Средство, обладающее иммунокоррегирующим действием в условиях цитостатической иммуносупрессии
Владельцы патента RU 2482861:
Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии Сибирского отделения РАМН (НИИ фармакологии СО РАМН) (RU)
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России) (RU)
Изобретение относится к фармакологии, в частности к средству, обладающему иммунокоррегирующим действием на гуморальное звено иммунитета в условиях цитостатической иммуносупрессии. Средство, обладающее иммунокоррегирующим действием на гуморальное звено иммунитета в условиях цитостатической иммуносупрессии, которое представляет собой жидкий экстракт корней солодки (Radices Glycyrrhizae), полученный методом реперколяции с помощью 40% этанола при определенном соотношении сырье:экстрагент. Экстракт солодки проявляет иммунокоррегирующие свойства, что выражается в эффективном усилении подавленного циклофосфаном гуморального иммунного ответа. 1 табл., 1 пр.
Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средств, влияющих на иммунную систему.
В лечении онкологических заболеваний все большее распространение получает метод химиотерапии, основанный на применении различных цитостатических препаратов. Однако, обладая выраженным угнетающим действием на интенсивно делящиеся клеточные системы, эти лекарственные средства оказывают побочное токсическое влияние на иммунную систему, вызывая развитие иммунодефицитных состояний. В связи с этим актуальна проблема поиска корректоров нежелательных эффектов противоопухолевой терапии. При этом применение синтетических иммунокорректоров зачастую не является возможным из-за наличия собственного токсического действия. Из растительных препаратов, стимулирующих реакции иммунитета, наиболее известны препараты на основе эхинацеи пурпурной (иммунал, иммунорм, доктор Тайсс настойка эхинацеи) [4, 7]. Препараты иммунал и иммунорм содержат сок, полученный из свежесобранной травы цветущей эхинацеи пурпурной. Доктор Тайсс - содержит настойку листьев эхинацеи. Использование лекарственных растений представляется перспективным направлением дальнейшего развития, совершенствования методов иммунореабилитации, так как препараты природного происхождения не обладают токсическими свойствами, характерными для синтетических лекарственных средств, и не вызывают дисбаланса системы иммунитета [1, 2].
Задачей изобретения является расширение арсенала иммунокоррегирующих средств.
Поставленная цель достигается применением в качестве иммунокоррегирующего средства жидкого экстракта солодки, полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола, в соотношении 1:1. Стандартизацию экстракта проводили по сухому остатку (ГФ X1, том 2, стр.160). Основными биологически активными веществами солодки являются тритерпеновые сапонины, флавоноиды, изофлавоны, полисахариды, кумарины, пектиновые вещества. В современной медицинской практике корни солодки используются в качестве отхаркивающего, обволакивающего и смягчающего кашель средства. Также корни растения применяют при лечении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, хронических воспалительных состояниях желудочно-кишечного тракта, особенно при повышенной кислотности [3].
Новым в предлагаемом изобретении является то, что жидкий экстракт солодки впервые предложен для использования в качестве средства, обладающего иммунокоррегирующим действием на гуморальное звено иммунитета в условиях цитостатической иммуносупресии.
Использование жидкого экстракта солодки, полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола в качестве монопрепарата, обладающего иммунокоррегирующими свойствами в условиях цитостатической иммуносупресии, в литературе не описано. Применение по новому назначению стало возможно благодаря обнаружению у него нового свойства, а именно восстанавливать активность гуморального иммунного ответа в условиях цитостатической иммуносупрессии. Данное свойство явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники. Жидкий экстракт солодки можно использовать у больных с иммунной недостаточностью на фоне лечения цитостатиками.
Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения: "новизна", "изобретательский уровень", "промышленная применимость".
Новые свойства жидкого экстракта солодки были обнаружены благодаря экспериментальным исследованиям.
Для установления иммунокоррегирующих свойств жидкого экстракта солодки было изучено его влияние на гуморальный иммунный ответ в условиях цитостатической иммуносупрессии. Жидкий экстракт солодки получали методом реперколяции с помощью 40% этанола в соотношении 1:1. Пример получения экстракта: 0,450 кг воздушно-сухого сырья корней солодки измельчают на измельчителе типа траворезки до частиц размером 3-4 мм. Затем измельченное сырье при помощи сита со стороной отверстия 0,25 мм освобождают от пыли (частиц менее 0,25 мм) и получают 0,400 кг готового сырья. Экстракцию ведут методом реперколяции в 4 перколяторах. Для этого 0,100 кг измельченного и освобожденного от пыли сырья помещают в перколятор 1 и заливают 500 мл 40% этанола до образования "зеркала" и оставляют на 12 ч при температуре 18-20°С.
После 12 часов настаивания из перколятора 1 сливают 500 мл извлечения и заливают им 0,100 кг готового сырья в перколяторе 2 до образования "зеркала" с одновременной подачей в перколятор 1 аликвотного количества свежего экстрагента.
После 12 часов настаивания из перколяторов 1 и 2 сливают последовательно по 500 мл извлечения. При этом перколятор 1 пополняется свежим экстрагентом, а перколятор 2 - извлечением из перколятора 1, перколятор 3 - извлечением из перколятора 2.
Таким образом повторяют операцию до четвертого перколятора через каждые 12 ч.
После 12 часов настаивания осуществляют последовательную передвижку извлечений в объеме 500 мл от перколятора 1 к перколятору 4, из перколятора 4 сливают в отдельную склянку 100 мл извлечения - готового продукта стадии экстракции сырья, а из перколятора 1 сливают остатки извлечения (побочный продукт) в отдельную емкость, после чего оставшийся в сырье этанол вымывают двукратным количеством воды (рекуперат). Перколятор 1 освобождают от отработанного сырья. Далее в таком же порядке через каждые 12 часов производят передвижку извлечений, исключая из работы сырье из перколятора 2, 3, и производят слив готового продукта (жидкого экстракта) из перколятора 4. В остановочном периоде из последнего перколятора (4) через 12 часов сливают 100 мл извлечения и объединяют с извлечениями, полученными в рабочий период, и получают 400 мл жидкого экстракта, который отстаивают при температуре 3-5°С в течение 3-4 суток и фильтруют через 3 слоя бязи.
Сущность метода реперколяции по Босину.
Сырье загружают в равных количествах в каждый перколятор батареи. Сырье в перколяторе №1 экстрагируют чистым экстрагентом, в последующих - отпусками после извлечения сырья из предыдущих перколяторов. Число перколяторов подбирают таким образом, чтобы получать вытяжку из последнего перколятора в объеме, равном всей массе экстрагируемого материала, т.е. 1:1 [Муравьев И.А. Теоретические основы производства жидких экстрактов методом реперколяции с законченным циклом: метод, указания для преподавателей / И.А.Муравьев, Ю.Г.Пшуков. - Пятигорск: Пятигорская типография им.Анджиевского, 1985. - 48 с.; Промышленная технология лекарств: [Учебник. В 2-х тт. Том 2 / В.И.Чуешов, М.Ю.Чернов, Л.М.Хохлова и др.]. Под редакцией профессора В.И.Чуешова. - X.: МТК - Книга; Издательство НФАУ, 2002. - С.99].
Стандартизацию экстракта проводили по сухому остатку (ГФ XI, том 2, стр.160). В качестве препарата сравнения использовали настойку эхинацеи пурпурной («ГаленоФарм», г.Санкт-Петербург, разрешена к применению на территории России, рег. №000167.01-2000).
Эксперименты по изучению влияния экстракта солодки (ЭС) на гуморальный иммунный ответ были проведены на 40 мышах-самцах линии CBA/CaLac массой 18-20 г. Животные были разделены на 4 группы: 10 мышей - контроль 1; 10 - контроль 2, получали в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно; 10 - опыт 1, получали деалкоголизированную настойку эхинацеи пурпурной (ЭП), которую вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно - прототип; 10 - опыт 2, получали деалкоголизированный ЭС, который вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно - предлагаемое средство. У животных 2 контрольной и обеих опытных групп моделировали экспериментальное иммунодефицитное состояние путем введения циклофосфана однократно внутрибрюшинно в максимально переносимой дозе (250 мг/кг). Для индукции гуморального иммунного ответа мышей всех групп иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ) - 6×108/мышь (однократно внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл) в конце 5-дневного курса введения ЭС, ЭП или дистиллированной воды. На 4-е сутки после иммунизации (что соответствует 8 сут после введения цитостатика) определяли общепринятыми методами [5] общую клеточность селезенки (ОКС), а также относительное (%) и абсолютное (×106) количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей по методу Cunningham [6].
Статистическая обработка результатов осуществлялась с применением пакета статистических программ Statistica for Windows (версия 5.0) с предварительной оценкой нормальности распределения и использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты, подтверждающие иммунокоррегирующие свойства жидкого экстракта солодки.
Пример 1. У животных 2-й контрольной и обеих опытных групп моделировали экспериментальное иммунодефицитное состояние путем введения циклофосфана однократно внутрибрюшинно в максимально переносимой дозе (250 мг/кг). Далее животным 2-й контрольной группы вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Мышам 1-й опытной группы вводили деалкоголизированную настойку эхинацеи пурпурной (ЭП) в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Мышам 2-й опытной группы вводили деалкоголизированный экстракт солодки (ЭС), в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Затем мышей всех групп иммунизировали эритроцитами барана - 6×108/мышь (однократно внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл). На 4-е сутки после иммунизации определяли общее количество спленоцитов (ОКС), а также относительное (%) и абсолютное (×106) количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей.
| Таблица 1 | ||
| Влияние экстракта солодки (ЭС) и настойки эхинацеи пурпурной (ЭП) на гуморальный иммунный ответ мышей линии СВА/Са Lac на фоне введения циклофосфана, (Х±m) | ||
| Группа мышей | Показатели | 4 сут |
| Контроль 1 (ЭБ) | ОКС, 106/орган | 159,20±16,50 |
| АОК, % | 7,36±0,10 | |
| АОК, 106/орган | 11,72±1,23 | |
| Контроль 2 (ЦФ+ЭБ) | ОКС, 106/орган | 94,6±16,44 |
| АОК, % | 10,16±0,70 | |
| АОК, 106/орган | 9,67±1,75 | |
| Опыт 1 (ЦФ+ЭП+ЭБ) | ОКС, 106/орган | 154±19,71* |
| АОК, % | 8,8±0,32 | |
| АОК, 106/орган | 13,63±1,84* | |
| Опыт 2 (ЦФ+ЭС+ЭБ) | ОКС, 106/орган | 284,6±18,22*# |
| АОК, % | 18,84±0,73*# | |
| АОК, 106/орган | 53,69±4,05*# | |
| Примечания: | ||
| * - различия с соответствующими значениями контроля 2 достоверны; | ||
| # - различия с соответствующими значениями группы «опыт 1» достоверны. |
Введение линейным животным циклофосфана в дозе 250 мг/кг приводило к подавлению гуморального иммунного ответа, проявляющемуся в снижении общей клеточности селезенки и функциональной активности клеток-антителопродуцентов. У мышей опытных групп наблюдалось увеличение общего числа спленоцитов относительно группы контроля 2. При этом если введение животным настойки эхинацеи пурпурной приводило только к восстановлению системы гуморального иммунного ответа до уровня фона, то экстракт солодки способствовал дополнительной стимуляции исследуемых показателей.
Таким образом, жидкий экстракт солодки проявляет иммунокоррегирующие свойства, что выражается в усилении подавленного циклофосфаном гуморального иммунного ответа (повышение общей клеточности лимфоидного органа и относительного и абсолютного количества клеток-антителопродуцентов), превышающие по выраженности эффекты настойки эхинацеи пурпурной.
Источники литературы
1. Амосова Е.Н., Зуева Е.П., Разина Т.Г., Крылова С.Г. Лекарственные растения как средства дополнительной терапии для лечения опухолей // Бюл. экспер. биол. - 2003. - Прил.2. - С.24-34.
2. Вершинина С.Ф., Потявина Е.В. Применение природных биорегуляторов в онкологии // Вопросы онкологии. - 2003. - Т.49. - №2. - С.145-151.
3. Положий А.В., Гольдберг Е.Д., Гуреева И.И. Лекарственные растения Сибири. Томск: Изд-во Том. ун-та, 1995. - С.214-218.
4. Самородов В.Н., Поспелов С.В., Моисеева Г.Ф. и др. Фитохимический состав представителей рода эхинацеа (Echinacea Moench.) и его фармакологические свойства (обзор) // Химико-фармацевтический журнал. - 1996. - №4. - С.32-37.
5. Хаитов P.M., Гущин И.С., Пинегин Б.В. и соавт. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов // Ведомости Фарм. Комитета. - 1999. - №1. - С.31-36.
6. Cunningham A. J. A method of increased sensitivity for detecting single antibodyforming cells // Nature. - 1965. - V.207, №5001. - P.1106-1107.
7. Percival S.S. Use of echinacea in medicine // Biochem. Pharmacol. - 2000. - Vol.60. - №2. - Р.155-158.
Средство, обладающее иммунокоррегирующим действием на гуморальное звено иммунитета в условиях цитостатической иммуносупрессии, характеризующееся тем, что представляет собой жидкий экстракт корней солодки (Radices Glycyrrhizae), полученный методом реперколяции с помощью 40% этанола в соотношении сырье:экстрагент 1:1.
