Штамм вируса гриппа для производства живой и инактивированной гриппозной вакцины

Авторы патента:

Александрова Галина Ибрагимовна (RU)

Смолоногина Татьяна Анатольевна (RU)

C12N7 - Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их (лекарственные препараты, содержащие вирусы A61K 35/76; получение лекарственных составов, содержащих вирусные антигены или антитела, например вакцин из вирусов A61K 39/00)

A61K39/145 - Orthomyxoviridae, например вирус гриппа

Владельцы патента RU 2464309:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" СЗО РАМН (RU)

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается штамма вируса гриппа. Представленный штамм A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2) получен методом генетической реассортации путем скрещивания апатогенного птичьего вируса A/перепел/Гонконг/6/97(H9N2) с холодоадаптированным температурочувствительным штаммом A/Ленинград/134/17/57(H2N2) - донором аттенуации. Полученный штамм депонирован в коллекции вирусов Научно-исследовательского института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под №2631 и может быть использован для производства живой интраназальной вакцины или инактивированной гриппозной. 3 табл.

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики гриппа, вызванного пандемически опасными вирусами гриппа птиц. Для производства интраназальной живой гриппозной вакцины (ЖГВ) или инактивированной гриппозной вакцины (ИГВ) предложен реассортантый штамм вируса гриппа A/перепел/Гонконг/97/84(H9N2)(Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus A).

Современная эпидемическая ситуация по гриппу характеризуется не только одновременной циркуляцией эпидемических вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и B, но и широким распространением вирусов птичьего гриппа подтипов A(H5N1), A(H7N3) и A(H9N2), способных инфицировать людей. Вирусы птичьего гриппа A(H9N2) обладают даже большим сродством к дыхательным путям человека, чем высокопатогенные вирусы подтипа A(H5N1). Необходимость разработки срочных противопандемических мер, в том числе и для борьбы с вирусами птичьего гриппа, отражена в приказе Минздрава РФ [Приказ №40 МЗ РФ РФ от 28.12.2004].

Применяемые в настоящее время для профилактики эпидемического гриппа A вакцины подтипов H1N1 и H3N2 не могут вызывать защитную реакцию в случае широкомасштабной вспышки, вызванной вирусами гриппа подтипа A(H9N2), к которым у подавляющего большинства населения нет иммунитета.

В настоящее время известен реассортантный штамм A/17/утка/Потсдам/86/92(H5N2) [Патент №2318871, опубл. 10.03.2008], предназначенный как для производства живой, так и инактивированной вакцины против птичьего гриппа подтипа Н5. Но он не может дать профилактический эффект в случае распространения вирусов гриппа подтипа A(H9N2).

За рубежом для производства ИГВ подтипа A(H9N2) был использован вирус гриппа A/Гонконг/1073/99(H9N2) антигенной линии G9 [Lancet. - 2003. - Vol. 362. - P.1959-1966]. Однако в процессе производства гриппозных вакцин на основе вирусов птичьего гриппа возникают трудности с накоплением вирусного материала в связи с высокой токсичностью подобных вирусов для куриных эмбрионов. Для создания высокоурожайных вакцинных штаммов применяют генетическую реассортацию с лабораторными штаммами, характеризующимися высокой репродуктивной активностью и безвредностью для человека.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма новой антигенной разновидности на основе холодоадаптированного донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2) с использованием в качестве источника поверхностных антигенов апатогенного вируса гриппа птиц A/перепел/Гонконг/6/97(H9N2), принадлежащего к антигенной линии G1.

Вакцинный штамм A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2) получен в развивающихся куриных эмбрионах (КЭ) методом классической генетической реассортации апатогенного птичьего вируса A/перепел/Гонконг/6/97(H9N2) с холодоадаптированным штаммом A/Ленинград/134/17/57(H2N2) с последующей селекцией в присутствии антисыворотки к донору аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2). Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) - холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1986. - С.66-83].

Применяемые в настоящее время вакцинные штаммы ЖГВ получают методом реассортации современных эпидемических вирусов с холодоадаптированными (XA) донорскими штаммами, в результате чего образуются реассортанты, имеющие смешанный геном. Гены, кодирующие гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального эпидемического штамма, а шесть генов внутренних и неструктурных белков (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) - от безвредного XA донора аттенуации. Из полученных реассортантов выбирают вакцинный кандидат с формулой генома 6:2, наиболее отвечающий требованиям антигенной специфичности, характерной для родительского вируса «дикого» типа, а также соответствующий признакам холодовой адаптации по способности к репродукции при пониженной температуре.

Анализ генома созданного вакцинного штамма был выполнен с использованием рестрикционного анализа ДНК-копий сегментов РНК, полученных с помощью обратно-транскриптазной полимеразно-цепной реакции (ОТ-ПЦР) [Klimov A.I. J. Virol. Method. - 1995. - №55. - P.445-446]. Полученные с помощью ОТ-ПЦР ДНК-копии сегментов РВ2, РВ1, PA, NP, M и NS обрабатывали соответственно эндонуклеазами рестрикции Tru9I, HindIII, BamHI, AsnI, EcoRI, PvuI, NciI соответственно. Дополнительно копии сегментов РВ1, PA и M были обработаны рестриктазами BstXI, AsnI и BciVI. Было показано, что сайты рестрикции в положениях нуклеотидной цепи, характерные для донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2), присутствуют в генах РВ2 (1459), PA (107 и 1045), NP (1066) и M (68 и 969). В то же время было установлено, что утрачены сайты рестрикции в генах РВ1 (819 и 975) и NS (798), что также характерно для донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2). Таким образом, было установлено, что реассортант A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2) унаследовал 6 генов негликозилированных белков от донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2) (формула генома 6:2). Принадлежность гемагглютинина родительскому штамму «дикого» типа A/перепел/Гонконг/6/97(H9N2) определяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Помимо этого было проведено прямое нуклеотидное секвенирование ДНК-копий генов. Штамм является температурочувствительным (разность титров при 33°C и 39°C-7,5 lg ЭИД₅₀/мл) и холодоадаптированным (разность титров при 33°C и 25°C-2,8 lg ЭИД₅₀/мл).

Таким образом, представленный вакцинный штамм A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму - антигенной специфичностью гемагглютинина вируса «дикого» типа A/перепел/Гонконг/6/97(H9N2), структурой генома, необходимой для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью, адаптацией к пониженной температуре культивирования, что коррелирует с аттенуацией, характерной для аттенуированного донорского штамма.

Штамм депонирован в коллекции Научно-исследовательского института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под №2631. Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛУЧЕННОГО ШТАММА.

Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33°C в течение 48 часов - 7,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:512

Паспорт на вакцинный штамм А/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2) прилагается (стр.5)

ПАСПОРТ ШТАММА

1. Название штамма - A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2)

2. Серия - серия 1.

3. Метод получения - реассортация; характеристика родительских вирусов:

а) апатогенный птичий вирус - A/перепел/Гонконг/6/97(H9N2)

б) донор аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2)

4. Количество пассажей - 7 в процессе реассортации

5. Характеристика штамма до лиофилизации:

а) оптимальные условия репродукции - 34°, 28-30 часов;

б) гемагглютинирующая активность 1:512;

в) инфекционная активность 9,3 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;

г) чувствительность к ингибиторам: ингибиторорезистентный;

д) разность в показателях инфекционной активности при 34°C и 40°C - 7,8 lg ЭИД₅₀/мл;

е) разность в показателях инфекционной активности при 34°C и 25°C - 2,8 lg ЭИД₅₀/мл;

ж) структура генома реассортанта:

- гены от апатогенного птичьего вируса - HA, NA

- гены от донора аттенуации - PA, РВ1, РВ2, NP, M, NS,

6. Характеристика штамма после лиофилизации:

а) дата лиофилизации: 20.12.2010 г.;

б) объем материала во флаконе: 1 мл;

в) количество доз в серии: 2

г) инфекционная активность - 8,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл

д) гемагглютинируюшая активность - 1:512

7. Рекомендуемое разведение при вакцинации 1:1

8. Антигенная специфичность:

а) гемагглютинина - идентичен вирусу A/перепел/Гонконг/6/97(H9N2) по данным РТГА с крысиной антисывороткой;

б) нейраминидазы - идентична вирусу A/перепел/Гонконг/6/97(H9N2) по данным секвенирования.

9. Безвредность для мышей при подкожном введении - безвреден.

10. Бактериологический контроль лиофилизированного материала: дата проведения - 25 декабря 2010 г. - стерилен.

11. Контроль на отсутствие посторонних вирусов - посторонние вирусы отсутствуют.

Результаты доклинических испытаний заявляемого штамма.

1. Штамм A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2) проявляет свойства температурочувствительности и холодовой адаптации при культивировании в куриных эмбрионах.

Пример. Полученные данные по репродуктивной активности кандидата в вакцинные штаммы в развивающихся куриных эмбрионах свидетельствовали о приобретении вирусом A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2) в результате реассортации ts- и ca-фенотипов, являющихся маркерами аттенуации (Табл. 1).

2. Штамм A/17/перепел/Гонконг/97/84(H91N2) безвреден для мышей при интраназальном и введении.

Пример. При интраназальном введении в дозе 6-7 lg ЕИД₅₀ реассортант был аттенуированным для мышей, репродуцируясь более эффективно в носовых ходах (3,5 lg ЕИД₅₀/мл), чем в легочной ткани (1,8 lg ЕИД₅₀/мл) (Табл.2).

3. Штамм A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2) иммуногенен при введении мышам в виде прототипа ЖГВ интраназально или прототипа ИГВ внутримышечно.

Пример. Оценка гуморального иммунного ответа в сыворотках подопытных животных проводилась через 28 дней после введения препаратов. В иммуноферментном анализе выявлено наличие в сыворотках мышей, иммунизированных реассортантом A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2), специфических иммуноглобулинов классов G и A (IgG и IgA) к вирусам подтипа H9N2 (Табл.3). Выработка локальных антител при интраназальном введении в виде прототипа ЖГВ была значительно выше по сравнению с парентеральным введением инактивированного антигена.

Таким образом, было показано, что реассортантный вакцинный штамм, содержащий HA апатогенного птичьего вируса гриппа A(H9N2), был безвредным и иммуногенным при введении мышам. Заявляемый вакциинный кандидат по результатам испытаний на мышах может быть рекомендован для получения как живой, так и инактивированной гриппозных вакцин, поскольку способен индуцировать иммунный ответ как при интраназальном введении в виде прототипа ЖГВ, так и парентерально в виде прототипа ИГВ. Использование для получения вакцинных штаммов непатогенных вирусов гриппа обеспечивает необходимый уровень безопасности не только при работе с уже готовыми реассортантами, но и в процессе их подготовки.

Таблица 1
Результаты изучения репродукции реассортанта A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2) и родительских вирусов различной температуре культивирования в куриных эмбрионах.
Вирус	Характеристика	Репродуктивная активность (m±δ) при температуре инкубации:
34°C	25°C	40°C
A/Ленинград/134/17/57(H2N2)	XA донорский штамм	9,5±0,3	7,3±0,2	1,5±0,0
A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2)	вакцинный кандидат	9,8±0,5	7±0,2	1,8±0,3
A/перепел/Гонконг/6/97(H9N2)	апатогенный вирус птичьего гриппа	8,6±0,3	1,5±0,0	9,2±0,2

Таблица 2
Результаты изучения безвредности реассортантного штамма A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2) при интраназальном введении мышам.
Место выделения вируса	Титры вируса (lg ЭИД₅₀/0,1 мл, m±δ на 3-й день после интраназального введения:
Лен17/Н9 (10⁶ЭИД₅₀)	Лен17/Н9 (10⁷ ЭИД₅₀)	Лен 17 (10⁶ ЭИД₅₀)	H9N2-дт (10⁶ ЭИД₅₀)
носовые ходы	1,1±0,3	3,8±0,2	2,5±0,3	1,8±0,5
легкие	1,5±0,0	1,5±0,0	2,3±0,5	4,9±0,5

Таблица 3
Выработка сывороточных и локальных антител после иммунизации мышей реассортантным вакцинным штаммом A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2) в виде ЖГВ или ИГВ.
Препарат	Сывороточные антитела	Локальные антитела
Препарат	РТГА (СГТ)	Тест микронейтрализации (СГТ)	ИФА, log₁₀ (m±δ)	ИФА, log₁₀ (m±δ)
lgG	lgA	lgG	lgA
Лен17/Н9-ЖГВ	5,0	9,1	2,7±0,6	2,9±0,2	1,6±0,9	2,6±0,7
Лен17/Н9-ИГВ	11,9	21,8	3,1±0,2	2,3±0,3	1,0±0,5	1,6±0,7
H9N2-дт	6,6	11,9	2,8±0,2	2,9±0,1	1,5±0,5	1,6±0,4
ИГВ+ЖГВ	11,5	13,2	2,6±0,1	2,5±0,4	1,4±0,5	1,5±0,8
ЖГВ+ИГВ	20,0	17,4	3,2±0,3	2,6±0,1	1,2±0,3	1,3±0,4
Контроль	5,0	10,0	2,2±0,6	2,2±0,5	1,0±0,0	1,0±0,0

Штамм вируса гриппа, депонированный в Государственной коллекции вирусов Научно-исследовательского института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН под №2631, используемый для производства живой интраназальной и производства инактивированной гриппозной вакцины.

Штамм вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота ephemerovirus bovinum для изготовления биопрепаратов для диагностики эфемерной лихорадки крупного рогатого скота // 2461391

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается штамма вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота (ВЭЛ КРС). .

Способ дифференциальной диагностики респираторных вирусных инфекций методом мультиплексной пцр с детекцией в режиме реального времени и перечень последовательностей для его осуществления // 2460803

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской вирусологии, молекулярной биологии и эпидемиологии. .

Селективная посттрансляционная модификация экспонируемых фагами полипептидов // 2459866

Изобретение относится к области биохимии и касается посттрансляционной модификации экспонируемых бактериофагом полипептидов. .

Способ диагностики хламидиоза, гарднереллеза, трихоманиаза, уреаплазмоза, микоплазмоза по составу равновесной газовой фазы над цервикальной слизью // 2458139

Изобретение относится к медицинским методам диагностики хламидиоза, гарднереллеза, трихоманиаза, уреаплазмоза, микоплазмоза по составу равновесной газовой фазы над цервикальной слизью и может быть использовано для определения наличия их возбудителей в пробе цервикальной слизи.

Способ стабилизации вируса ньюкаслской болезни для хранения в водном растворе и способ сохранения его стабильности // 2458125

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Вакцинный штамм вируса гриппа а(н3n2)-а/8/perth/16/2009 для производства инактивированной гриппозной вакцины // 2458124

Изобретение относится к медицинской биотехнологии. .

Вакцина против вирусной диареи крупного рогатого скота // 2457859

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота (ВД КРС). .

Способ репликации вируса в птичьих эмбриональных стволовых клетках // 2457253

Способы и композиции для экспрессии антисмысловой вирусной рнк в клетках собаки // 2457250

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой выделенную нуклеиновую кислоту, включающую регуляторную последовательность РНК-полимеразы I собаки и содержащую (i) по меньшей мере 250, или по меньшей мере 350, или по меньшей мере 450 соприкасающихся нуклеотидов или всю нуклеотидную последовательность, представленную в виде последовательности SEQ ID NO:26, (ii) полинуклеотид, который по меньшей мере на 80% идентичен указанной выше нуклеотидной последовательности (i) или включает комплементарную или обратно комплементарную (i) или (ii) последовательность.

Вакцинный штамм вируса гриппа а(н3n2)-а/8/perth/16/2009 для производства инактивированной гриппозной вакцины // 2458124

Изобретение относится к медицинской биотехнологии. .

Реассортант rem8 - вакцинный штамм вируса гриппа а подтипа н1n1 // 2457245

Изобретение относится к области вирусологии. .

Штамм а/salekhard/01/2009(h1n1)v вируса гриппа а субтипа h1n1 для исследования лечебной и профилактической эффективности препаратов против вируса гриппа // 2457242

Изобретение относится к области вирусологии. .

Штамм вируса гриппа а/russia/01/2009-ma субтипа h1n1 для исследования лечебной и профилактической активности противовирусных препаратов in vitro и in vivo // 2451072

Изобретение относится к штаммам вируса гриппа субтипа H1N1 и может быть использовано в медицинской вирусологии при изучении биологии вируса гриппа, а также при исследовании эффективности лечебных и профилактических препаратов против вируса гриппа.

Рекомбинантная вакцина против вируса "свиного" гриппа h1n1 и спсоб ее получения // 2451027

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и вирусологии. .

Штамм вируса гриппа а собак (варианты), иммуногенный полипептид, полинуклеотид, кодирующий его, вектор экспрессии полипептида, иммуногенная композиция, содержащая полипептид, и способ индукции иммунного ответа у животного // 2449014

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. .

Вакцина против гриппа и способ ее получения // 2446824

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности к способу получения гриппозной вакцины. .

Виросомы, включающие гемагглютинин, выделенный из вируса гриппа, полученного в линии клеток, композиции, содержащие указанные виросомы, способы изготовления и применение // 2441647

Штамм вируса гриппа a/herring gull/mongolia/454/08/ h13n8-субтипа, используемый при получении антигенсодержащего субстрата и сыворотки для диагностических целей // 2439149

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и микробиологии, а именно к штамму вируса гриппа H13N8 - субтипа. .

Способ продуцирования репликативной частицы вируса гриппа, композиция клеток (варианты), композиция клеточной культуры и ее применение // 2435855

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и медицины. .

Реассортантный штамм вируса гриппа а/17/новая каледония/99/76(h1n1) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины // 2464310

Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии и медицинской вирусологии