/044294. Линия клеток гибридомы 153.8Е2.D10.D6.12.12 (СМСС № 12056), экспрессирующих антитело CHIR-12.12, была депонирована в Американскую коллекцию типовых культур [ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209 (USA)] под номером патентного депозита РТА-5543.

Пример 1. Анализ ADCC в линиях клеток

Антитело CHIR-12.12 и ритуксимаб сравнивали в отношении их относительной активности ADCC против разных линий раковых В-клеток, экспрессирующих антигены CD40 и CD20, которые включают линии клеток лимфомы (Дауди, Намальвы), линии клеток множественной миеломы (ARH77, IM-9), линии клеток B-ALL (CCRF-SB) и линии клеток B-CLL (EHEB).

У антитела CHIR-12.12 и ритуксимаба сравнивали эффективность и активность ADCC соответственно в виде процентного значения максимального лизиса и ED50. Результаты указанных экспериментов показаны на фигурах 1А-1F. Во всех линиях клеток-мишений антитело CHIR-12.12 было более сильным и эффективным медиатором ADCC, чем ритуксимаб. В шести исследованных линиях клеток число молекул CD20 клеточной поверхности на одной клетке было в 2,6-30,8 раз больше, чем CD40. Полученные данные показывают, что несмотря на меньшее число молекул CD40 по сравнению с CD20, линии раковых В-клеток были более эффективно лизированы антителом CHIR-12.12, чем ритуксимабом.

Пример 2. Анализ ADCC в клетках пациентов, страдающих хроническим лимфолейкозом (CLL)

Было произведено сравнение относительной активности ADCC, вызываемой антителом CHIR-12.12 и ритуксимабом в клетках первичного CLL ex vivo, полученных у 8 субъектов. Антитело CHIR-12.12 вызывало большую ADCC, чем ритуксимаб против CLL всех пациентов (см. фигуру 2А-D и фигуру 3). Среднее процентное значение максимального лизиса, вызываемого антителом CHIR-12.12 и ритуксимабом, было равно соответственно 49±16% и 31±14%. Антитело CHIR-12.12 было сильнее ритуксимаба более чем в 10 раз при измерении значений ED₅₀ (14,1 пМ по сравнению с 155,5 пМ).

Эксперимент по измерению антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC)

Клетки-мишени: клетки субъектов, страдающих CLL, 5000/лунку. Эффектореные клетки: очищенные NK-клетки здорового человека, 50000/лунку. Отношение Е:Т: 10. Концентрация антител: 0,00001, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1 и 10 мкг/мл. Время инкубации: 4 часа. Культуральная среда; RPMI (без фенолового красного) + 10% FBS + 1% P/S. Устройство для культивирования: 96-луночный планшет с круглым основанием. Считывание данных: высвобождение АМ кальцеина, измеренное в виде произвольных единиц флуоресценции (AFU) с возбуждением 485 нм/эмиссией 535 нм. Вычисление: % специфического лизиса = 100 × (испытание в единицах AFU - спонтанное высвобождение 1 в единицах AFU)/(максимальное высвобождение 2 в единицах AFU - спонтанное высвобождение в единицах AFU). Отрицательный контрольный образец: кальцеин, высвобождаемый клетками-мишенями при отсутствии антитела или NK-клетки. Положительный контрольный образец: кальцеин, высвобождаемый клетками-мишенями в результате лизиса под воздействием детергента (1% NP40).

Результаты, приведенные на фигурах 2 и 3, показывают, что антитело CHIR-12.12 опосредует более высокую ADCC, чем ритуксимаб против клеток субъекта, страдающего CLL. Разница значений ADCC может зависеть от клеток-мишеней или донорских NK-клеток, но имела место во всех образцах субъектов. При исследовании клеток CLL, полученных у одного субъекта, с использованием NK-клеток двух разных доноров антитело CHIR-12.12 опосредовало большую ADCC, чем ритуксимаб, для NK-клеток обоих доноров, хотя величина дифференциальной ADCC не была идентичной (см. фигуру 4). Механистической основой для более высокой ADCC могут быть относительные уровни экспрессии антигенов-мишеней (CD20 и CD40), степень интернализации антитела и сродство антитела к рецептору FcγIIIa на NK-клетках. Поэтому было исследовано влияние указанных факторов на активность ADCC антитела CHIR-12.12 и ритуксимаба.

Пример 3. Количественное определение молекул CD40 и CD20 на клеточной поверхности

Количественное значение плотности CD20 и CD40 на клетках CLL (пример 3) и степень интернализации антитела (пример 4) определяли в качестве потенциальных причин вышеуказанной разницы в активности ADCC. Затем сравнивали относительную активность ADCC антитела CHIR-12.12 и ритуксимаба против первичных клеток CLL ex vivo, полученных у 9 субъектов. Антитело CHIR-12.12 вызывало более высокую ADCC, чем ритуксимаб, против CLL у всех субъектов (см. фигуру 2A-D и фигуру 3). Среднее процентное значение максимального лизиса под воздействием антитела CHIR-12.12 и ритуксимаба было соответственно равно 48±15% и 30±14%. Антитело CHIR-12.12 было более чем в 10 раз сильнее ритуксимаба при измерении значений ED₅₀ (13,2 пМ по сравнению с 147,2 пМ, фигура 6).

Более высокая активность ADCC и эффективность антитела CHIR-12.12 не зависела от более высокой плотности молекул CD40 на клеточной поверхности, так как число молекул CD20 было в 1,3-14 раз больше молекул CD40 на клеточной поверхности (см. фигуру 5 и фигуру 6).

Методы

Клетки предварительно инкубировали с IgG1 человека в количестве 1 мг/мл в буфере для окрашивания (PBS содержит 1% BSA, 0,1% азида натрия), чтобы блокировать сайты неспецифического связывания. Клетки инкубировали в течение 30 минут при 4°С (на льду). Затем добавляли меченное флуоресцином контрольное антитело изотипа IgG1 человека, меченное флуоресцином антитело CHIR-12.12 или меченный флуоресцином ритуксимаб в количестве 100, 10, 1, 0,1 мкг/мл и клетки инкубировали в течение 30 минут при 4°С (на льду). Клетки промывали буфером для окрашивания (PBS + 1% FBS + 0,1% азида натрия) и анализировали в клеточном сортере с возбуждением флуоресценции Calibur.

Геометрическое среднее интенсивности флуоресценции измеряли при помощи FACS. Молекулы эквивалентного растворимого фторохрома (MESF) вычисляли на основании стандартной кривой, построенной с использованием калиброванных меченных флуоресцином гранул.

Пример 4. Антитело CH12.12 не индуцирует интернализацию при связывании с CD40 в линиях клеток

Для оценки влияния связывания СН12.12 на интернализацию использовали линию клеток лимфомы Дауди и линию клеток множественной миеломы (ММ) ARH77. Клетки инкубировали с IgG1 человека (контрольное антитело) или СН12.12 в количестве 1 мкг/мл на льду (с 0,1% азида натрия для блокирования интернализации) или при 37°С (без азида натрия) в течение 3 часов. Клетки промывали холодным буфером для окрашивания (PBS + 1% BSA + 0,1% азида натрия) и окрашивали антителом козы против IgG человека, меченным флуоресцином, в течение 30 минут на льду. Геометрическое среднее интенсивности флуоресценции (MFI) измеряли в клеточном сортере с возбуждением флуоресценции Calibur. Не было обнаружено различия в MFI между клетками, инкубированными с СН12.12 на льду в присутствии азида натрия или при 37°С при отсутствии азида натрия (фигура 7). Полученные данные показывают, что антитело СН12.12 при связывании с CD40 не интернализируется и остается на клеточной поверхности.

Пример 5. Интернализация антитела CHIR-12.12 и ритуксимаба после связывания с клетками CLL субъекта: FACS и конфокальный микроскоп

Измерение при помощи конфокального микроскопа

Клетки инкубировали с антителом CHIR-12.12, ритуксимабом и IgG1, меченными Alexa 488 или флуоресцином, в количестве 10 мкг/мл в течение 3 часов при 40°С (с 0,1% азида натрия) или при 37°С (без азида натрия). Затем клетки промывали и фиксировали 2% формальдегидом в течение 5 минут при комнатной температуре. Клетки промывали и помещали на предметные стекла, сенсибилизированные поли-L-лизином, монтировали, герметизировали и аналировали методом конфокальной микроскопии.

Результаты

Результаты указанных экспериментов показаны на фигуре 8 (FACS) и фигурах 9 и 10 (конфокальный микроскоп). Результаты указанных экспериментов суммированы на фигуре 11. Исследования интернализации антител с использованием первичных клеток CLL и В-клеток, выполненные методом проточной цитометрии и конфокальной микроскопии, показывают, что при связывании с CD40 при 37°С антитело CHIR-12.12 остается однородно распределенным на клеточной поверхности даже через 3 часа. В отличие от этого после связывания при 37°С ритуксимаб перераспределяется в кэпы и интернализируется. Полученные данные позволяют предположить, что сильная активность ADCC антитела CHIR-12.12 может быть связана с его способностью однородно распределяться на поверхности клеток-мишеней, что обеспечивает оптимальное взаимодействие с эффекторными клетками. Полученные результаты позволяют предположить, что антитело CHIR-12.12 может эффективно опосредовать сильную ADCC против клеток CLL in vivo.

Пример 6. Анализ связывания FcγRIIIa ритуксаном и антителом CHIR-12.12 Biacore

Сродство аллелей aa158F и aa158V FcγRIIIa к антителу CHIR-12.12 и ритуксимабу сравнивали при помощи стандартного анализа Biacore®. Антитело CHIR-12.12 связывало аллель aa158F со сродством, которое было в 4,6 раза выше по сравнению с ритуксимабом (K_D 2,8 мкМ по сравнению с 13 мкМ). Результаты указанных экспериментов суммированы в следующей таблице:

	KD (нМ)
	CHIR-12.12	Ритуксимаб
FcγRIIIa 158V	492	466
FcγRIIIa 158F	2800	13000

Пример 7. Влияние полиморфизма FcγRIIIa на ADCC, вызываемую эффекторными NK-клетками

Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) является главным механизмом действия многих продаваемых и исследуемых моноклональных антител. Считается, что ADCC является одним из главных механизмов действия ритуксимаба (Rituxan®), продаваемого на рынке сбыта для лечения фолликулярной неходжкинской лимфомы (NHL) и активно действующего в других В-клеточных лейкозах. Установлено, что клиническая активность ритуксимаба в NHL соответствует генотипу FcγRIIIa. Субъекты с полиморфизмом V/V или V/F FcγRIIIa 158aa более восприимчивы к ритуксимабу, чем субъекты с F/F (см., например, публикации Carton et al. (Blood (2002), 99(3):754-758 или Dall'Ozzo et al. Cancer Res. (2004) 64:4664-4669).

При выполнении указанных экспериментов очищенные эффекторные NK-клетки, полученные у нескольких доноров, экспрессирующих разные полиморфизмы FcγRIIIa aa158, оценивали, используя линию клеток лимфомы Дауди человека в качестве клеток-мишеней (см. фигуры 12 и 13). Как показано на указанных фигурах, антитело CHIR-12.12 индуцировало сильную ADCC с NK-клетками всех трех генотипов. Значения ED₅₀ антитела CHIR-12.12 для лизиса линии клеток Дауди были соответственно равны 4, 2 и 0,4 пМ для F/F, V/F и V/V (фигура 13). Значения ED₅₀ ритуксимаба для лизиса линии клеток Дауди были соответственно равны 53, 21 и 9 пМ для F/F, V/F и V/V (фигура 13).

Очищенные эффекторные NK-клетки, полученные у нескольких доноров, экспрессирующих разные полиморфизмы FcγRIIIa aa158, оценивали, используя клетки CLL субъекта в качестве клеток-мишеней (см. фигуру 14). Было установлено, что антитело CHIR-12.12 является более сильным медиатором ADCC, чем ритуксимаб, против всех испытанных клеток CLL субъектов (фигура 14). Полученные данные позволяют предположить, что антитело CHIR-12.12 является более сильным медиатором ADCC, чем ритуксимаб, даже в случае NK-клеток генотипа V/F или F/F аа158.

Полученные данные являются весьма удивительными, так как следовало ожидать, что антитело CHIR-12.12 будет значительно менее сильным при выполнении анализов ADCC с использованием NK-клеток с полиморфизмом F/F или V/F FcγRIIIa 158aa, чем с V/V. Кроме того, было установлено, что клиническая активность ритуксимаба при лечении NHL соответствует генотипу FcγRIIIa. Субъекты с полиморфизмом V/V или V/F FcγRIIIa 158aa более восприимчивы к ритуксимабу, чем субъекты с F/F. Ритуксимаб является также моноклональным антителом IgG1, которое связывается с антигеном, экспрессированным на поверхности В-клеток, поэтому следует ожидать, что антитело CHIR-12.12 должно проявлять такое же предпочтение к полиморфизму FcγRIIIa-158 V. Наоборот, обнаружено, что антитело CHIR-12.12 вызывает сильную ADCC с NK-клетками всех трех генотипов.

Специалисту в данной области должны быть очевидны многие модификации и другие варианты осуществления изобретения по настоящему изобретению, характеризующиеся преимуществами, рассмотренными в приведенном выше описании изобретения и на прилагаемых чертежах. Поэтому должно быть понятно, что настоящее изобретение не ограничено конкретными описанными вариантами осуществления изобретения и что в объем прилагаемой формулы изобретения входят модификации и другие варианты осуществления изобретения. Несмотря на то что в описании изобретения использованы специальные термины, они являются только общими и описательными и не ограничивают настоящее изобретение.

Все публикации и заявки на патент, приведенные в настоящем описании изобретения, полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на патент была отдельно включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

1. Лекарственное средство, содержащее анти-CD40-антитело для применения в лечении рака или предракового состояния, ассоциированных с экспрессирующими CD40 клетками, у пациента-человека, гетерозиготного или гомозиготного в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F), где генотип CHIR-12.12-158F (V/V, V/F или F/F) указанного пациента-человека был определен с использованием биологического образца, полученного у указанного пациента-человека, и где указанное антитело выбрано из группы, состоящей из:
a) моноклонального антитела, которое связывается с эпитопом, способным связывать моноклональное антитело CHIR-12.12, продуцируемое гибридомной клеточной линией, депонированной АТСС в виде патентного депозита № РТА-5543,
b) моноклонального антитела, которое связывается с эпитопом, содержащим остатки 82-87 последовательности CD40 человека, показанной в SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:9, и
c) моноклонального антитела, которое конкурирует с моноклональным антителом CHIR-12.12, продуцируемым гибридомной клеточной линией, депонированной АТСС в виде патентного депозита № РТА-5543, в анализе конкурентного связывания.

2. Лекарственное средство по п.1, где указанный рак или предраковое состояние является раком В-клеточной линии дифференцировки.

3. Лекарственное средство по п.2, где указанный рак В-клеточной линии дифференцировки выбирают из группы, состоящей из острого лимфобластного лейкоза (ALL), хронического лимфолейкоза (CLL), пролимфоцитарного лейкоза (PLL), лейкоза малых лимфоцитов (SLL), волосатоклеточного лейкоза, болезни Ходжкина, множественной миеломы, макроглобулинемии Вальденстрема, болезни тяжелых цепей и лимфом, таких как диффузная лимфома малых лимфоцитов, фолликулярная лимфома, DLBCL, лимфома лимфоидной ткани слизистой оболочки, моноцитоидная В-клеточная лимфома, лимфома селезенки, лимфоматоидный гранулематоз, внутрисосудистый лимфоматоз, иммунобластная лимфома и СПИД-ассоциированная лимфома.

4. Лекарственное средство по п.1, где указанный рак или предраковое состояние является не-В-клеточной гематологической злокачественностью.

5. Лекарственное средство по п.4, где указанная не-В-клеточная гематологическая злокачественность является острым миелоцитарным лейкозом.

6. Лекарственное средство по п.1, где указанный рак или предраковое состояние является солидной опухолью.

7. Лекарственное средство п.6, где солидную опухоль выбирают из группы, состоящей из рака яичника, рака легкого (например немелкоклеточного рака легкого типа плоскоклеточного рака, аденокарциномы и крупноклеточного рака, и мелкоклеточного рака легкого), рака молочной железы, рака ободочной кишки, рака почки (включая, например, почечно-клеточные карциномы), рака мочевого пузыря, рака печени (включая, например, печеночно-клеточные карциномы), рака желудка, рака шейки матки, рака предстательной железы, рака носоглотки, рака щитовидной железы (например, папиллярной карциномы щитовидной железы), разных типов рака кожи, таких как меланома, и сарком, включающих, например, остеосаркомы и саркомы Юинга.

8. Лекарственное средство по п.1, где указанный рак или предраковое состояние является раком или предраковым состоянием, ассоциированным с клетками, экспрессирующими как CD40, так и CD20.

9. Лекарственное средство по п.8, где указанный рак или предраковое состояние является В-клеточной злокачественностью.

10. Лекарственное средство по п.1, где указанным антителом является моноклональное антитело CHIR-12.12, продуцируемое гибридомной клеточной линией, депонированной АТСС в виде патентного депозита № РТА-5543.

11. Лекарственное средство по п.1, где указанное антитело содержит: (i) остатки определяющей комплементарность области (CDR) SEQ ID NO:2 и (ii) остатки определяющей комплементарность области (CDR) SEQ ID NO:4.

12. Лекарственное средство по п.1, где указанным антителом является моноклональное антитело, содержащее аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO:2, (ii) SEQ ID NO:4, (iii) SEQ ID NO:5, (iv) SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4, и (v) SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:5.

13. Лекарственное средство по п.1, где указанное антитело выбрано из группы, состоящей из: (i) моноклонального антитела, содержащего последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:2, (ii) моноклонального антитела, содержащего последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:4, (iii) моноклонального антитела, содержащего последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:5, (iv) моноклонального антитела, содержащего последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:2, и последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:4, (v) моноклонального антитела, содержащего последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:2, и последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:5.

14. Лекарственное средство по п.1, где указанное антитело против CD40 является человеческим моноклональным антителом.

15. Лекарственное средство по п.14, где указанное человеческое моноклональное антитело против CD40 включает константную область тяжелой цепи IgGl человека.

16. Лекарственное средство по п.15, где указанная константная область тяжелой цепи IgGl человека включает аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5.

17. Лекарственное средство по любому из пп.1-16, где указанное антитело к CD40 связывается с CD40 человека с аффинностью (K_D) от, по меньшей мере, приблизительно 10^-6 М до, по меньшей мере, приблизительно 10^-12 М.

18. Лекарственное средство по любому из пп.1-16, где указанное антитело к CD40 связывается с FcγRIIIa-158V человека с аффинностью (K_D) по меньшей мере, приблизительно 0,5 мкМ и/или связывается с FcγRIIIa-158F человека с аффинностью (K_D) по меньшей мере, приблизительно 12 мкМ.

19. Лекарственное средство по любому из пп.1-16, где указанное моноклональное антитело продуцируется линией клеток СНО.

20. Лекарственное средство по любому из пп.1-16, где указанный пациент-человек не поддается терапии противораковым средством.

21. Лекарственное средство по любому из пп.1-16, где указанный пациент-человек не поддается терапии моноклональным антителом к CD20.

22. Лекарственное средство по п.19, где указанным моноклональным антителом к CD20 является ритуксимаб (ритуксан).

23. Лекарственное средство по любому из пп.1-16, где указанное антитело к CD40 опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) экспрессирующих CD40 клеток экспрессирующими FcγRIIIa-158 природными киллерными (NK) клетками пациента-человека.

24. Лекарственное средство по любому из пп.1-16, где указанное антитело к CD40 является более сильным, чем ритуксимаб (ритуксан), в анализе антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), где этот анализ предусматривает инкубирование экспрессирующих CD40 клеток и экспрессирующих CD20 клеток с выделенными природными киллерными (NK) клетками человека в присутствии релевантного антитела.

25. Лекарственное средство по любому из пп.1-16, где указанное антитело к CD40 является более сильным, чем ритуксимаб (ритуксан), в модели ксенотрансплантированной опухоли голой мыши.

26. Лекарственное средство, содержащее анти-CD40-антитело, для применения в ингибировании продукции антитела В-клетками у пациента-человека, гетерозиготного или гомозиготного в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F), где указанный генотип FcγRIIIa-158F (V/V, V/F или F/F) пациента-человека был определен с использованием биологического образца, взятого у указанного пациента-человека, и где указанное антитело к CD40 выбрано из группы, состоящей из:
a) моноклонального антитела, которое связывается с эпитопом, способным связывать моноклональное антитело CHIR-12.12, продуцируемое гибридомной клеточной линией, депонированной АТСС в виде патентного депозита № РТА-5543,
b) моноклонального антитела, которое связывается с эпитопом, содержащим остатки 82-87 последовательности CD40 человека, показанной в SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:9, и
c) моноклонального антитела, которое конкурирует с моноклональным антителом CHIR-12.12, продуцируемым гибридомной клеточной линией, депонированной АТСС в виде патентного депозита № РТА-5543, в анализе конкурентного связывания.

27. Лекарственное средство по п.26, где указанным антителом к CD40 является моноклональное антитело CHIR-12.12, продуцируемое гибридомной клеточной линией, депонированной АТСС в виде патентного депозита № РТА-5543.

28. Лекарственное средство по п.26, где указанное антитело содержит: (i) остатки определяющей комплементарность области (CDR) SEQ ID NO:2 или (ii) остатки определяющей комплементарность области (CDR) SEQ ID NO:4.

29. Лекарственное средство по п.26, где указанным антителом является моноклональное антитело, содержащее аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO:2, (ii) SEQ ID NO:4, (iii) SEQ ID NO:5, (iv) SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4, и (v) SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:5.

30. Лекарственное средство по п.26, где указанное антитело выбрано из группы, состоящей из: (i) моноклонального антитела, содержащего последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:2, (ii) моноклонального антитела, содержащего последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:4, (iii) моноклонального антитела, содержащего последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:5, (iv) моноклонального антитела, содержащего последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:2, и последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:4, (v) моноклонального антитела, содержащего последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:2, и последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:5.

31. Лекарственное средство по любому из пп.26-30, где указанное моноклональное антитело продуцируется в линии клеток СНО.

32. Способ идентификации пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, которого можно лечить антителом против CD40 и который не поддается лечению ритуксимабом (Riruxan®), который включает: определение генотипа FcγRIIIa-158 (V7V, V/F или F/F) пациента-человека, имеющего рак или предраковое состояние, которые ассоциированы с экспрессирующими CD40 клетками, и который не поддается лечению ритуксимабом (ритуксаном), с использованием биологического образца, полученного у этого пациента-человека, где в случае, если данный пациент-человек является гетерозиготным или гомозиготным в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F), указанный пациент идентифицируется как имеющий рак или предраковое состояние, поддающийся лечению антителом к CD40 и не поддающийся лечению ритуксимабом (ритуксаном), и где указанное антитело к CD40 выбрано из группы, состоящей из:
a) моноклонального антитела, которое связывается с эпитопом, способным связывать моноклональное антитело CHIR-12.12, продуцируемое гибридомной клеточной линией, депонированной АТСС в виде патентного депозита № РТА-5543,
b) моноклонального антитела, которое связывается с эпитопом, содержащим остатки 82-87 последовательности CD40 человека, показанной в SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:9, и
c) моноклонального антитела, которое конкурирует с моноклональным антителом CHIR-12.12, продуцируемым гибридомной клеточной линией, депонированной АТСС в виде патентного депозита № РТА-5543, в анализе конкурентного связывания.

33. Способ по п.32, где указанным антителом к CD40 является моноклональное антитело CHIR-12.12, продуцируемое гибридомной клеточной линией, депонированной АТСС в виде патентного депозита № РТА-5543.

34. Способ по п.32, где указанное антитело содержит: (i) остатки определяющей комплементарность области (CDR) SEQ ID NO:2 или (ii) остатки определяющей комплементарность области (CDR) SEQ ID NO:4.

35. Способ по п.32, где указанным антителом является моноклональное антитело, содержащее аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO:2, (ii) SEQ ID NO:4, (iii) SEQ ID NO:5, (iv) SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4, и (v) SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:5.

36. Способ по п.32, где указанное антитело выбрано из группы, состоящей из: (i) моноклонального антитела, содержащего последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:2, (ii) моноклонального антитела, содержащего последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:4, (iii) моноклонального антитела, содержащего последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:5, (iv) моноклонального антитела, содержащего последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:2, и последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:4, (v) моноклонального антитела, содержащего последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:2, и последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:5.

37. Способ по любому из пп.32-36, где указанное моноклональное антитело продуцируется в линии клеток СНО.

38. Способ выбора терапии антителом для лечения пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, который не поддается лечению ритуксимабом (Rituxan), который включает определение генотипа FcγRIIIa-158 (V/V, V/F или F/F) пациента-человека, имеющего рак или предраковое состояние, которые ассоциированы с экспрессирующими CD40 клетками, и который не поддается лечению ритуксимабом (ритуксаном), с использованием биологического образца, полученного у этого пациента-человека, где в случае, если указанный пациент-человек является гетерозиготным или гомозиготным в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F), для лечения указанного рака или предракового состояния выбирают антитело против CD40, и где указанное антитело выбрано из группы, состоящей из:
a) моноклонального антитела, которое связывается с эпитопом, способным связывать моноклональное антитело CHIR-12.12, продуцируемое гибридомной клеточной линией, депонированной АТСС в виде патентного депозита № РТА-5543,
b) моноклонального антитела, которое связывается с эпитопом, содержащим остатки 82-87 последовательности CD40 человека, показанной в SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:9, и
c) моноклонального антитела, которое конкурирует с моноклональным антителом CHIR-12.12, продуцируемым гибридомной клеточной линией, депонированной АТСС в виде патентного депозита № РТА-5543, в анализе конкурентного связывания.

39. Способ по п.38, где указанным антителом к CD40 является моноклональное антитело CHIR-12.12, продуцируемое гибридомной клеточной линией, депонированной АТСС в виде патентного депозита № РТА-5543.

40. Способ по п.38, где указанное антитело содержит: (i) остатки определяющей комплементарность области (CDR) SEQ ID NO:2 или (ii) остатки определяющей комплементарность области (CDR) SEQ ID NO:4.

41. Способ по п.38, где указанным антителом является моноклональное антитело, содержащее аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO:2, (ii) SEQ ID NO:4, (iii) SEQ ID NO:5, (iv) SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4, и (v) SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:5.

42. Способ по п.38, где указанное антитело выбрано из группы, состоящей из: (i) моноклонального антитела, содержащего последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:2, (ii) моноклонального антитела, содержащего последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:4, (iii) моноклонального антитела, содержащего последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:5, (iv) моноклонального антитела, содержащего последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:2, и последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:4, (v) моноклонального антитела, содержащего последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:2, и последовательности вариабельной и константной области, показанные в SEQ ID NO:5.

43. Способ по любому из пп.38-42, где указанное моноклональное антитело продуцируется в линии клеток СНО.