Способы и приборы для обнаружения и идентификации закодированных гранул и биологических молекул

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Предложен способ определения последовательности нуклеотидных типов в нуклеиновой кислоте, содержащий этапы секвенирования ДНК и приготовления гранул с люминесцирующими маркерами. Изобретение может быть использовано при секвенировании, разделении, обнаружении и идентификации объектов и биологических молекул для лабораторно-диагностических целей. 2 з.п. ф-лы, 16 ил, 10 пр.

 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Заявка притязает на приоритет предварительной заявки США № 60/760056, поданной 20 января 2006.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способам и оборудованию, применяемым при обнаружении, разделении и идентификации закодированных гранул и биологических молекул, и при секвенировании мономеров, которые содержат гетерополимеры. В предпочтительных вариантах изобретение относится к системе секвенирования ДНК на основе циклического секвенирования, выполненного синтезом на гранулах с закодированным спектром излучения, с помощью капиллярного массива для обнаружения синтезированных продуктов. Изобретение также относится к системе для проведения гибридизационных анализов на гранулах с закодированным спектром излучения с помощью капиллярных массивов на этапах обнаружения. Изобретение также относится к системе "штрихового кодирования" материалов и объектов с помощью гранул с закодированным спектром излучения и с применением капиллярных массивов на этапах детектирования. В другом варианте изобретение относится к способу создания гранул, приписываемых взаимно простым устройствам (наборам), в котором каждый набор содержит гранулы, каждая из которых несет на себе такую же уникальную комбинацию люминесцирующих частиц со сложной структурой в виде меток или маркеров. В дополнительном варианте изобретения указанные люминесцирующие частицы представляют собой квантовые точки. Еще в другом варианте воплощения изобретение относится к грануле, содержащей две или несколько люминесцирующих частиц, и иммобилизованную на указанной грануле последовательность нуклеиновой кислоты. Еще в другом варианте изобретение относится к нуклеиновой кислоте, иммобилизованной на люминесцирующей частице.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способы диагностирования заболевания типично основываются на идентификации конкретного биологического маркера, например маркера, указывающего на существование мутантов. Однако трудность в идентификации биологического маркера в присутствии среды, в которой находится образец, и возможно аналогичным образом структурированных, но неспецифических биомолекул, представляет собой сложную задачу. Отделение вариантных форм нуклеотидов, например, представляет собой зачастую непростую задачу, в особенности при существовании специфического варианта в низкой концентрации по сравнению с доминантно-экспрессированной версией. При секвенировании полногеномной ДНК с использованием гибридизационных проб любой специалист сталкивается с проблемами при разработке способов, которые предотвращают перекрестную гибридизацию с неподходящими мишенями в результате повторяющихся элементов или случайных сходств, которые вносят вклад в высокую ложноположительную вероятность обнаружения. Кроме того, многие методы требуют стадий приготовления проб в виде подходящей фракции генома, которая должна быть амплифицирована путем ПЦР перед гибридизацией. В целом существует потребность в новых способах, которые улучшают разделение и идентификацию биологически различных материалов, которые только незначительно отличаются по своим химическим и физическим свойствам.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способам и оборудованию, применяемым при обнаружении, разделении и идентификации закодированных гранул и биологических молекул, и при секвенировании мономеров, которые содержат гетерополимеры. В предпочтительных вариантах изобретение относится к системе секвенирования ДНК на основе циклического секвенирования, выполненного синтезом на гранулах с закодированным спектром излучения, с помощью капиллярного массива для обнаружения синтезированных продуктов. Изобретение также относится к системе для проведения гибридизационных анализов на гранулах с закодированным спектром излучения с помощью капиллярных массивов на этапах детектирования. Изобретение также относится к системе "штрихового кодирования" материалов и объектов с помощью гранул с закодированным спектром излучения и с применением капиллярных массивов на этапах детектирования. В другом варианте изобретение относится к способу создания гранул, приписываемых взаимно простым устройствам (наборам), в котором каждый набор содержит гранулы, каждая из которых несет на себе такую же уникальную комбинацию люминесцирующих частиц со сложной структурой в виде меток или маркеров. В дополнительном варианте изобретения указанные люминесцирующие частицы представляют собой квантовые точки. Еще в другом варианте воплощения изобретение относится к грануле, содержащей две или несколько люминесцирующих частиц, и иммобилизованную на указанной грануле последовательность нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах воплощения изобретение относится к способу производства люминесцирующих закодированных гранул, содержащему: а) предоставление: i) множества первичных идентичных люминесцирующих частиц, ii) множества вторичных идентичных люминесцирующих частиц, iii) первое множество пористых структур, iv) множества первичных лунок, каждая такая лунка, содержащая часть указанного множества первичных люминесцирующих частиц, где указанные первичные люминесцирующие частицы находятся в различных концентрациях по меньшей мере в двух из указанных первичных лунок; v) множества вторичных лунок, каждая такая лунка, содержащая часть указанного множества вторичных люминесцирующих частиц, где указанные вторичные люминесцирующие частицы находятся в различных концентрациях, по меньшей мере, в двух из указанных первичных лунок; b) распределение части указанного множества пористых структур в каждой из указанных первичных лунок при условии, что такие указанные первичные люминесцирующие частицы являются абсорбированными указанными пористыми структурами; с) экстрагирование указанных пористых структур из неабсорбированных первичных люминесцирующих частиц; d) восстановление указанных экстрагированных пористых структур до образования вторичного множества пористых структур, имеющих указанные первичные люминесцирующие частицы, абсорбированные на них, где по меньшей мере две из указанных пористых структур имеют указанные частицы, абсорбированные на них в различных концентрациях; е) распределение части указанных рекомбинированных пористых структур в каждой из указанных вторичных лунок в условиях, при которых указанные вторичные люминесцирующие частицы абсорбируются указанными пористыми структурами; f) экстрагирование указанных пористых структур из неабсорбированных вторичных люминесцирующих частиц; g) восстановление указанных экстрагированных пористых структур с образованием третьего множества пористых структур, имеющих указанные первые люминесцирующие частицы и указанные вторые люминесцирующие частицы, абсорбированные на них, где по меньшей мере две из указанных пористых структур имеют различные концентрации указанных первых люминесцирующих частиц и различные концентрации указанных вторых люминесцирующих частиц. В дополнительных вариантах изобретения указанная первая люминесцирующая частица представляет собой квантовую точку. В дополнительных вариантах изобретения указанная вторая люминесцирующая частица представляет собой квантовую точку, где указанная первая и вторая квантовая точка имеют различный размер. В дополнительных вариантах изобретения указанные пористые структуры представляют собой гранулы мезопористого кремнезема. В дальнейших вариантах изобретения указанные пористые структуры представляют собой мезопористые полистрольные гранулы. В дополнительных вариантах изобретения указанные условия для распределения части указанного множества пористых структур в указанном первом множестве лунок не насыщают пористые структуры указанным первым множеством частиц.

В дополнительных вариантах изобретения способ дополнительно содержит предоставление множества третьих идентичных люминесцирующих частиц, распределенных среди множества третьих лунок, где указанные третьи люминесцирующие частицы находятся в различных концентрациях, по меньшей мере, в двух из указанных трех лунок и более того, распределение части указанного третьего множества пористых структур в каждой из указанных третьих лунок такое, при котором указанные третьи люминесцирующие частицы абсорбированы указанными пористыми структурами, экстрагирование указанных пористых структур из неабсорбированных третьих люминесцирующих частиц, восстановление указанных экстрагированных пористых структур с образованием четвертого множества пористых структур, имеющих указанные первые люминесцирующие частицы, указанные вторые люминесцирующие частицы и указанные третьи люминесцирующие частицы, абсорбированные на них, где по меньшей мере, три из указанных пористых структур имеют различные комбинации, путем концентрирования указанных первых, вторых и третьих люминесцирующих частиц.

В некоторых вариантах изобретения изобретение относится к способу определения аутентичности объекта, содержащему а) предоставление i) объекта, содержащего множество люминесцирующих закодированных гранул, где указанные закодированные гранулы содержат два или несколько люминесцирующих маркеров, скомпонованных для предоставления люминесцирующей конфигурации, ii) электромагнитного излучения, и iii) устройства для детектирования электромагнитного излучения; b) экспонирование указанного объекта с применением указанного электромагнитного излучения в условиях, при которых указанные люминесцирующие маркеры люминесцируют, и с) детектирование указанной люминесцирующей конфигурации с помощью указанного устройства; и d) приведение в соответствие люминесцирующей конфигурации с помощью аутентичного признака указанного объекта. В дальнейших воплощениях изобретения указанный объект выбирают из группы, состоящей из индивидуальной идентификационной карты, наличных, жидкости, твердого вещества и ткани. В дальнейших вариантах изобретения указанное электромагнитное излучение представляет собой ультрафиолетовое излучение. В дальнейших вариантах изобретения указанные люминесцирующие маркеры представляют собой квантовые точки.

В некоторых вариантах воплощения изобретение относится к способу производства люминесцирующих закодированных гранул, содержащему: а) предоставление: i) множества первых люминесцирующих частиц, ii) множества вторичных люминесцирующих частиц, и iii) множества пористых структур, iv) первого множества лунок, где указанные первые люминесцирующие частицы находятся в указанных лунках и находятся в различных концентрациях, по меньшей мере, в двух лунках; v) второго множества лунок, где указанные вторые люминесцирующие частицы находятся в указанных лунках и находятся в различных концентрациях по меньшей мере в двух лунках; b) распределение части указанного множества пористых структур в указанном первом множестве лунок при таких условиях, при которых такие указанные первые люминесцирующие частицы являются абсорбированными указанными пористыми структурами; с) экстрагирование указанного множества пористых структур с помощью указанных первых люминесцирующих частиц из указанного первого множества лунок; d) смешивание указанного экстрагированного множества пористых структур вместе с указанными первыми люминесцирующими частицами до образования множества пористых структур, где по меньшей мере две из указанных пористых структур имеют концентрации отличные от концентраций указанных первых люминесцирующих частиц; е) распределение указанного множества пористых структур, где по меньшей мере две из указанных пористых структур имеют концентрации, отличные от концентраций указанных первых люминесцирующих частиц, по отношению к указанному второму множеству лунок в условиях, при которых указанные вторые люминесцирующие частицы являются абсорбированными указанными пористыми структурами; f) экстрагирование указанного множества пористых структур с помощью указанных первых люминесцирующих частиц и указанных вторых люминесцирующих частиц из указанного множества лунок; g) смешивание указанного множества пористых структур вместе с указанными первыми люминесцирующими частицами и указанными вторыми люминесцирующими частицами, которые экстрагируют из указанного второго множества лунок до образования множества пористых структур, где по меньшей мере две из указанных пористых структур имеют концентрации, отличные от концентраций указанных первых люминесцирующих частиц и имеют концентрации, отличные от концентраций указанных вторых люминесцирующих частиц. В дополнительных вариантах изобретения указанная первая люминесцирующая частица представляет собой квантовую точку. В дополнительных вариантах изобретения указанная вторая люминесцирующая частица представляет собой квантовую точку, где указанная первая и вторая квантовая точка имеют различный размер. В дополнительных вариантах изобретения указанные пористые структуры представляют собой гранулы мезопористого кремнезема. В дальнейших вариантах изобретения указанные пористые структуры представляют собой мезопористые полистрольные гранулы. В дополнительных вариантах изобретения указанные условия для распределения части указанного множества пористых структур в указанном первом множестве лунок не насыщают пористые структуры указанным первым множеством частиц.

В дополнительных вариантах изобретения способ, кроме того, содержит предоставление множества третьих люминесцирующих частиц, где указанные вторые и третьи люминесцирующие частицы находятся в указанных лунках и имеют различные концентрации по меньшей мере в двух из лунок, и кроме того, смешивание указанного множества пористых структур вместе с указанными первыми люминесцирующими частицами, указанными вторыми люминесцирующими частицами и указанными третьими люминесцирующими частицами, которые экстрагируют с указанного второго множества лунок вместе с образованием множества пористых структур, где по меньшей мере три из указанных пористых структур имеют комбинации концентраций, отличные от указанных первых, указанных вторых и указанных третьих люминесцирующих частиц.

В некоторых вариантах изобретение относится к способу определения аутентичности объекта, содержащему а) предоставление i) объекта, содержащего множество люминесцирующих закодированных гранул, где указанные закодированные гранулы содержат два или несколько люминесцирующих маркеров, с конфигурацией, созданной для предоставления характерного люминесцирующего признака, ii) электромагнитного излучения, и iii) приспособления детектирования электромагнитного излучения; b) размещение указанного объекта в указанное электромагнитное излучение в условиях, при которых квантовые точки люминесцируют, и с) детектирование указанного характерного люминесцирующего признака с помощью указанного приспособления; и d) приведение в соответствие характерного люминесцирующего признака с аутентичностью указанного объекта. В дополнительных вариантах указанный объект выбирают из группы, состоящей из индивидуальной идентификационной карты, денежных средств, жидкости, твердого вещества и ткани. В дальнейших вариантах указанное электромагнитное излучение представляет собой ультрафиолетовое излучение. В дальнейших вариантах указанные люминесцирующие маркеры представляют собой квантовые точки.

В дальнейших вариантах изобретение относится к способу перемещения гранулы через канал, содержащему: а) предоставление: i) гранулы, содержащей первую люминесцирующую метку и вторую люминесцирующую метку, ii) канала, iii) раствора внутри указанного канала, в котором указанные гранулы находятся внутри указанного раствора, iv) пары электродов; и b) приложения напряжения между указанной парой электродов в условиях, при которых указанная гранула перемещается в указанном канале в направлении к одному электроду указанной пары электродов. В дополнительных вариантах указанная гранула представляет собой полистрольную (polysterene) гранулу. В дополнительном варианте указанные первая и вторая люминесцирующие метки представляют собой квантовые точки. В дополнительных вариантах указанная гранула является заряженной.

В одном варианте изобретение относится к способу определения фенотипа субъекта, содержащему: а) предоставление i) множества взаимосвязанных гранул, где указанные гранулы содержат: А) люминесцирующие электромагнитные коды, В) множество маркеров нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с нуклеиновыми кислотами, которые коррелируют с фенотипом субъекта, и где указанное множество маркеров нуклеиновых кислот создают с конфигурацией, при которой нуклеиновые кислоты с уникальной последовательностью связываются с гранулой с уникальным люминесцирующим электромагнитным кодом, и ii) пробы, содержащей в себе или с предполагаемой содержащейся нуклеиновой кислотой указанного субъекта; b) детектирование указанных люминесцирующих электромагнитных кодов на указанном множестве гранул и регистрация указанных кодов для соответствия указанной уникальной последовательности указанного маркера нуклеиновой кислоты на указанных гранулах; с) смешивание указанных сцепленных гранул с указанной пробой в условиях, при которых может происходить гибридизация с нуклеиновыми кислотами в указанной пробе; d) детектирование гранулы, на которой происходит гибридизация; е) определение указанного люминесцирующего электромагнитного кода на указанной гибридизованной грануле; f) сравнение указанного люминесцирующего электромагнитного кода на указанной гибридизованной грануле с указанными зарегистрированными кодами; и g) приведение в соответствие указанного зарегистрированного кода с указанным фенотипом указанного объекта. В некоторых вариантах изобретения указанные люминесцирующие электромагнитные коды содержат более трех различимых длин электромагнитных волн. В некоторых вариантах указанные длины электромагнитных волн представляют собой дискретные видимые цвета. В некоторых вариантах указанные гранулы сшивают с указанными нуклеиновыми кислотами путем биотин-стрептавидинового взаимодействия. В некоторых вариантах указанный фенотип представляет собой заболевание. В некоторых вариантах указанный субъект представляет собой человека. В дополнительных вариантах число указанных гранул превышает 1.000.000 или 10.000.000. В дополнительных вариантах указанное множество маркеров нуклеиновых кислот включает в себя 1.000 или 10.000 различных маркеров.

В некоторых вариантах изобретение относится к способу, содержащему: а) предоставление: i) гранулы, содержащей первую люминесцирующую метку и вторую люминесцирующую метку, ii) первой нуклеиновой кислоты, iii) второй нуклеиновой кислоты, отрезка нуклеотидной последовательности, которая является комплементарной отрезку нуклеотидной последовательности, содержащей указанную первую нуклеиновую кислоту, iv) нуклеотида, содержащего третью люминесцирующую метку, и v) прозрачного канала; b) присоединение указанной первой нуклеиновой кислоты к указанной грануле; с) контактирование указанной второй нуклеиновой кислоты и указанной первой нуклеиновой кислоты в условиях, при которых указанное контактирование приводит к образованию двунитевого отрезка первой нуклеиновой кислоты; d) смешивание указанного нуклеотида и указанного двунитевого отрезка в условиях, при которых лигирование указанного нуклеотида с указанной второй нуклеиновой кислотой предоставляет лигированную нуклеиновую кислоту; е) движение указанной гранулы по указанному прозрачному каналу; и f) детектирование независимо друг от друга указанных первой, второй и третьей люминесцирующих меток. В дополнительных вариантах способ содержит дополнительную стадию g) удаления третьей люминесцирующей метки с указанной лигированной нуклеиновой кислоты. В дополнительных вариантах способ содержит повторяющиеся стадии d)-g). В дополнительных вариантах указанные первые и вторые люминесцирующие метки являются содержащимися в грануле. В дополнительных вариантах указанные первые и вторые люминесцирующие метки являются ковалентно связанными с наружной поверхностью гранулы. В дополнительных вариантах указанные первые и вторые люминесцирующие метки представляют собой квантовые точки способными к флуоресценции. В дополнительных вариантах указанная первая люминесцирующая метка представляет собой краситель и указанная вторая люминесцирующая метка представляет собой квантовую точку. В дополнительных вариантах указанные первая и вторая люминесцирующие метки представляют собой красители. В дополнительных вариантах указанные нуклеотид означает нуклеотидтрифосфат. В дополнительных вариантах указанная гранула содержит различные концентрации указанных первой и второй люминесцирующих меток. В дополнительных вариантах указанные различные концентрации представляют собой число меток на гранулу, число меток на единицу объема гранул или число меток на объем раствора, в котором суспендируют гранулы.

В другом варианте изобретение относится к системе обнаружения содержащей: а) первую гранулу, содержащую первую люминесцирующую метку и вторую люминесцирующую метку; b) вторую гранулу, содержащую третью люминесцирующую метку и четвертую люминесцирующую метку; с) первый прозрачный канал, содержащий указанную первую гранулу и второй прозрачный канал, содержащий указанную вторую гранулу; и d) устройство для детектирования электромагнитного излучения от люминесцирующих меток. В дополнительных вариантах указанные первые и вторые люминесцирующие метки содержатся в грануле. В дополнительных вариантах указанные первые и вторые люминесцирующие метки ковалентно присоединяют к наружной поверхности гранулы. В дополнительных вариантах указанные первые и вторые люминесцирующие метки представляют собой флуоресцентные квантовые точки. В дополнительных вариантах указанная первая люминесцирующая метка и указанная третья люминесцирующая метка являются аналогичными метке, у которой указанная третья люминесцирующая метка находится в более низкой концентрации внутри указанной второй гранулы, чем концентрация указанной первой люминесцирующей метки в указанной первой грануле. В дополнительных вариантах общая перегородка разделяет указанные первый и второй прозрачные каналы. В дополнительных вариантах указанные первый и второй прозрачные каналы содержат квадратную поперечную секцию. В дополнительных вариантах указанное устройство для детектирования электромагнитного излучения представляет собой прибор с зарядовой связью. В дополнительных вариантах система содержит источник электромагнитного излучения. В дополнительных вариантах источник электромагнитного излучения представляет собой лазер.

В других вариантах изобретение относится к системе обнаружения, содержащей: а) первую гранулу, содержащую первую люминесцирующую метку, вторую люминесцирующую метку и первую нуклеиновую кислоту, содержащую первую нуклеотидную последовательность, имеющую первый элиминируемый люминесцирующий маркер на последнем нуклеотиде в указанной последовательности; b) вторую гранулу, содержащую третью люминесцирующую метку, четвертую люминесцирующую метку и вторую нуклеиновую кислоту, содержащую вторую нуклеотидную последовательность, имеющую второй элиминируемый люминесцирующий маркер на последнем нуклеотиде в указанной последовательности; с) первый прозрачный канал, настроенный для приема указанной первой гранулы, и второй прозрачный канал, настроенный для приема указанной второй гранулы; d) устройство для детектирования электромагнитного излучения из указанных люминесцирующих меток; и е) устройство для детектирования электромагнитного излучения от указанных извлекаемых люминесцирующих маркеров. В дополнительных вариантах указанный прибор проектируют для сбора отдельных наборов данных для каждой люминесцирующей метки. В дополнительных вариантах система содержит дихроическое зеркало. В дополнительных вариантах указанные первая и вторая люминесцирующие метки находятся в грануле. В дополнительных вариантах указанные первая и вторая люминесцирующие метки представляют собой флуоресцентные квантовые точки. В дополнительных вариантах указанный извлекаемый люминесцирующий маркер представляет собой извлекаемый при освещении. В дополнительных вариантах указанный извлекаемый люминесцирующий маркер представляет собой связанный с указанным нуклеотидом орто-нитрофенильной группой. В дополнительных вариантах указанный прибор для обнаружения электромагнитного излучения от указанных люминесцирующих меток содержит устройство с зарядовой связью. В дополнительных вариантах указанный прибор для обнаружения электромагнитного излучения от указанного люминесцирующего маркера содержит устройство с зарядовой связью. В дополнительных вариантах система дополнительно содержит лазер. В дополнительных вариантах указанный лазер испускает электромагнитное излучение в указанные первый и второй прозрачные каналы. В дополнительных вариантах система содержит насос, спроектированный для реверсивного проталкивания первой и второй гранул по указанным прозрачным каналам.

В другом варианте изобретение относится к способу определения нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащему: а) предоставление: i) системы для обнаружения содержащей: (А) первую гранулу, содержащую первую люминесцирующую метку и вторую люминесцирующую метку; (В) вторую гранулу, содержащую третью люминесцирующую метку и четвертую люминесцирующую метку; С) первый прозрачный канал и второй прозрачный канал; и D) устройство, которое одновременно проецирует электромагнитное излучение в указанный первый прозрачный канал и указанный второй прозрачный канал; ii) первой нуклеиновой кислоты и второй нуклеиновой кислоты, где указанная первая и вторая нуклеиновая кислота имеют идентичные или комплементарные перекрывающиеся нуклеотидные последовательности; iii) множества праймеров, которые гибридизуются с одним концом указанной первой и второй нуклеиновых кислот; iv) набора нуклеотидов, содержащих удаляемые люминесцирующие маркеры, где люминесценция каждого из указанных маркеров соответствует уникальному нуклеотидному основанию; b) связывание указанного множества праймеров с указанной первой гранулой и указанной второй гранулой; с) контактирование указанной первой гранулы и указанной первой нуклеиновой кислоты в условиях, при которых происходит гибридизация указанной первой нуклеиновой кислоты с одним из указанных праймеров, и контактирование указанной второй гранулы и указанной второй нуклеиновой кислоты в условиях, при которых происходит гибридизация указанной второй нуклеиновой кислоты с одним из указанных праймеров; d) экспонирование указанного набора нуклеотидов с указанными первой и второй гранулами в условиях, при которых указанные нуклеотиды лигируют с указанными праймерами в соответствии со спариванием за счет образования водородных связей соответствующего нуклеозидного основания на указанных гибридизованных первой и второй нуклеиновых кислотах; е) размещение указанной первой гранулы в указанном первом прозрачном канале и указанной второй гранулы в указанном втором прозрачном канале таким образом, что указанное проецируемое электромагнитное излучение облучает указанные метки и маркеры; и d) обнаружение указанных меток и маркеров для приведения в соответствие с первой и второй последовательностью нуклеиновой кислоты, присоединенной к указанным первой и второй гранулам. В дополнительных вариантах способ содержит удаление указанного маркера с указанного лигированного нуклеотида. В дополнительных вариантах способ содержит повторяющиеся стадии d)-f). В дополнительных вариантах указанные праймеры содержат полностью или частично идентичную нуклеотидную последовательность. В дополнительных вариантах указанные первая и вторая нуклеиновые кислоты содержат нуклеотидную последовательность, комплементарную указанным праймерам. В дополнительных вариантах указанное связывание происходит с помощью указанных гранул, содержащих стрептавидин, и указанных праймеров, содержащих биотин.

В другом варианте изобретение относится к способу создания люминесцирующих закодированных гранул, содержащему: а) предоставление: i) множества первых люминесцирующих частиц, множества вторых люминесцирующих частиц, ii) множества пористых структур; iii) первого множества лунок; где указанные первые люминесцирующие частицы находятся в указанных лунках и имеют различные концентрации по меньшей мере в двух из лунок; и iv) второго множества лунок, где указанные первые люминесцирующие частицы находятся в указанных лунках и имеют различные концентрации по меньшей мере в двух из лунок, b) распределение части указанного множества пористых структур в указанном первом множестве лунок в условиях, при которых указанные первые люминесцирующие частицы являются абсорбированными указанными пористыми структурами, с) смешивание указанного множества пористых структур с указанными первыми люминесцирующими частицами, которые вместе находятся в указанном первом множестве лунок с образованием множества пористых структур, где, по меньшей мере, две из указанных пористых структур имеют различные концентрации указанных первых люминесцирующих частиц, d) распределение указанного множества пористых структур, где, по меньшей мере, две из указанных пористых структур имеют различные концентрации указанных первых люминесцирующих частиц, в указанном втором множестве лунок в условиях, при которых указанные вторые люминесцирующие частицы находятся в указанных пористых структурах; и е) смешивание указанного множества пористых структур вместе с указанными первыми люминесцирующими частицами и указанной второй люминесцирующей частицей, которая находится в указанном втором множестве лунок для образования множества пористых структур, где по меньшей мере две из указанных пористых структур имеют различные концентрации частиц на гранулу указанных первых люминесцирующих частиц и имеют различные концентрации указанных вторых люминесцирующих частиц. В дополнительных вариантах указанная первая люминесцирующая частица представляет собой квантовую точку. В дополнительных вариантах указанная вторая люминесцирующая частица представляет собой квантовую точку, где указанная первая и вторая квантовая точка имеют различный размер. В дополнительных вариантах указанные пористые структуры представляют собой гранулы мезопористого кремнезема. В дополнительных вариантах указанные условия для распределения части указанного множества пористых структур в указанном первом множестве лунок не насыщают пористые структуры указанным первым множеством частиц.

В некоторых вариантах изобретение относится к модификации частиц, содержащих два или несколько различных флуорофоров, до образования биомолекул. В дополнительных вариантах флуорофоры представляют собой квантовые точки и биомолекулы представляют собой нуклеиновые кислоты. И в дополнительных вариантах частицы смешивают с пробой, которая содержит, или предположительно содержит, нуклеиновую кислоту, имеющую комплементарную нуклеотидную последовательность по меньшей мере с одним из нуклеотидов, содержащимся в указанной частице, и обрабатывают способом для определения последовательности нуклеиновой кислоты. Частицу подвергают перемещению по каплиллярному массиву и гибридизованную последовательность нуклеиновой кислоты идентифицируют флуоресцентной эмиссией квантовых точек.

В некоторых вариантах изобретение относится к способу идентификации специфической молекулы, содержащему: а) предоставление i) пробы, предположительно имеющей первую молекулу, и ii) гранулы, конъюгированной со второй молекулой, где указанная гранула содержит первый оптический маркер и второй оптический маркер; b) смешивание указанной пробы и указанной гранулы в условиях, при которых указанная первая молекула связывается с указанной второй молекулой, образуя конъюгатный комплекс; с) отделение указанной гранулы от указанной пробы в условиях, при которых этот указанный конъюгатный комплекс очищают; и d) обнаружение указанных первого и второго оптических маркеров. В дополнительных вариантах указанная первая молекула представляет собой первую нуклеиновую кислоту, аминокислотную последовательность или полисахарид. В дополнительных вариантах указанная вторая молекула представляет собой вторую нуклеиновую кислоту с последовательностью, комплементарной отрезку указанной первой нуклеиновой кислоты. В дополнительных вариантах указанное связывание означает связывание путем гибридизации указанной первой нуклеиновой кислоты с указанной второй нуклеиновой кислотой. В дополнительных вариантах указанный конъюгатный комплекс представляет собой двухцепочечную нуклеиновую кислоту. В дополнительных вариантах указанный первый оптический маркер представляет собой квантовую точку. В дополнительных вариантах указанный второй оптический маркер представляет собой квантовую точку. В дополнительных вариантах указанные условия для разделения представляют собой разделение капиллярным электрофорезом. В дополнительных вариантах указанная гранула содержит указанный первый оптический маркер в более высоких концентрациях, чем указанный второй оптический маркер. В других вариантах изобретение относится к способу идентификации специфической молекулы, содержащему: а) предоставление i) пробы, предположительно имеющей первую молекулу, ii) первой гранулы, конъюгированной со второй молекулой, где указанная первая гранула содержит первый оптический маркер и второй оптический маркер, и iii) второй гранулы, конъюгированной с третьей молекулой, где указанная вторая гранула содержит первый оптический маркер и второй оптический маркер, где указанный первый оптический маркер в указанной второй грануле находится в более высокой концентрации, чем в указанной первой грануле; b) смешивание указанной пробы и указанных первой и второй гранул в условиях, при которых первая молекула способна связываться с указанной второй молекулой, образуя конъюгатный комплекс; с) отделение указанной первой и второй гранулы от указанной пробы в условиях, при которых очищают указанный конъюгатный комплекс; и а) обнаружение первого и второго оптических маркеров. В дополнительных вариантах указанная первая молекула представляет собой первую нуклеиновую кислоту, аминокислотную последовательность или полисахарид. В дополнительных вариантах указанная вторая представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную отрезку указанной первой нуклеиновой кислоты. В дополнительных вариантах указанное связывание означает гибридизацию указанной первой нуклеиновой кислоты с указанной второй нуклеиновой кислотой. В дополнительных вариантах указанный конъюгатный комплекс представляет собой последовательность двунитевой нуклеиновой кислоты. В дополнительных вариантах указанный первый оптический маркер представляет собой квантовую точку. В дополнительных вариантах указанный второй оптический маркер представляет собой квантовую точку. В дополнительных вариантах указанное условие разделение означает разделение под действием капиллярных сил.

В некоторых вариантах изобретение относится к способу обнаружения и идентификации закодированных гранул в капиллярном блоке, содержащем: а) предоставление i) множества гранул предпочтительно размером менее чем 10 мкм, или даже более предпочтительно, менее чем 1 мкм, или даже более предпочтительно, гранулы содержат поры между 10 и 30 нанометрами, разбавленные в буфере до желаемой концентрации, где каждая гранула несет уникальный код и может быть идентифицирована по этому коду; ii) емкости для хранения разбавленного набора гранул; iii) мультикапиллярного массива; iv) насосного приспособления для создания движения указанных гранул из указанной емкости через капиллярный массив; v) устройства возбуждения для возбуждения сигнала гранул; приспособления для обнаружения получаемых сигналов от указанных гранул при их прохождении через указанные капилляры; vi) устройства переноса и регистрации данных обнаружения; и vii) устройства для обработки указанных данных; b) подачу насосом набора гранул из емкости через мультикапиллярный массив; с) возбуждение гранул с помощью указанного устройства для возбуждения в условиях, при которых сигнал генерируется указанной гранулой; d) обнаружение указанного сигнала с помощью указанного прибора для обнаружения и е) обработка указанных сигналов с помощью указанного устройства для обработки данных. В дополнительных вариантах указанное связывание включает в себя связывание эпитопа антитела. В дополнительных вариантах указанное антитело связывается с указанной гранулой и указанный эпитоп связывается с клеткой. В дополнительных вариантах указанное устройство обработки данных представляет собой компьютер. В дополнительных вариантах указанные гранулы представляют собой гранулы с закодированным спектром излучения. В дополнительном варианте спектральное кодирование представляет собой цифровое, аналоговое или оба. В дополнительных вариантах каждая гранула несет дополнительный цветовой маркер, который отличается от закодированных цветовых маркеров и который указывает на присутствие гранул в области обнаружения гранул капилляра. В дополнительных вариантах гранулы обнаруживают флуоресценцией, индуцированной облучением. В дополнительных вариантах гранулы представляют собой микросферы, закодированные с помощью многоцветных квантовых точек. В дополнительных вариантах гранулы являются мезопористыми. В дополнительных вариантах капиллярный массив представляет собой монолитную стеклянную структуру с отверстиями произвольной формы. В дополнительных вариантах указанный капиллярный массив содержит более чем 2 капилляра, расположенных в ряд, то есть линейный массив. В дополнительных вариантах указанный капиллярный массив представляет собой расположение с двумерным поперечным сечением. В дополнительных вариантах указанный капиллярный массив изготовлен способом вытягивания стекла или склеиванием отдельных капилляров. В дополнительных вариантах устройство для обнаружения гранул обнаруживает гранулы одновременно или последовательно, предпочтительно способом сканирования, во всех капиллярах капиллярного массива. В дополнительных вариантах устройство для обнаружения обнаруживает гранулы в плоскости, перпендикулярной капиллярам массива. В дополнительных вариантах устройство для обнаружения обнаруживает гранулы в плоскости, которая пересекает капиллярный блок под определенным углом к поверхности капилляров массива.

В некоторых вариантах изобретение относится к способу обнаружения и идентификации биомолекул с помощью закодированных гранул в капиллярном массиве, содержащему: а) предоставление i) множества гранул, предпочтительно размером менее чем 10 мкм или даже более предпочтительно менее чем 1 мкм, разбавленных в буферном растворе до концентрации, при которой каждая гранула несет уникальный код и может быть идентифицирована по этому коду, и где каждую гранулу покрывают специфической биомолекулой, которая избирательно связывается или предпочтительно гибридизуется с указанными биомолекулами, которые идентифицируют; ii) набора биомолекул, которые идентифицируют, iii) емкости для хранения разбавленного набора гранул и биомолекул в буферном растворе; iv) мультикапиллярного массива; v) насосного приспособления для обеспечения движения указанных гранул из указанной емкости по капиллярному массиву; vi) систему возбуждения для возбуждения сигнала от гранул, который несет информацию о кодах гранул, а также информацию по связыванию биомолекул с гранулами; vii) прибора для обнаружения закодированных сигналов на указанных гранулах, детектирования связывания указанных биомолекул с соответствующими указанными гранулами при их прохождении по указанным капиллярам; viii) устройства для переноса и регистрации данных обнаружения; и ix) устройства для обработки указанных данных, которое обладает способностью идентифицировать коды каждой индивидуальной гранулы; b) подачу с помощью насоса набора гранул из емкости по мультикапиллярному массиву; с) возбуждение гранул с помощью указанного устройства для возбуждения в условиях, при которых сигнал генерируется в указанной грануле; d) детектирование указанного сигнала с помощью указанного прибора для детектирования и е) обработку указанных сигналов с помощью указанных приспособлений.

В других вариантах изобретение относится к способу обнаружения и идентификации биомолекул, с помощью закодированных гранул в капиллярном массиве, содержащему: предоставление i) множества гранул, предпочтительно размером менее чем 10 мкм или даже более предпочтительно менее чем 1 мкм, разбавленных в буферном растворе до желаемой концентрации, при которой каждая гранула несет уникальный код и может быть идентифицирована по этому коду, и где каждую гранулу покрывают специфической биомолекулой, которая избирательно связывается или предпочтительно гибридизуется с указанными биомолекулами, которые идентифицируют; ii) набора биомолекул, которые идентифицируют, iii) набора химических реагентов для проведения биологических реакций, предпочтительно ПЦР и циклического секвенирования iv) емкости для хранения разбавленного набора гранул, набора химических реагентов и биомолекул в буферном растворе; v) мультикапиллярного массива по меньшей мере с одним капилляром; vi) насосного приспособления для обеспечения движения указанных гранул из указанной емкости по капиллярному массиву; vii) систему возбуждения для возбуждения сигнала от гранул, который несет информацию о кодах гранул, а также информацию по связыванию биомолекул с гранулами, viii) прибора для обнаружения закодированных сигналов на указанных гранулах, детектирования связывания указанных биомолекул с соответствующими указанными гранулами при их прохождении по указанным капиллярам; ix) устройства для переноса и регистрации данных обнаружения; и х) устройства для обработки указанных данных, которое обладает способностью идентифицировать коды каждой индивидуальной гранулы; b) подачу с помощью насоса набора гранул из емкости по мультикапиллярному массиву с) возбуждение гранул с помощью указанного устройства для возбуждения в условиях, при которых сигнал генерируется в указанной грануле; d) детектирование указанного сигнала с помощью указанного прибора для детектирования и е) обработку указанных сигналов с помощью указанных приспособлений в условиях, при которых любой квалифицированный в данной области специалист в состоянии идентифицировать коды для каждой индивидуальной гранулы.

В дополнительных вариантах указанная последовательность биологических реакций включает в себя циклическое секвенирование, и указанную последовательность химических реакций, и обнаружение гранул, и идентификацию повторяют, что дает возможность секвенирования последовательностей нуклеиновых кислот. В дополнительных вариантах изобретение относится к оборудованию, которое производит детектирование гранул, раскрываемых здесь.

В некоторых вариантах изобретение относится к системе секвенирования ДНК с помощью циклического секвенирования методом синтеза, который выполняют на гранулах в трехмерных емкостях и с использованием монолитных мультикапиллярных массивов для разделения гранул.

В некоторых вариантах изобретение относится к адресуемым гранулам, используемым одновременно для поиска по всему множеству нуклеиновых кислот до тех пор, пока каждая гранула не найдет свою добычу, за исключением добычи, которая здесь не существует, и затем каждую гранулу подвергают анализу, где идентифицируют гранулы и определяют нашли ли гранулы то, за чем они направлялись для нахождения. В некоторых вариантах изобретение относится к системе ПЦР в нанометровом масштабе для количественного анализа молекулярных маркеров рака. В дополнительных вариантах указанные маркеры представляют собой теломеразные повторы. В дополнительных предпочтительных вариантах указанные маркеры являются флуоресцентно меченными.

В дополнительных вариантах изобретение относится к амплификации одиночных молекул в капиллярах, заполненных чередующимися зонами реагенов для ПЦР нанолитрового объема. В дополнительных вариантах зоны чередуют с зоной водных растворов реагентов для ПЦР зоной масла.

В другом варианте изобретение относится к способу, содержащему предоставление библиотеки ДНК на закодированных гранулах, секвенирование путем синтеза на индивидуальных гранулах с последующим потоком гранул и обнаружением в мультикапиллярном массиве.

В дополнительных вариантах способ содержит приготовление библиотеки ДНК на гранулах с закодированным спектром излучения; инкубирование гранул с меченным нуклеотидом, например, А; обнаружение закодированной гранулы с помощью встроенного меченного нуклеотида с использованием мультикапиллярного массива; отщепление флуоресцентных меток от встроенных нуклеотидов; и повторения шагов с использованием другого нуклеотида, например А, Т, С, G, U.

В дополнительных вариантах гранулы прокачивают из пробирки через мультикапиллярный массив с мультицветовым освещением после каждого цикла инкубации с меченными нуклеотидами. Детектирование индивидуальных гранул проводят в реальном масштабе времени с помощью лазерного или светового источника, излучающего освещенность для возбуждения флуоресценции и камеры ПЗС (пер., CCD-камера) на основе устройства с зарядовой связью (пер., для преобразования светового изображения в цифровое). В некоторых вариантах каждая гранула несет индивидуальный спектральный код для того, чтобы специфические последовательности могли быть связаны с индивидуальными гранулами даже при изменении пространственного положения гранул. Параллельное детектирование последовательности выполняют проталкиванием гранул через стеклянный монолитный мультикапиллярный массив, состоящий из k×1 капилляров квадратной формы, например, 100×100, внутренний диаметр которых составляет 2-5 мкм, шаг 5-10 мкм, длина капилляров 2-3 см.

В предпочтительном варианте гранулы несут от 10⁶ до 10⁹ индивидуальных спектральных кодов. В других предпочтительных вариантах монолитные мультикапиллярные массивы имеют от 1000 до 100.000 капилляров.

В другом предпочтительном варианте оптическая система обнаружения обладает способностью к обнаружению до 10 цветов с разрешением 2 мкм на площади до 1 см².

В некоторых вариантах изобретение относится к используемым гранулам, которые представляют собой оптически закодированные с использованием сегментированных нанопалочек, стекла, легированного редкоземельными элементами, флуоресцентных коллоидных частиц кремния, фотообесцвеченных структур, коллоидного золота, связанного с олигонуклеотидами, или усовершенствованных наночастиц Рамана.

В предпочтительных вариантах используют люминесцирующие квантовые точки. Даже в более предпочтительных вариантах мезопористые полистирольные гранулы закодированы с помощью покрытых сурфактантом квантовых точек, которые могут быть идентифицированы с помощью проточной цитометрии при считывании свыше вплоть до 1000, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000 или 10000000 гранул в секунду.

В некоторых вариантах изобретение относится к нанокристаллам квантовых точек с множеством различных размеров в нанокристаллическом ядре, то есть, квантовые точки множества дискретных размеров смешивают и заключают в оболочку. Так как квантовая точка малого размера порождает специфическую флуоресценцию, отличную от флуоресценции квантовой точки большего размера, то нанокристалл, содержащий смесь малых и больших квантовых точек, приведет к образованию многочисленных флуоресцентных сигналов при возбуждении.

Кроме того, в некоторых вариантах изобретение относится к нанокристаллам, у которых относительное число мелких или крупных квантовых точек может быть отрегулировано с целью усиления или снижения величины флуоресцентного сигнала при специфической длине волны.

В определенных вариантах изобретение относится к отслеживанию специфических модификаций нанокристалла с помощью специфического строения квантовой точки для существования конкретной биомолекулы, присоединенной к наружной поверхности. Биологическая молекула, присоединенная к наружной поверхности нанокристалла, может быть подвержена воздействию композиции, содержащей связывающие молекулы.

В дополнительных вариантах биомолекулы представляют собой последовательности нуклеиновых кислот, которые гибридизованы со специфическими комплементарными последовательностями.

В определенных вариантах изобретение относится к предоставлению множества нанокристаллов, представляющих собой множество нанокристаллических ядер, содержащих множество размеров квантовых точек и множество чисел квантованых точек специфического размера.

В некоторых вариантах изобретение относится к системе на основе гибридизации биомолекул или клеток с использованием многоцветовых гранул, которые имеют отличительные цветовые характеристики и несут специфические генетические зонды.

В конкретных вариантах не предполагается, что формула изобретения ограничивается способом кодирования гранул с помощью цвета. Существуют различные способы кодирования гранул с помощью наличия нескольких цветов, например, добавления молекулярных красителей к частице. В предпочтительном варианте гранулы микрометровой шкалы содержат мультицветовые квантовые точки. Не предполагается, что флуоресцентная эмиссия квантовых точек ограничивается видимым светом.

В предпочтительных вариантах флуоресцентная эмиссия содержит синий цвет. В других вариантах флуоресцентная эмиссия представляет собой инфракрасное излучение. В некоторых вариантах кодирующий сигнал может быть цифровым, например, кодирующий цвет является или присутствующим, или отсутствующим.

В некоторых вариантах кодирующий сигнал может быть аналоговым, то есть, измерение интенсивности относительной эмиссии. Это может быть выполнено для каждого отдельного цвета.

В некоторых вариантах изобретение относится к способу применения набора закодированных гранул, покрытых с помощью специфических молекулярных зондов методом гибридизационного анализа в однопробирочном формате. Гибридизацию с использованием закодированных гранул делают методом спектрального кодирования. При использовании N числа цветов может быть идентифицировано 2^N индивидуальных цветовых комбинаций. При использовании N числа цветов и М числа интенсивностей частот разрешения может быть идентифицировано 2^NM индивидуальных цветовых комбинаций. Например, 65000 уникальных гранул может быть закодировано с использованием или 16 цветов, или 4 цветов с 4 различными интенсивностями разрешений. После гибридизации проба может быть подана насосом в трехмерный многоканальный анализатор. Любой специалист в данной области может обнаружить индивидуальные гранулы в режиме реального времени с помощью лазера или другого светоизлучающего источника, такого как светоизлучающий диод. Обнаружение потока гранул может быть выполнено с помощью цифровой камеры или с верхней части, или с боковой части многоканального анализатора. Затем детектированный сигнал цифровой или аналоговый переносят в компьютер для хранения и анализа.

В других вариантах изобретение относится к технологической установке капиллярного блока, содержащей болванку для придания формы капиллярам, имеющей подающий сегмент, нагревательный элемент, зону для хранения раствора для покрытия внутренних полостей и наружной части монолита, лампы, предпочтительно ультрафиолетовые лампы для обработки монолита, и роллеры для передвижения монолита.

В других вариантах изобретение относится к гранулам, содержащим антитела, где указанная гранула имеет множество люминесцирующих маркеров. В дополнительных вариантах антитела связывают аминокислотные последовательности, которые встраивают в нуклеотиды.

В других вариантах изобретение относится к нуклеотидам, конъюгированным с аминокислотными последовательностями, связанными через фоторазлагаемый агент, где указанные аминокислотные последовательности будут связываться с антителами, конъюгированными с гранулами с множеством люминесцирующих маркеров, предпочтительно квантовых точек.

В дополнительных вариантах изобретение относится к секвенированию нуклеиновых кислот с использованием гранулы, содержащей антитела с множеством люминесцирующих маркеров. В дополнительных вариантах изобретение относится к способу обнаружения или секвенированию нуклеиновой кислоты с помощью нуклеотидов, конъюгированных с аминокислотной последовательностью.

В дополнительных предпочтительных вариантах нуклеиновую кислоту пришивают через фоторазлагаемый компонент, и в дополнительном варианте указанная аминокислотная последовательность представляет собой эпитоп для антитела, конъюгированного с гранулой, содержащей квантовые точки.

В некоторых вариантах изобретение относится к способу встраивания нуклеотида в растущую двухцепочечную нуклеиновую кислоту, содержащему смешивание нуклеиновой кислоты и нуклеотида, конъюгированного с маркером, предпочтительно маркер представляет собой аминокислотную последовательность, конъюгированную с фоторазлагаемым линкером, в условиях, при которых указанный нуклеотид гибридизуется с комплементарным основанием и лигируется с растущей нитью последовательности нуклеиновой кислоты; смешивание последовательности нуклеиновой кислоты со встроенным нуклеотидом с антителом, обладающим специфическим связыванием эпитопа с указанной аминокислотной последовательностью, конъюгированной с нуклеотидом, где указанное антитело конъюгируют с люминесцирующим маркером, предпочтительно гранулой, содержащей квантовую точку; определение указанного люминесцирующего маркера антитела; и установление соотношения указанного маркера с встроенным/лигированным нуклеотидом.

В дополнительных вариантах указанную нуклеиновую кислоту конъюгируют с твердым носителем. В дополнительных вариантах носитель представляет собой матрицу, причем содержание последовательности нуклеиновой кислоты коррелирует с положением в матрице.

В других вариантах изобретение относится к способу манипулирования последовательностями нуклеиновых кислот и нуклеотидами с использованием композиций и приспособлений, раскрытых здесь.

В дополнительном варианте изобретение относится к способу применения гранул с закодированным спектром излучения в способах подлинности документа.

В некоторых вариантах изобретение относится к способу определения подлинности документа, содержащему а) предоставление i) документа, содержащего множество закодированных гранул, где указанные закодированные гранулы содержат два или несколько люминесцирующих маркеров, с конфигурацией, созданной для предоставления люминесцирующей конфигурации, ii) электромагнитного излучения, и iii) прибора для детектирования электромагнитного излучения; b) размещение указанного документа в указанном электромагнитном излучении в условиях, при которых указанные квантовые точки люминесцируют, и с) детектирование указанной люминесцирующей конфигурации с помощью указанного прибора; и d) коррелирование люминесцирующей конфигурации с подлинностью указанного документа. В дополнительных вариантах указанный документ представляет собой банковский чек. В дополнительных вариантах указанный документ представляет собой наличные деньги. В дополнительных вариантах указанное электромагнитное излучение представляет собой ультрафиолетовое излучение. В дополнительных вариантах указанные люминесцирующие маркеры представляют собой квантовые точки.

В некоторых вариантах изобретение относится к способу передвижения гранулы по каналу, содержащему: а) предоставление: i) гранулы, содержащей первую люминесцирующую метку и вторую люминесцирующую метку, ii) канала, iii) раствора внутри указанного канала, в котором указанные гранулы находятся внутри указанного раствора, iv) пары электродов; и b) приложения потенциала между указанной парой электродов в условиях, при которых указанная гранула двигается в указанном канале по направлению к одному электроду указанной пары электродов. В дополнительных вариантах указанная гранула представляет собой пористую полистирольную гранулу. В других вариантах указанные первая и вторая люминесцирующие метки представляют собой квантовые точки. В дополнительных вариантах указанная гранула является заряженной. В дополнительных вариантах указанная гранула имеет поверхность, функционализированную карбоксильными группами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1 демонстрирует приготовление гранулы с люминесцирующими маркерами и конъюгирование последовательностей нуклеиновых кислот маркеров заболеваний.

Фиг.2 демонстрирует схему метода секвенирования ДНК. Метод содержит следующие стадии: получение библиотеки ДНК на гранулах с закодированным спектром излучения; инкубирование гранул с меченными нуклеотидами (например, А);

детектирование гранул с закодированным спектром излучения со встроенными меченными нуклеотидами в ММСА с использованием микронасоса; отщепление флуоресцирующих меток от встроенных нуклеотидов; и добавление следующего нуклеотида и повторение всех шагов. Каждая гранула несет индивидуальный спектральный код, для установления взаимосвязи между специфическими последовательностями и индивидуальными гранулами даже при возможном изменении пространственного положения гранул. Детектирование последовательности с высокой степенью параллелизма выполняют путем проталкивания гранул через стеклянный монолитный мультикапиллярный массив, который состоит из квадрата k×1 капилляров (например, 100×100).

Фиг.3 демонстрирует применение мультикапиллярного массива в способах синтеза и обнаружения. Гранулы прокачивают с помощью насоса из пробирки через монолитный мультикапиллярный массив (ММСА). Детектирование индивидуальных гранул выполняют от верхней части ММСА в режиме реального времени с помощью лазера или светодиодного источника света для возбуждения флуоресценции и высокочувствительных видеокамер на основе ПЗС-матриц.

Фиг.4 демонстрирует способ создания гранул многих цветов и градаций. Большое количество М неокрашенных пористых гранул (М>>10⁹) распределяют между 10 лунками, заполненными растворами квантовых точек первого типа различной концентрации (QD₁). После встраивания QD₁ в гранулы содержимое всех 10 лунок смешивают вместе, гранулы промывают и произвольно распределяют между 10 лунками следующего набора, заполненными различными концентрациями QD₂. Процедуру повторяют 9 раз и после 9-го цикла получают набор М гранул, которые несут все возможные комбинации 10⁹ цветовых кодов. В другом варианте изобретение относится к способу, при котором большое количество М неокрашенных пористых гранул (М>>10⁹) распределяют между 25 лунками, заполненными растворами смесей из QD₁ и QD₂ в различных концентрациях. После встраивания квантовых точек в гранулы содержимое всех 25 лунок смешивают вместе, гранулы промывают и произвольно распределяют между 20 лунками следующего набора, заполненными различными концентрациями QD₃+QD₄. Процедуру повторяют Т раз, добавляя новые наборы лунок с различными концентрациями различных квантовых точек. После Т цикла получают набор М гранул, которые несут все возможные комбинации цветовых кодов.

Фиг.5 иллюстрирует предпочтительный вариант системы идентификации гранул, имеющей лазерное облучение находящихся гранул и детектирование облученных гранул с помощью множества детекторов на основе ПЗС-матриц.

Фиг.6 иллюстрирует предпочтительный вариант системы для перемещения гранул в жидкости с помощью монолитного мультикапиллярного массива (ММСА).

Фиг.7 иллюстрирует изготовление ММСА. ММСА производят из слитков и наконечников, которые нагревают для образования массива в ходе процесса вытягивания, смотри пример 5.

Фиг.8 демонстрирует электрофореграмму, соответствующую обнаруженным гранулам, протекающим через капиллярный канал. Полистирольные гранулы размером 2 мкм, покрытые стрептавидином, подвергали мечению с помощью флуоресцеина с использованием инкубирования с биотинилированным антителом, за которым следует инкубирование с антителом, конъюгированным с флуоресцентной меткой.

Фиг.9 демонстрирует фотографию линейного ММСА с квадратными отверстиями, имеющего 32 канала в пределах 3 миллиметров.

Фиг.10 демонстрирует фотографию поперечного разреза стеклянного ММСА с квадратными отверстиями, имеющего массив 32 на 24 с общим числом каналов 728.

Фиг.11 иллюстрирует примеры нуклеотидов с флуоресцентными маркерами для применения в секвенировании нуклеиновых кислот и детектирования, раскрываемого здесь.

Фиг.12 иллюстрирует пример способа создания нуклеотидов, описанных в фиг.11.

Фиг.13 иллюстрирует пример способа обнаружения нуклеиновых кислот с помощью нуклеотида с маркером, узнаваемым антителом, пришитым к люминесцирующей грануле, и встраивание нуклеотида в растущую цепь нуклеиновой кислоты.

Фиг.14 иллюстрирует способ применения гранул с маркерами нуклеиновых кислот.

Фиг.15 иллюстрирует устройство для считывания гранул в одном капилляре.

Фиг.16 иллюстрирует перемещение гранул в капилляре под действием электрического поля (Пример 10).

Перечень подписей в чертежах

100 CCD - Прибор на основе ПЗС-матрицы

200 Мультицветовое облучение

300 Монолитный мультикапиллярный массив (ММСА)

400 Поток гранул

500 Гранулы с цветовой индикацией

700 Гранулы, движущиеся в направлении стрелки

800 Лазер

900 Дихроичное зеркало

1000 CCD-Прибор на основе ПЗС-матрицы

1100 Зеркало

1200 Компьютер (ПК)

1300 Процессор для обработки данных (Компьютер для обработки данных)

1500 Шприц 1

1600 Коллектор 1

1700 Резервуар 1

1800 Коллектор 2

1900 Коллектор 3

2000 Шприц 2

2300 Резервуар 2

2400 Направление гранул во время детектирования

2500 Направление гранул во время возврата

2600 Система облучения (лазер)

2700 Слиток ММСА

2800 Подача на слиток

2900 Нагревательный элемент

3000 Нанесение покрытия на ММСА

3100 УФ-лампы

3200 Роллеры

3300 Лазерный луч

3400 Капилляр

3500 Гранула

3600 Флуоресценция

3700 Призма

4000 Лунка 1 с первым электродом +(-)

4100 Лунка 2 со вторым электродом -(+)

4200 Капилляр

4300 Гранула

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способам и приборам, применяемым при разделении, обнаружении и идентификации биологических молекул и, в случае гетерополимерных молекул, их секвенирование. В предпочтительном варианте изобретение относится к системе секвенирования ДНК на основе циклического секвенирования путем синтеза, выполненного на гранулах ограниченных пространством трехмерных сосудов. Гранулы детектируют при их прохождении через монолитные мультикапиллярные картриджи. В другом варианте изобретение относится к грануле, содержащей две или несколько люминесцирующих меток, пришитых к нуклеиновой кислоте. В дополнительном варианте указанные люминесцирующие метки представляют собой квантовые точки.

Раскрытые системы секвенирования ДНК предоставляют существенные достижения, предназначенные для определения этиологии заболеваний человека и для их предупреждения, диагностирования и лечения, в том числе сравнительного анализа профилей опухолей и подтипов опухолей в сравнении с нормальными подтипами для идентификации генетических основ злокачественных опухолей; геномного профиля иммунной, кардиоваскулярной, нервной и других систем при нормальных и патологических состояниях; анализа профиля экспрессии на геномном уровне в функциональной геномике; геномной идентификации патогенных микроорганизмов и подробному комментарию к штаммам, резистентным к лекарственным средствам, и сплошного секвенирования индивидуальных геномов человека в качестве элемента индивидуальной медицинской помощи.

Используемый в настоящем описании термин "канал" означает объем, ограниченный частично не проницаемым для растворов материалом. Часто канал используют для удерживания жидкости или твердого вещества, или жидкой суспензии. Не предполагают, что каналы могут иметь любую специфическую форму. Однако в предпочтительных вариантах каналы имеют форму цилиндров. Даже в более предпочтительном варианте каналы представляют собой капилляры.

Используемый в настоящем описании термин "капилляр" означает канал достаточно малого размера для обеспечения капиллярного действия на материалы в канале. В других предпочтительных вариантах канал изготавливают из материала, который является светопроницаемым. Капиллярный массив или мультикапиллярный массив представляет собой группу из двух или нескольких капилляров. Примеры предоставляют на фиг.9 и 10. Капиллярное действие, или капиллярность, или капиллярное движение, происходит в тех случаях, когда адгезивные межмолекулярные силы между поверхностью раздела газ-жидкость жидкости в трубке и внутренней поверхностью стенки трубки при этом связывании превышают межмолекулярные когезионные силы между поверхностью раздела газ-жидкость и жидкостью ниже данной поверхности раздела. При таких условиях трубка стремится к продвижению жидкости внутри нее так, что газ внутри нее вытесняется. Такую трубку типично называют капиллярной трубкой.

Используемый в настоящем описании термин "проницаемый" по отношению к материалу означает материал, через который может проходить электромагнитное излучение, предпочтительно, но не ограничиваясь этим, видимый свет. Имеют в виду, что проницаемый канал означает проницаемый на протяжении, которое должно быть облучено в канале, или через которое должен пройти свет, и испускание света на детектор для надежного функционирования прибора, частью которого он является. В отношении материалов, таких как пластмасса или стекло, которые являются проницаемыми, не предполагают, что все электромагнитное излучение проходит через материал. Например, материал, который отфильтровывает, отражает или поглощает определенные длины волн видимого света, все еще считают проницаемым.

Используемый в настоящем описании термин "гранула" означает материал с периметром площади предпочтительно менее чем 5 сантиметров и более чем 300 нанометров. Предпочтительно гранула является сферической по существу. Также гранула могла иметь форму палочки или кубика, но это не предполагает, что гранула ограничится этими формами. Предпочтительно гранулу делают из материала, который является устойчивым к растворению в жидкости, в которой ее суспендируют. Предпочтительно гранулу изготавливают из полимера или металла, или их комбинации, но это не предполагает, что гранула ограничивается этими материалами. Предполагают, что наружная поверхность гранулы может по химическому составу отличаться от ее внутреннего химического состава. Также предполагают, что внутреннее пространство гранулы может иметь поры, которые содержат материалы, которые не являются частью химического состава самой. Reigler et al. Analytical and Bioanalytical Chemistry 384(3): 645-650 (2006) рассматривает закодированные полимерные гранулы для флуоресцентного мультиплексирования, в том числе возможность применения полистирольных гранул, нагруженных нанокристаллами различных типов.

Физическое отделение ДНК от мелких гранул предпочтительно облегчают помещением смеси ДНК-гранула в электрическое поле между парой электродов, может быть создана ДНК для более быстрой миграции к одному электроду, чем гранулы, осуществляя таким образом четкое разделение.

В некоторых вариантах изобретение относится к движению гранул с использованием электрического потенциала. Было обнаружено, что функционализированные карбоксильными группами гранулы размером 500 нм из полистирола с дивенилбензолом, покрытые квантовыми точками (CrystalPlex Plex), могут быть перемещены в капиллярном канале с помощью электродов. Предполагают, что другие заряженные гранулы, такие как гранулы функционализированные аминами, также могут быть перемещены в электрическом поле.

Как используют здесь, термин "твердофазная подложка" используют в отношении любого твердого или стационарного материала, к которому пришивают реагенты, такие как антитела, антигены и другие исследуемые компоненты. Например, в методе ELISA лунки планшетов для микротитрования представляют собой твердые подложки. Другие примеры твердых подложек включают в себя предметные стекла, покровные стекла, гранулы, частицы, культуральные колбы, а также и любое другое подходящее изделие.

Используемый термин "ячейка" означает контейнер или резервуар для хранения жидкости. Не предполагают, что емкость ограничивается любой конкретной формой.

"Метка" означает структуру, поддающуюся обнаружению относительно фона вследствие ее свойств, в том числе без ограничения спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунохимических и химических. Например, пригодные метки включают в себя флуоресцирующие белки, такие как зеленые, желтые, красные или синие флуоресцирующие белки, ³²P, флуоресцентные красители, электронно-плотные реагенты, ферменты (например, широко используемые в ELISA), биотин, дигоксигенин или гаптены, и белки, для которых имеются в наличии антисыворотки или моноклональные антитела.

Термин "различные концентрации" в отношении меток и маркеров внутри или на поверхности гранул означает количество метки на гранулу.

Люминесценция означает свойство конкретных материалов, в которое приводит их поглощаемая электромагнитная энергия при данной длине волны и излучение при другой длине волны. Примеры включают в себя флуоресценцию, биолюминесценцию и фосфоресценцию. Люминесценция может быть вызвана химическими или биохимическими изменениями, энергией электрического поля, внутриатомными движениями, взаимодействиями в кристаллах или другой, как правило, нетепловой стимуляцией электронного состояния атомарной системы. "Люминесцирующая метка " или "маркер" представляет собой молекулярную конструкцию, способную к излучению света, которую пришивают или ковалентно, обычно через линкер, или посредством ионных, вандерваальсовых, водородных связей, или любой физической пространственной связи к другому материалу, веществу или молекуле. Предпочтительно люминесцирующая метка или маркер представляет собой молекулу, обладающую ароматичностью, или молекулу с высоким содержанием сопряженных двойных связей в виде типично обнаруживаемых в флуоресцентных красителях, или квантовые точки или их комбинации.

Используемый в настоящем описании термин "люминесцирующие электромагнитные коды" или "спектральные коды" означает детектируемое множество индивидуально различимых длин волн электромагнитного излучения и соответствующей различимой индивидуальной интенсивности, которая происходит в результате люминесценции. В предпочтительных вариантах люминесцирующие электромагнитные коды находятся в видимой области, то есть градации видимых цветов. Пример 2 описывает создание гранул со спектральными кодами, и фиг.4 иллюстрирует создание гранул с более чем тремя дискретными видимыми цветами. "Уникальный люминесцирующий электромагнитный код" означает специфический люминесцирующий электромагнитный код.

"Удаляемый люминесцирующий маркер" представляет собой люминесцирующий маркер, который отсоединяется при действии конкретного условия. Пример удаляемого люминесцирующего маркера, присоединенного к нуклеотиду, предоставляют на фиг.11. Типичные маркеры могут быть приготовлены (или соответствующим образом модифицированы) в соответствии с Seo et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102(17): 5926-5931 (Figure 12). После внедрения этих нуклеотидов в растущую цепь ДНК в жидкой фазе полимеразной реакции возможно отсоединение флуорофора с помощью облучения лазером (~355 нм).

Используемый термин "лигирование" в отношении нуклеиновых кислот и нуклеотидов означает процесс соединения двух или нескольких нуклеиновых кислот, нуклеотидов или их сочетаний путем создания ковалентной фосфодиэфирной связи между 3-гидроксилом одного нуклеотида и 5'-фосфатом другого. Не предусматривают, что это ограничивается активностью ДНК-лигазы, но также включает в себя активность ДНК-полимеразы.

Используемый термин "партнеры по связыванию" относится к двум молекулам (например, белкам), которые обладают способностью, или предположительно обладают способностью физического взаимодействия друг с другом, так что взаимодействие изменяет физическое, химическое или биологическое свойство одной или обеих молекул, действующих независимо друг от друга. Используемые здесь термины "первый партнер по связыванию " и "второй партнер по связыванию " относятся к двум молекулярным разновидностям, которые обладают способностью, или предположительно обладают способностью физического взаимодействия друг с другом. Термины "специфическое связывание" и "специфически связанный" при использовании в отношении взаимодействия между антителом и антигеном описывает взаимодействие, которое зависит от наличия конкретной структуры (то есть антигенной детерминанты или эпитопа) на антигене. Другими словами, антитело узнает и связывается с белковой структурой, уникальной для антигена, а не связывается вообще со всеми белками (то есть неспецифическое связывание).

Используемый в настоящем описании термин "фенотип" означает наблюдаемые физические или биохимические характерные признаки организма, такие как, но без ограничения, начало заболевания под воздействием факторов окружающей среды. Полагают, что генетический состав влияет на возникновение заболевания. Например, было обнаружено, что однонуклеотидный полиморфизм гена PTPN22 (протеинтирозинфосфатазы, нерецепторного типа 22), 1858С/Т, является ассоциированным со многими аутоиммунными заболеваниями. Предполагают, что предрасположенность к диабету 1 типа коррелирует с локусом на хромосоме 10p11-q11 (временно обозначенный IDDM10); серповидно-клеточная анемия вызывается точечной мутацией в гене бета-гемоглобина (НВВ), обнаруженного на хромосоме 11р15.4; аллель АРОЕ е4 соответствует предрасположенности к болезни Альцгеймера с поздним началом Saunders, A.M. et al. (1993) NeuroBiol. 43, 1467-72; аллель 1691G/A V фактора (FV Leiden) связана с наследственным тромбозом глубоких вен (Corder, E.H. et al. (1994) Nat. Genet. 7, 180-4), и несколько форм гена цитохрома с450 (CYP) оказывают влияние на метаболизм лекарственных веществ (van der Weide, J. and Steijn, L.S. (1999) Ann. Clin. Biochem. 36, 722-9, Tanaka, E. (1999) Update: J. Clin. Pharm. Ther. 24, 323-9).

"Субъект" означает любое животное, предпочтительно человек (human patient -"человеческий пациент»), крупный рогатый скот или домашнее животное.

Используемый в настоящем описании термин "антитело" (или "антитела") относится к любому иммуноглобулину, который связывается специфически с антигенной детерминантой, и специфически связывается с белками, идентичными или структурно родственными к антигенной детерминанте, которая стимулировала их образование. Таким образом, антитела являются пригодными в анализах по обнаружению антигена, который стимулировал их образование. Моноклональные антитела получают из одного клона В-лимфоцитов (то есть В-клеток) и являются обычно гомогенными по структуре и антигенной специфичности. Поликлональные антитела возникают из многих различных клонов антителопродуцирующих клеток и таким образом являются гетерогенными в отношении их структуры и эпитопной специфичности, но все они узнают один и тот же антиген. В некоторых вариантах изобретения моноклональные и поликлональные антитела применяют в виде неочищенных препаратов, тогда как в предпочтительных вариантах изобретения эти антитела очищают. Например, в некоторых вариантах изобретения применяют поликлональные антитела, содержащиеся в неочищенной антисыворотке. Предполагают также, что термин "антитело" охватывает любой иммуноглобулин (например, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, и т.д.), или его фрагмент, независимо от того связан ли он с другим заместителем химической связью или существует в виде рекомбинантного слитого продукта, при условии только, что он обладает способностью служить в виде партнера по связыванию с антигеном. Такие антитела могут быть получены из любого источника (например, организма человека, грызунов, всех приматов кроме человека, зайцеобразных, козлиные антитела, бычьи, лошадиные, овечьи и т.д.).

Используемый в настоящем описании термин "антиген" используют в отношении любой субстанции, которая способна узнаваться антителом. Предполагают, что этот термин охватывает любой антиген и "иммуноген" (то есть вещество, которое индуцирует образование антител). Таким образом, в иммуногенной реакции антитела продуцируются в ответ на присутствие антигена или части антигена. Термины "антиген" и "иммуноген" применяют в отношении индивидуальной макромолекулы macromolecule или к гомогенной, или гетерогенной популяции антигенных макромолекул. Предполагают, что термины антиген и иммуноген охватывает белковые молекулы или частей белковых молекул, которые содержат один или несколько эпитопов. Во многих случаях антигены также являются иммуногенами, таким образом, термин "антиген" часто применяют поочередно с термином "иммуноген". В некоторых предпочтительных вариантах изобретения иммуногенные вещества применяют в виде антигенов в анализах на обнаружение присутствия подходящих антител в сыворотке иммунизированного животного.

Термины "антигенная детерминанта" и "эпитоп" используют здесь для обозначения той части антигена, которая контактирует с вариабельной областью конкретного антитела. При использовании белка или фрагмента (или части) белка для иммунизации животного-хозяина многочисленные области белка, вероятно, индуцируют образование антител, которые связываются специфически с конкретной областью или трехмерной структурой белка (такие области и/или структуры именуют "антигенные детерминанты"). В некоторых ситуациях антигенные детерминанты конкурируют с интактным антигеном (то есть, "иммуноген" использовали для получения иммунного ответа) за связывание с антителом.

Используемый в настоящем описании термин "ELISA" (далее ИФА) относится к твердофазному иммуноферментному анализу (или ИФА). Многочисленные методы ИФА и приложения известны в данной области и описаны во многих ссылках (смотри, например, Crowther, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (El-ISA)," in Molecular Biomethods Handbook, Rapley et al. [eds.] pp.595-617, Humana Press, Inc., Totowa, NJ. [1998]; Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press [1988]; Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 11, John Wiley & Sons, Inc., New York [1994]). Кроме того, существует множество коммерчески доступных тест-систем ИФА.

Один из методов ИФА, используемых в изобретении, представляет собой "прямой способ проведения ИФА", при котором обнаруживают антиген в пробе. В одном варианте прямого ИФА пробу, содержащую антиген, подвергают воздействию носителя (например, гранулы) в условиях, при которых антиген иммобилизуется на структуре таким образом, что после этого позволяет антигену быть обнаруженным прямым способом с использованием специфичного для антигена антитела, конъюгированного с ферментом. Обнаруженные продукты взаимодействия, катализированного ферментом, указывают на присутствие иммобилизованного антигена, а также на поддерживающую структуру, к которой он присоединен.

В альтернативном варианте воплощения изобретения специфическое для антигена антитело обнаруживают в пробе. В этом варианте пробу, содержащую антитело, подвергают воздействию носителя (например, гранулы) в условиях, при которых антитело иммобилизуется на структуре. Антигенспецифическое антитело впоследствии обнаруживают с помощью очищенного антигена и специфичного для антигена антитела, конъюгированного с ферментом.

В альтернативном варианте используют "непрямой способ проведения ИФА". В одном варианте антиген (или антитело) иммобилизуют на твердом носителе (например, грануле), как в прямом способе ИФА, но обнаруживают непрямо, добавлением сначала антигенспецифического антитела (или антигена), за которым следует добавление детектирующего антитела, специфического для антитела, которое специфически связывает антиген, также известных как "видоспецифические" антитела (например, козьи анти-кроличьи антитела), доступные от различных производителей, известных в данной области (например, Santa Cruz Biotechnology; Zymed; и Pharmingen/Transduction Laboratories).

Используемый термин "иммобилизованное антитело" относится к антителу, которое используют в сэндвич-ИФА для связывания (то есть захвата) антигена в пробе до обнаружения антигена. В одном варианте воплощения изобретения используют биотинилированные иммобилизованные антитела вместе с нагруженной авидином твердой подложкой. Затем используют другое антитело (то есть детектирующее антитело) для связывания и детектирования комплекса антиген-антитело, эффект образования "сэндвича", состоящего из антитело-антиген-антитело (то есть сэндвич-ИФА).

Используемый в настоящем описании термин "детектирующее антитело" заключает в себе средство для визуализации или количественного определения типично конъюгированное с молекулой фермента, что дает цветную или флуоресцентную реакцию продукта после добавления подходящего субстрата. Конъюгированные ферменты, обычно используемые вместе с обнаружением антител в ИФА, включают в себя пероксидазу хрена, уреазу, щелочную фосфатазу, глюкоамилазу и бета-галактозидазу. В некоторых вариантах детектирующее антитело представляет собой анти-видовое антитело. Альтернативно детектирующее антитело получают с меткой, такой как биотин, флуоресцентный маркер или радиоизотоп и детектируют и/или определяют количество с помощью этой метки.

"Прибор с зарядовой связью" или "CCD" представляет собой датчик изображения, состоящий из интегральной схемы, содержащей массив соединенных или сопряженных светочувствительных конденсаторов. Предпочтительно фотодиод превращает свет в электронный сигнал для прибора.

"Дихроичное зеркало" представляет собой светофильтр, используемый для селективного отражения света гаммы цветов при прохождении других цветов.

Используемый в настоящем описании термин "объект" означает материальный предмет.

Используемый в описании термин "нуклеотид" представляет собой химическое соединение, которое состоит из гетероциклического основания, сахара и одной или нескольких фосфатных групп. Предпочтительно нуклеиновое основание представляет собой производное пурина или пиримидина, и сахар представляет собой пентозу (пятиуглеродный сахар) дезоксирибозу или рибозу. Нуклеотиды представляют собой мономеры нуклеиновых кислот, образующие при соединении вместе трех или нескольких нуклеотидов "нуклеотидную последовательность". Нуклеиновая кислота может быть двухцепочечной (двунитевой) или одноцепочечной (однонитевой). Термин "полинуклеотид", используемый здесь, представляет собой нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, которая является длиннее чем приблизительно 100 нуклеотидов в длину. Термин "олигонуклеотид", используемый здесь, представляет собой короткий полинуклеотид или отрезок полинуклеотида. Олигонуклеотид типично содержит последовательность от приблизительно двух до приблизительно ста оснований. Слово "олиго" иногда используют вместо слова "олигонуклеотид".

Указывают, что последовательности должны иметь "5'-конец" (5' конец) и "3'-конец" (3'конец), поскольку фосфодиэфирные связи нуклеиновой кислоты возникают у 5'-углерода и 3'-углерода пентозного кольца соседних мононуклеотидов. Конец полинуклеотида, у которого была бы новая связь с 5'-углеродом, является его 5'-концевым нуклеотидом. Конец полинуклеотида, у которого была бы новая связь с 3'-углеродом является его 3'-концевым нуклеотидом. Концевой нуклеотид, как используют здесь, представляет собой нуклеотид в концевом положении 3'- и 5'-концов.

В конкретных вариантах "уникальную последовательность" нуклеиновой кислоты присоединяют к грануле. Это означает, что последовательность нуклеиновой кислоты содержит перекрывающиеся идентичные нуклеотидные основания. Предполагают, что перекрывание идентичных нуклеотидных оснований соответствует желаемой последовательности-мишени для гибридизации.

Гибридизация означает соединение (отжиг) одноцепочечной нуклеиновой кислоты или с другой одноцепочечной нуклеиновой кислотой, или нуклеотидом за счет образования водородных связей комплементарной пары (комплементарных пар). На гибридизацию и интенсивность гибридизации (то есть, интенсивность соединения между цепями нуклеиновых кислот) оказывают влияния многие факторы, хорошо известные в данной области, в том числе степень комплементарности соответствующих нуклеотидных последовательностей, строгость условий, таких как концентрация солей, Тпл (температура плавления) образовавшегося гибрида, наличие других компонентов (таких как, наличие или отсутствие полиэтиленгликоля), молярность цепей для гибридизации и G:C содержание цепей нуклеиновых кислот.

Используемый здесь термин "праймер" относится к олигонуклеотиду, независимо от того, природный олигонуклеотид (например, в очищенном препарате после расщепления рестриктазами) или полученный искусственно, действующему в качестве точки инициации синтеза нуклеиновой кислоты при помещении в условия, при которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера, комплементарного цепи нуклеиновой кислоты (то есть, в присутствии нуклеотидов, индуцирующего агента, такого как ДНК-полимераза, и в подходящих условиях температуры и рН). Предпочтительно праймер является одноцепочечным для максимальной эффективности амплификации, но альтернативно может быть двухцепочечным. В случае двухцепочечного, сначала праймер обрабатывают для разделения его цепей перед использованием для приготовления продуктов реакции удлинения. Предпочтительно праймер представляет собой олигодезоксирибонуклеотид. Праймер должен быть достаточно длинным для затравки синтеза продуктов реакции удлинения в присутствии индуцирующего агента. Точные длины праймеров будут зависеть от многих факторов, в том числе температуры, источника праймера и использования метода. Предполагают также, что праймеры могут быть использованы в ПЦР (смотри ниже) для вставки искусственным образом желаемых нуклеотидных последовательностей в концы последовательностей нуклеиновых кислот.

Используемые в настоящем описании термины "комплементарный" или "комплементарность" используют в отношении последовательности нуклеотидов, родственных согласно правилам спаривания оснований. Например, последовательность 5' "A-G-T" 3' является комплементарной последовательности 3' "Т-С-А" 5'. Комплементарность может быть "частичной", при которой только некоторые из оснований нуклеиновых кислот являются подходящими в соответствии с правилами спаривания оснований. Или может быть "полная" или "сплошная" комплементарность между нуклеиновыми кислотами. Степень комплементарности между цепями нуклеиновых кислот оказывает сильные влияния на эффективность и интенсивность гибридизации между цепями нуклеиновых кислот. Это имеет особое значение в реакциях амплификации, а также в способах обнаружения, которые зависят от гибридизации нуклеиновых кислот.

Используемый в настоящем описании термин "полимеразная цепная реакция" ("ПЦР") относится к методу, описанному в патентах США N 4683195, 4889818 и 4683202, все включены посредством ссылки. Эти патенты описывают способы увеличения концентрации сегмента последовательности-мишени в составе геномной ДНК без клонирования или очистки. Этот способ амплификации последовательности-мишени состоит из введения большого избытка двух олигонуклеотидных праймеров в смесь ДНК, содержащую желаемую последовательность-мишень, с последующей прецизионной последовательностью циклического изменения температуры в присутствие ДНК-полимеразы (например, Taq). Два праймера являются комплементарными к соответствующим им цепям двухцепочечной последовательности-мишени. Для осуществления амплификации реакционную смесь денатурируют и затем праймеры подвергают отжигу с комплементарными им последовательностями в молекуле-мишени. После отжига праймеры наращивают с помощью полимеразы для образования новой пары комплементарных цепей. Стадии денатурации, отжига праймеров и наращивания с помощью полимеразы (пер., элонгация) могут быть повторены много раз (то есть денатурация, отжиг и элонгация составляют один "цикл"; может существовать множество "циклов") для получения высокой концентрации амплифицированного сегмента желаемой последовательности-мишени. Длина амплифицированного сегмента желаемой последовательности-мишени представляет собой контролируемый параметр, определенный взаимоположениями праймеров относительно друг друга. Благодаря аспекту повторяющихся циклов процесса способ называют "полимеразной цепной реакцией" (в дальнейшем "ПЦР"). Так как желаемые амплифицированные сегменты последовательности-мишени становятся преобладающими последовательностями в смеси (в переводе на концентрацию), то они, как указывают, являются "ПЦР-амплифицированными".

С помощью ПЦР возможно амплифицировать уникальную копию специфической последовательности-мишени в геномной ДНК до уровня, обнаруживаемого несколькими различными методами (то есть, гибридизацией с меченным зондом; введением биотинилированных праймеров, с последующим обнаружением конъюгатом авидин-фермент; включением ³²Р-меченных дезоксинуклеотидтрифосфатов, таких как dCTP или dATP, в амплифицированный сегмент). В дополнение к геномной ДНК любая олигонуклеотидная последовательность может быть амплифицирована с подходящим набором молекул-праймеров. В частности, амплифицированные сегменты, созданные в процессе самой ПЦР, сами являются эффективными матрицами для последующих ПЦР-амплификаций.

Термин "изолированный" при использовании в отношении нуклеиновой кислоты в виде "изолированный олигонуклеотид" или "изолированный полипептид", относится к нуклеиновой кислоте, которую идентифицируют и отделяют от, по меньшей мере, одной примесной, с которой она обычно ассоциирована в источнике ее содержания. Таким образом, изолированная нуклеиновая кислота находится в форме или окружении, которые отличаются от таковых, в которых она находится в природе. Наоборот, неизолированные нуклеиновые кислоты (например, ДНК и РНК) обнаруживают в состоянии, в котором они существуют в природе. Например, данную ДНК-последовательность (например, ген) обнаруживают в хромосоме клетки-хозяина вблизи соседних генов; РНК-последовательности (например, специфическую мРНК-последовательность, кодирующую специфический белок), обнаруживают в клетке в виде смеси с множеством других мРНК, которые кодируют массу белков. Изолированная нуклеиновая кислота или олигонуклеотид могут существовать в одноцепочечной или двухцепочечной форме. При использовании изолированной нуклеиновой кислоты или олигонуклеотида для экспрессии белка, олигонуклеотиды содержат в минимальном количестве смысловую или кодирующую цепь (то есть, олигонуклеотид может быть одноцепочечным), но может содержать как смысловую, так и антисмысловую цепи (то есть, олигонуклеотид может быть двухцепочечным).

Методы секвенирования нуклеиновых кислот

Методы секвенирования ДНК в основном описаны в Metzker, Genome Res., December 1, 2005; 15(12): 1767 -1776 и Shendure et al., Nature Reviews Genetics 5, 335-344 (2004). Метод секвенирования по Сэнгеру или терминации цепи или метод дидезоксисеквенирования представляет собой способ, который использует ферментативную процедуру синтеза цепей ДНК различной длины в четырех различных реакциях, которые содержат низкие концентрации индивидуальных дидезоксинуклеотидов, смешанных с нормальными нуклеотидами. Репликацию ДНК останавливают в положениях, занятым одним из четырех дидезоксинуклеотидных оснований, приводящим к распределению нуклеотидных фрагментов, после того как нормальные нуклеотиды будут правильно встроены. Несвойственные ddNTP-терминаторы заменяют ОН на Н в 3'-положении молекулы дезоксирибозы и необратимо останавливают ДНК-полимеразную активность. Затем определяют длины полученных в результате реакции фрагментов для расшифровки полученной последовательности. Электрофоретическое разделение фрагментов дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (dNTP) проводят с точностью до одного нуклеотида.

Области, которые, как установлено, трудно поддаются секвенированию с использованием общепринятых процедур, могут быть подготовлены в реакции посредством методов мутагенеза. Могут быть созданы приборы, которые объединяют амплификацию ДНК, очистку и секвенирование с помощью методов микротехнологии. Например, может быть использована изготовленная средствами микротехнологии кольцевая подложка для секвенирования с помощью капиллярного электрофореза в 384-луночном планшете. Реакционные смеси инъецируют по периметру и разгоняют по направлению к центру, где ротационный конфокальный флуоресцентный сканер выполняет детектирование. В другом примере одноцепочечные полинуклеотиды проходят по одному через нанопору из гемолизина, и наличие полинуклеотида в нанопоре детектируют в виде импульсных помех на базовой линии ионного тока.

При секвенировании путем гибридизации (SBH) используют дифференциальную гибридизацию с олигонуклеотидными зондами для расшифровки последовательности ДНК-мишени. Как описывают Cutler, D. J. et al. High-throughput variation detection and genotyping using microarrays. Genome Res. 11, 1913-1925 (2001), для повторного секвенирования данной подложки на микрочипе существует четырехкратная повторность, каждая идентична за исключением иного нуклеотида в положении запроса (основной компонент из олигонуклеотидов длиной 25 пар оснований). Данные генотипирования для каждого основания получают посредством дифференциальной гибридизации геномной ДНК с каждым набором в четырехкратной повторности.

В одном примере ДНК для секвенирования иммобилизуют на субстрате, таком как гранула, мембрана или стеклянный чип. Затем выполняют последовательные гибридизации с короткими олигонуклеотидными зондами (например, олигонуклеотиды длиной 7 п.о.). При связывании специфических зондов с ДНК-мишенью они могут быть использованы для получения заключения относительно неизвестной последовательности. В другом примере для повторного секвенирования данной подложки на микрочипе существует четырехкратная повторность, каждая идентична за исключением иного нуклеотида в положении запроса (основной компонент из олигонуклеотидов длиной 25 пар оснований). Данные генотипирования для каждого основания получают посредством дифференциальной гибридизации геномной ДНК с каждым набором в четырехкратной повторности. Микрочип с иммобилизованными олигонуклеотидными зондами гибридизуют с пробой ДНК. Предоставляют олигонуклеотидную 'пробу' на единицу площади, и каждая проба состоит из множественных копий определенного олигонуклеотида длиной 25 п.о. Для каждой пары оснований ссылочного генома для повторного секвенирования существует четыре пробы на грануле. Пара оснований в середине этих четырех проб представляет собой А, С, G или Т. Последовательность, которая окружает вариабельную среднюю пару, является идентичной для всех четырех проб и выравнивает ссылочную последовательность. Путем гибридизации меченой пробы ДНК с гранулой и определения которая из четырех проб дает самый сильный сигнал для каждой пары оснований ссылочной последовательности проба ДНК может быть быстро повторно секвенирована. Метод сбора данных заключается в сканировании флуоресценции, излучаемой меченой ДНК-мишенью, которую гибридизуют с массивом последовательностей зонда.

Методы циклического массива вообще заключаются во множественности циклов ферментативного манипулирования массивом пространственно разъединенных олигонуклеотидных проб. В каждом цикле происходит запрос одного или нескольких оснований, но параллельно обрабатывается от тысяч до миллиардов проб. Массив проб может быть упорядочен или случайным образом распределен. Методы циклического секвенирования, которые являются неэлектрофоретическими, являются предметом рассмотрения.

Пиросеквенирование измеряет высвобождение неорганического пирофосфата, которое пропорционально превращается в видимый свет путем серий ферментативных реакций. В отличие от других подходов секвенирования, которые используют 3'-модифицированные dNTPs для терминации синтеза ДНК, метод пиросеквенирования манипулирует ДНК-полимеразой последовательным добавлением дезоксинуклеозидтрифосфатов dNTPs в ограниченных количествах. При добавлении комплементарного dNTP ДНК-полимераза удлиняет праймер и приостанавливается при ее столкновении с некомплементарным основанием. Синтез ДНК повторно инициируется после добавления следующего комплементарного dNTP в цикле распределения. Свет, образованный каскадом ферментов регистрируют в виде серии пиков, называемых пирограммой. Порядок серий соответствует порядку встроенных комплементарных dNTPs и показывает исходную последовательность ДНК.

Метод, называемый флуоресцентное секвенирование in situ (FISSEQ), использует линкеры, содержащие или дисульфидный мостик, который эффективно разрушается с помощью редуцирующего агента, или фоторазрушаемую/деградируемую группу с флуоресцентно меченными dNTPs. Расщепляемые линкеры обеспечивают удаление объемной флуоресцентной группы после включения ДНК-полимеразой (фиг.11).

Как при FISSEQ, так и при пиросеквенировании, последовательность реакций секвенирования контролируют извне путем поэтапного (то есть, циклического), управляемого полимеразой, добавления однотипного нуклеотида к массиву амплифицированных, праймированных матриц. Методы добавления индивидуальных нуклеотидов (SNA), такие как пиросеквенирование, используют лимитированные количества индивидуальных природных dNTPs для приведения синтеза ДНК к остановке, который, в отличие от метода Сэнгера, может быть возобновлен с помощью добавления природных нуклеотидов. Лимитирование количества даваемого dNTP необходимо для сведения к минимуму эффектов неправильного объединения, наблюдаемых при более высоких концентрациях.

В обоих случаях повторяемые циклы удлинения нуклеотидов применяют для прогрессирующего получения последовательности индивидуальных массивов проб (на основе паттернов удлинения/неудлинения в течение прохождения многих циклов). Пиросеквенирование может обнаруживать удлинение посредством контроля в реальном времени на основе высвобождения пирофосфата в присутствии люциферазы. В FISSEQ удлинение обнаруживают автономно (не в реальном времени) с использованием флуоресцентных групп, которые присоединяют к дезоксинуклеотидам.

Другой метод секвенирования основан не на циклах удлинения с помощью полимеразы, но вместо этого на циклах рестрикции, расщепления и лигирования. Смесь адаптеров, в том числе каждый возможный с липким концом, подвергают отжигу в последовательность-мишень таким образом, что лигируется только один, имеющий полностью комплементарный липкий конец. Каждый из 256 адаптеров имеет уникальную метку, F_n, которая может быть обнаружена после лигирования. Последовательность липкого конца матрицы идентифицируют адапторной меткой, которая свидетельствует о липком конце матрицы. Следующий цикл инициируют расщеплением с помощью Bbvl для обнаружения следующих четырех оснований матрицы.

После сортировки активированных флуоресценцией клеток (FACS) (с использованием для выделения гранул вместо клеток) изолируют флуоресцентно меченные гранулы, нагруженные кДНК, кДНК расщепляют с помощью Dpn11 для обнаружения четырех оснований липкого конца, который затем превращают в липкий конец с тремя основаниями путем реакции достраивания. Флуоресцентно меченные (F) инициирующие адаптеры, содержащие сайты узнавания Bbvl, лигируют с кДНК в отдельных реакциях, после которых гранулы загружают в капиллярный массив. Затем кДНК расщепляют с помощью Bbvl и закодированные адаптеры подвергают гибридизации и лигированию. Меченные декодирующие зонды отдельно гибридизуют с сайтами связывания декодера на закодированных адаптерах и после каждой гибридизации образ массива гранул берут для более позднего анализа и идентификации оснований. Затем закодированные адаптеры обрабатывают с помощью Bbvl, которая расщепляет кДНК внутри, для обнаружения новых четырех оснований для последующего цикла лигирования и расщепления. Для сбора данных рисунка, гранулу отслеживают в ходе последующих циклов лигирования, зондирования и расщепления флуоресцентным кодом.

В некоторых вариантах изобретение относится к изолированной амплификации. После амплификации проба для секвенирования может содержать от тысяч до миллионов копий идентичных ДНК-молекул, хотя пробы могут быть пространственно различимы. Амплификацию выполняют для достижения достаточного сигнала для детектирования.

Хотя метод амплификации клона вообще не зависит от метода циклического секвенирования, различные пути могут быть использованы. В одном методе амплификацию проводят путем синхронного выполнения множества ПЦР-реакций в пиколитровых объемах. В другом примере возможно применение метода молекулярных колоний, в котором ПЦР выполняют in situ в акриламидном геле. Так как акриламид сдерживает диффузию ДНК, то каждая молекула, включенная в реакцию, продуцирует пространственно обособленные колонии ДНК микронного масштаба (ПЦР-колония), которая может быть секвенирована независимо. Для массового одновременного секвенирования характерных фрагментов библиотеке подвергают мечению с помощью уникальной олигонуклеотидной метки. После ПЦР-амплификации препарата смеси библиотеки применяют гранулы для захвата (с каждой гранулой, несущей олигонуклеотид, который является комплементарным к одной из уникальных олигонуклеотидных меток) для выделения идентичных ПЦР-продуктов.

Амплификация клона может быть успешно выполнена с использованием гранул, эмульсии, амплификации и магнитных свойств. Например, эмульсия типа масло в воде разбивает стандартную ПЦР-реакцию на миллионы изолированных микрореакторов и магнитные гранулы применяют для захвата амплифицированных в колониях продуктов, которые образуются в индивидуальных компартментах.

В некоторых вариантах изобретение относится к применению обратимых терминаторов, то есть нуклеотидов, которые терминируют удлинение с помощью полимеразы (например, через модификацию 3'-гидроксильной группы), но до известной степени, которая позволит терминации быть повернутой обратно химическим способом или с помощью ферментов. Циклическая обратимая терминация (CRT) использует обратимые терминаторы, содержащие блокирующую группу, прикрепленную к нуклеотиду, который терминирует (пер., останавливает) синтез ДНК. Для обратимого терминатора удаление блокирующей группы восстанавливает природный нуклеотидный субстрат, разрешая последующее присоединение нуклеотидов для обратимой терминации. Один пример обратимого терминатора представляет собой 3'-O-защищенный нуклеотид, хотя блокирующие группы могут быть также присоединены к другим сайтам на нуклеотиде. Этот пошаговый подход на основе добавления оснований, циклы которого между присоединением и снятием защитных групп имитируют многие из шагов автоматического синтеза ДНК олигонуклеотидов. Обратимые терминаторы обеспечивают одновременное использование всех четырех dNTPs (меченных с помощью различных флуорофоров).

В некоторых вариантах изобретение относится к методам циклического массива, в которых предпринимают попытку обойтись без стадии амплификации. Некоторые методы содержат удлинение праймированной ДНК-матрицы полимеразой с использованием флуоресцентномеченных нуклеотидов. В других вариантах гомополимерные последовательности для расшифровки готовят путем ограничения каждой стадии удлинения до одиночного встраивания. Обратимые терминаторы обеспечивают детектирование одиночной молекулы с помощью достаточного соотношения сигнал-шум с использованием стандартных оптических систем для детектирования единичных молекул. Информация о последовательности может быть получена исходя из одиночных молекул ДНК с использованием серийных удлинений на основе одного нуклеотида и использования флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) для улучшения соотношения сигнал-шум и детектирования в режиме реального времени событий встраивания нуклеотидов с помощью волновода с нулевой модой, созданного на основе нанотехнологий. Путем проведения реакций в волноводе с нулевой модой получают эффективное исследование объема порядка 10 зептолитров (10^-21 литра) таким образом, чтобы детектировались флуоресцирующие нуклеотиды в активном сайте ДНК-полимеразы.

В другом варианте изобретение относится к подходу на основе подхода с использованием одиночных молекул с помощью секвенирования в нанопорах. При прохождении ДНК через нанопору различные пары оснований закрывают пору в различной степени, приводя к флуктуациям в электрической проводимости поры. Проводимость поры может быть измерена и применена для получения выводов относительно последовательности ДНК. Генно-инженерные ДНК-полимераза или флуоресцирующие нуклеотиды дают в режиме реального времени специфические для оснований сигналы при синтезе ДНК в ее природном темпе.

В некоторых вариантах изобретение относится к репликации одиночной аминокислоты на одиночных магнитных гранулах, каждая содержащая тысячи копий последовательности исходной молекулы ДНК. Затем число вариантных ДНК-молекул в популяции может быть оценено путем окрашивания гранул с помощью флуоресцирующих зондов и их подсчета с помощью проточной цитометрии. Гранулы, представляющие специфические варианты, могут быть извлечены посредством проточной сортировки и использованы для дальнейшего подтверждения и экспериментирования.

Другой метод секвенирования использует рекомбинантные ДНК-полимеразы, меченные флуорофором, таким как зеленый флуоресцирующий белок (GFP), и соединенные с отожженным олигонуклеотидным праймером в камере поля зрения микроскопа, обеспечивающей детектирование индивидуальных молекул в виде представленных в патенте США N 6982146, включенном в виде ссылки. Четыре нуклеотидтрифосфата, каждый меченный по основанию различным флуоресцентным красителем, вводят в реакционную смесь. Свет специфической длины волны используют для возбуждения флуорофора на полимеразе, который, в свою очередь, возбуждает соседний флуорофор на нуклеотиде путем FRET. При добавлении нуклеотидов к праймеру их спектральные эмиссии предоставляют информацию о последовательности ДНК-молекулы

Квантовые точки представляют собой полупроводниковые частицы, предпочтительно с диаметрами порядка 2-10 нанометров, или примерно 200-10000 атомов. Их полупроводниковая природа и их ограниченные размером свойства являются пригодными для оптоэлектронных приборов и обнаружения биологических объектов. Объемные полупроводники отличаются зависящей от композиции шириной запрещенной зоны, которая представляет собой наименьшую энергию, требуемую для возбуждения электрона на один энергетический уровень выше его основного состояния, обычно посредством поглощения энергии фотона большей, чем ширина запрещенной зоны. Возвращение возбужденного электрона назад в его исходное состояние может сопровождаться фотонной эмиссией. Так как ширина запрещенной зоны зависит от размера частицы, то оптические характеристики квантовой точки могут быть отрегулированы корректировкой ее размера.

Известно большое разнообразие синтетических способов изготовления квантовых точек, в том числе приготовление в водном растворе при комнатной температуре, синтез при повышенной температуре и давлении в автоклаве и вакуумное напыление на твердый субстрат. Alivisatos, Science 271: 933-937, 1996 и Crouch et al., Philos. Trans. R.Soc.Lond., Ser. A. 361: 297-310, 2003. Большая часть синтезов, дающих коллоидные суспензии квантовых точек, заключается во введении предшественников полупроводников в условиях, которые термодинамически способствуют росту кристаллов в присутствии агентов, связывающих полупроводники, которые действуют для кинетического контроля роста кристалла для поддержания их размера в нанометровом диапазоне.

Так как зависящие от размера свойства квантовых точек являются наиболее выраженными, когда наночастицы являются монодисперсными, предпочтительным является производство квантовых точек с узким распределением по размерам. Синтетический способ для монодисперсных квантовых точек (<5% среднекватратичное отклонение диаметра), изготовленных из сульфида кадмия (CdS), селенида кадмия (CdSe) или теллурида кадмия (CdTe), описывают Murray et al., J. Am. Chem. Soc. 115: 8706-8715. 1993. Известно создание квантовых точек, которые могут охватывать видимую область спектра, и CdSe стал предпочтительной химической композицией для синтеза квантовой точки. Многие способы являются возможными для постсинтетически модифицированных квантовых точек, такие как покрытие защитной неорганической оболочкой, Dabbousi, et al., J.Phys. Chem. В 101: 9463-9475, 1997 и Hines & Guyot-Sionnest, J.Phys. Chem. 100: 468-471, 1996, модифицирование поверхности для придания коллоидной стабильности Gerion, et al., J.Phys. Chem. В 105: 8861-8871, 2001 и Gao et al., J.Am. Chem. Soc. 125: 3901-3909, 2003, и прямое связывание с биологически активными молекулами, Bruchez et al., Science 281: 2013-2016, 1998 и Chan & Nie, Science 281: 2016-2018, 1998.

Предпочтительная схема синтеза предусматривает четыре стадии: (1) синтез ядра квантовой точки, чаще всего CdSe, в органическом растворителе при высокой температуре; (2) рост неорганической оболочки (обычно сульфид цинка, ZnS) эпитаксиально на ядре для защиты оптических свойств квантовой точки; (3) фаза переноса квантовой точки из органической жидкой фазы в водный раствор; и (4) присоединение биологически активных молекул к поверхности квантовой для придания функциональности, или присоединение биологически инертных полимеров для минимизации биологической активности.

Одна процедура синтеза монодисперсных квантовых точек заключается в добавлении полупроводниковых предшественников в жидкий координирующий растворитель при высокой температуре. Координирующий растворитель предпочтительно состоит из триоктилфосфиноксида (ТОРО) и триоктилфосфина (ТОР), которые содержат основные функциональные группы, которые могут связываться с поверхностью квантовых точек во время роста для предупреждения образования груды полупроводников. Алкильные цепи от координирующих лигандов вытягиваются от поверхности квантовой точки, придавая квантовым точкам стерическую стабильность в виде коллоидов, диспергируемых во многих неполярных растворителях. В предпочтительных способах синтеза CdSe, предшественники для квантовых точек комнатной температуры, диметилкадмий и элементарный селений, растворяли в жидком ТОР, быстро впрыскивали в горячий (290-350°С) ТОРО, немедленно инициируя образование ядра кристаллов квантовой точки. Образованию ядра CdSe и росту способствуют термодинамически, так как предшественники вводят в концентрациях, значительно превышающих растворимость образующегося полупроводника. Однако рост кристаллов является кинетически контролируемым по диффузии мономеров, вследствие высокой вязкости растворителя, и также является контролируемым через скорость взаимодействия мономеров на поверхности квантовой точки, вследствие прочного связывания координирующего растворителя с полупроводниковыми предшественниками и поверхностями квантовых точек. Высокая температура при впрыскивании преодолевает стерическо/кинетический барьер, обеспечивая соединение предшественников и образование ядра. Быстрое понижение температуры, в сочетании со снижением концентрации мономеров (вследствие образования ядер многих мелких кристаллов квантовых точек), останавливает образование ядер в течение секунд после впрыскивания, обеспечивая равномерный и гомогенный рост ядер, аналогичных по размерам. Данное разделение процесса образования ядер и роста отвечает за монодисперсность конечных квантовых точек. Также использование горячего растворителя приводит к полупроводниковым наночастицам, которые являются высококристаллическими при сведении к минимуму термодинамически неблагоприятных дефектов кристаллической решетки.

С точки зрения особого внимания, желательно гашение реакции обычно понижением температуры до тех пористых структур, пока рост кристалла становится незначительным. Такая процедура синтеза является предпочтительной для квантовых точек, состоящих из CdSe, хотя квантовые точки с другими композициями могут быть синтезированы в координирующих растворителях. В вариантах данного синтеза используют альтернативные молекулярные предшественники вместо CdSe, в том числе без ограничения, оксид кадмия, диметилкадмий и ацетат кадмия в сочетании с TOP-Se, различные координирующие лиганды, в том числе без ограничения, алкиламины и алкановые кислоты, и координирующий растворитель может быть заменен на некоординирующий растворитель, такой как октадецен, содержащий небольшое количество координирующего лиганда. Квантовые точки CdSe с диаметрами между 2 и 8 нм имеют длины волн излучения от (450-650 нм), перекрывая весь спектр излучения в видимой области. Также путем корректировки композиции квантовой точки (ZnS, CdS, CdSe, CdTe, PbS, PbSe и их сплавов) возможен охват диапазона длин волн 400-4000 нм. Корректировка характеристик растворителя и концентрации исходного предшественника дополнительно приведет к нанокристаллам с разнообразными формами, наподобие палочек тетрапод.

При проектировании ядер квантовых точек для специфической области длины волны сначала выбирают химическую композицию, поскольку квантовые точки предпочитают определенную область длины волны для каждой композиции. Например, квантовые точки CdSe могут быть отрегулированы на излучение между 450 и 650 нм, тогда как квантовые точки CdTe могут быть отрегулированы на излучение от 500 до 750 нм. Затем выбирают диаметр квантовых точек для определения специфической длины волны эмиссии и затем создают квантовые точки посредством целенаправленного роста частицы с использованием параметров для синтеза. Полученные квантовые точки покрывают координирующими лигандами и суспендируют в неочищенной смеси координирующего растворителя и молекулярных предшественников. Большинство квантовых точек являются очень гидрофобными и могут быть выделены и очищены из реакционной смеси или посредством экстракции типа жидкость-жидкость (смесь гексана и метанола), или посредством преципитации из полярного растворителя (метанола или ацетона), который растворяет компоненты реакции и координирующие лиганды, но не квантовые точки. Затем чистые ядра квантовых точек используют в качестве субстратов для последующей модификации.

Поскольку квантовые точки имеют большие соотношения площади поверхности к объему, то большая часть составляющих атомов экспонирована к поверхности и таким образом имеет атомные или молекулярные орбитали, которые не полностью связаны. Эти "болтающиеся" орбитали могут образовывать связи с органическими лигандами, такими как ТОРО. Это приводит к электроизолирующему монослою, который служит для "пассивирования" поверхности квантовой точки путем поддержания внутренней структуры кристаллической решетки и для предохранения неорганической поверхности от внешних эффектов. Однако прочность связи между органическим лигандом и атомами полупроводниковой поверхности типично является значительно ниже, чем прочность связи внутри полупроводниковой структуры, и десорбция лигандов делает ядро физически доступным. На этом основании предпочтительным является наращивание оболочки из другого полупроводника на поверхности QD после синтеза. Применением оболочки с более широкой запрещенной зоной, чем у расположенного ниже ядра, электронная изоляция приводит к повышенной эффективности фотолюминесценции, и стабильная оболочка обеспечивает физический барьер, препятствуя деградации или окислению. В качестве примера, для пассивации квантовых точек CdSe с помощью ZnS, ядра очищают для удаления непрореагировавших предшественников кадмия или селена и затем ресуспендируют в координирующем растворителе. Молекулярные предшественники оболочки, обычно диэтилцинк и гексаметилдисилазан, растворяют в ТОР, затем медленно добавляют при повышенных температурах. Температуру для роста ZnS на CdSe выбирают такой, которая является достаточно высокой, чтобы способствовать эпитаксиальному росту кристаллической структуры, но достаточно низкой для предупреждения образования кристаллов ZnS и эффекта Оствальта ядер CdSe. Обычно температура составляет приблизительно 160-220°С. Затем нанокристаллы (ядро)/оболочка (CdSe)/ZnS могут быть очищены точно так же, как ядра. Хотя наличие оболочки является предпочтительным, в определенных вариантах применяют ядра CdSe без покрытия.

Синтез квантовых точек может быть выполнен непосредственно в водном растворе, производящий квантовые точки, готовые к применению в биологически средах. Две стратегии, которые могут быть применены для изготовления гидрофобных квантовых точек, растворимых в водном растворе, без ограничения заключаются в обмене лигандами и нанесении покровного слоя амфофильного полимера. Для обмена лигандами суспензию квантовых точек, покрытых ТОРО, смешивают с раствором, содержащим избыток гетеробифункционального лиганда, который имеет одну функциональную группу, которая связывается с поверхностью квантовой точки, и другую функциональную группу, которая является гидрофильной. Таким образом гидрофобные ТОРО-лиганды вытесняются из QD посредством действия масс, в то время как новый бифукциональный лиганд адсорбируется для придания растворимости в воде. С использованием этого способа (CdSe)ZnS QDs могут быть покрыты с помощью меркаптоуксусной кислоты и (3-меркаптопропил)триметоксисилана, оба содержат основные тиольные группы для связывания с атомами на поверхности квантовой точки, дающие квантовые точки, представляющие карбоновые кислоты или мономеры силана. Этими способами создают квантовые точки, которые являются пригодными для биологических анализов. Более предпочтительно, они могут сохранять нативные молекулы ТОРО на поверхности и маскировать гидрофобные квантовые точки с помощью амфифильных полимеров. Этими способами производят квантовые точки, которые могут быть диспергированы в водном растворе и оставаться стабильными в течение продолжительных периодов времени благодаря защитному гидрофобному бислою, инкапсулирующему каждую квантовую точку через гидрофобные взаимодействия. Предпочтительным является то, что квантовые точки очищают от остаточных лигандов и избытка амфилинов ультрацентрифугированием, диализом или фильтрацией перед применением в биологических анализах.

В предпочтительных способах растворения в воде квантовые точки часто покрывают с помощью групп карбоновой кислоты, и квантовые точки являются отрицательно заряженными в нейтральных или щелочных буферах. Предпочтительные схемы, применяемые для получения биоконъюгатов с квантовыми точками, основаны на образовании ковалентных связей между карбоновыми кислотами и биомолекулами. Хотя поверхность QD имеет суммарный отрицательный заряд, положительно заряженные молекулы также могут быть применены для способа электростатического связывания, который может быть применен для покрытия квантовых точек с помощью катионных авидиновых белков и рекомбинантных мальтозо-связывающих белков, слитых с положительно заряженными пептидами.

Альтернативно биологические молекулы, содержащие основные функциональные группы, такие как амины или тиолы, могут взаимодействовать непосредственно с поверхностью квантовой точки в виде лигандов. Если биологические молекулы исходно не содержат группы для прямого связывания квантовой точки, то молекулы могут быть модифицированы для придания этой функциональности. Например, нуклеиновые кислоты и пептиды могут быть модифицированы добавлением тиольных групп для связывания с квантовыми точками. Модификация поверхности также становится модульной посредством высокоаффинного связывания стрептавидин-биотин. Конъюгаты квантовая точка-стрептавидин являются подходящими для непрямого связывания с широким рядом биотинилированных биологических молекул. Квантовые точки могут быть покрыты инертными гидрофильными полимерами, такими как полиэтиленгликоль (PEG), который действует для снижения неспецифической адсорбции и для повышения коллоидной стабильности. Биосовместимые квантовые точки могут быть конъюгированы с рядом функциональных биологических молекул, такими как стрептавидин, биотин или моноклональные антитела.

Множественные квантовые точки могут быть точно заключены в мезопористые кварцевые гранулы. Например, квантовые точки могут быть покрыты слоем три-п-октилфосфиноксида (ТОРО). Мезопористые материалы могут быть синтезированы с использованием порообразующих матриц, таких как самособирающиеся поверхностно-активные вещества или полимеры. Предпочтительно мезопористые кварцевые гранулы (диаметром 5 мкм) с размером пористые структуры 10 или 32 нм покрывают монослоем Si-C₁₈H₃₇ (октадецил, 18-углеродный неразветвленный углеводород).

Одноцветное легирование может быть выполнено смешиванием пористых гранул с контролируемым количеством квантовых точек в органическом растворителе, таком как бутанол. Например, 0,5 мл 4 нМ раствора квантовых точек (в хлороформе) могут быть смешаны с одним миллионом пористых гранул в 2-5 мл бутанола, дающие степень легирования 1,2 миллиона точек на гранулу. Для 10-нанометровых пористых гранул может быть использовано более продолжительное время. Для мультицветового легирования различно окрашенные квантовые точки могут быть предварительно смешаны в точно контролируемых соотношениях. Пористые гранулы могут быть добавлены к аликвотной пробе этого предварительно смешанного раствора. Легированные гранулы могут быть изолированы центрифугированием и промыты три раза этанолом.

Квантовые точки могут быть сгруппированы. Типично такие кластеры покрывают дополнительной оболочкой, например сульфидом цинка. Эти кластеры могут быть покрыты полимером. Химическая модификация полимера предоставляет возможность модификации поверхности нанокристаллов таким образом, что биологические материалы и молекулы могут присоединяться к полимерной оболочке. Например, полистирол может быть применен для покрытия нанокристалла. Полистирол может быть гидроксилированным до образования фенольных групп. Взаимодействие фенольных групп с р-оксибензилбромидом приводит к замещению бромида для обеспечения оксибензильной поверхности. Группа бензилгидроксил может быть по необходимости превращена в галоидный алкил или амин и присоединена к аминокислоте в виде типично используемых в синтезе твердой фазы смолы, опосредованном аминокислотами. Аминокислотная последовательность на поверхности гранулы может быть эпитопом для антитела, которое само может, или не может, быть флуоресцентно меченным. Аналогично, последовательность нуклеиновой кислоты может быть конъюгирована с полимерной поверхностью. Конъюгированная последовательность нуклеиновой кислоты на поверхности гранулы может гибридизоваться с комплементарной последовательностью, которая может, или не может, содержать дополнительный флуорофор.

Теломераза

Теломераза представляет собой рибонуклеопротеин, который поддерживает длину теломер хромосом. Теломераза неактивна в доброкачественных соматических клетках, но активируется в большинстве раковых опухолей человека. Активность теломеразы может быть использована в качестве опухолевого маркера, в особенности при использовании в сочетании с общепринятой цитологией. Функциональная теломераза присутствует приблизительно в 90% всех раковых опухолей человека, но обычно отсутствует в доброкачественных опухолях и нормальных соматических клетках (за исключением клеток зародышевой линии и стволовых клеток). Детектирование активности теломеразы обнаруживает наивысшее сочетание чувствительности (60-90%) и клинической специфичности (94-100%) при сравнении с другими методами скрининга для идентификации злокачественных опухолей.

Концы хромосом состоят из тысяч двухцепочечных повторов (ds) TTAGGG, называемых теломерами, которые обладают несколькими функциями. В нормальных соматических клетках длина теломер постепенно укорачивается с каждым клеточным делением, в конечном счете приводя к гибели клеток. Наоборот, неограниченная пролиферация большинства иммортализованных и раковых клеток сильно зависит от активности теломеразы, которая компенсирует потерю репликации теломер путем элонгации существующих теломер с помощью TTAGGG повторов, с использованием ее собственного RNA-компонента в качестве матрицы.

Обнаружение теломеразной активности может быть основано на протоколе амплификации теломерных повторов (TRAP), в котором используют теломеразную способность узнавания и элонгации in vitro синтетического олигонуклеотидного субстрата, TS, и затем применяют ПЦР для амплификации удлиненных ДНК-продуктов. Количественный TRAP в реальном масштабе времени (RTQ-TRAP) объединяет традиционный анализ TRAP и ПЦР в реальном времени, основанный на SYBR Green. Более специфическое обнаружение теломеразы демонстрировали с использованием набора TRAPeze XL™, в котором используют праймеры Amplifluor™.

Одним фактором, лимитирующим чувствительность ПЦР в реальном времени, является высокий фон флуоресценции зондов, которые не связываются с PCR-продуктом. Разделение ДНК-фрагментов с помощью капиллярного электрофореза (СЕ) и детектирование их индуцированной лазером флуоресценции (LIF) устраняет фоновую флуоресценцию, обеспечивает концентрирование PCR-продукта в результате концентрирования пробы во время электрокинетического введения и таким образом улучшает чувствительность. Для дальнейшего понижения пороговой линии детекции возможно комбинирование CE-LIF с однофотонным детектором (SPD). Чувствительность SPDs в сущности является очень высокой в результате их высокого квантового выхода и чрезвычайно низкой темновой скорости счета. Кроме того, электрическая мощность SPD может быть непосредственно преобразована цифровым блоком. Следовательно, стадии амплификации сигнала, регистрации и преобразования не добавляют никакого шума к детектируемому сигналу в отличие от традиционных систем LIF.

Аутентичность документов

Иногда желательно идентифицировать копии отпечатанных материалов, которые выглядят идентичными оригиналу, например ценные бумаги банка, оригиналы, кредитные карточки клиента банка, чеки, наличные. В некоторых вариантах изобретения изобретение относится к применению одного или нескольких кодов безопасности или эмблем, впрессованных в документ, в качестве средств устрашения при хищениях или подделке денег. Эти коды могут проявляться в виде водяных знаков, голограмм, флуоресцентных красителей или чернил, штрих-кодов или кодовых номеров.

Используемый здесь термин "документ" означает нечто, что может быть применено для предоставления доказательства или информации. Предпочтительно документ представляет собой написанную или отпечатанную бумагу, которая служит оригиналом, официальной или юридической формы; однако не предназначено для ограничения этим. Существуют многие типы документов, удостоверяющих личность, которые вообще содержат фотографию, фамилию, адрес, отпечатки пальцев, кодовый номер и так далее. Примеры включали бы государственные удостоверения личности, паспорта, водительские удостоверения и карточки с номером компании/ключи. Другие примеры документов включают в себя ценные бумаги банка и наличные.

В некоторых вариантах изобретение относится к применению люминесцентного профиля гранул, используемых в красителе для определения аутентичности документа. Например, чернила могут содержать набор гранул, которые содержат различающиеся концентрации квантовых точек. Чернила могут быть нанесены на документ. Детектирование различающихся квантовых точек, под воздействием ультрафиолетового излучения, имеющих различный цвет, и их относительные концентрации в документе обеспечивают различную интенсивность цвета; таким образом, люминесцентный профиль или спектральный создают в зависимости от применяемых гранул и квантовых точек.

В некоторых вариантах выбирают гранулы со спектральными кодами и наносят на документ или во время процесса печатания, или во время окончательного монтажа (или в район глянцевого покрытия, или на слоистую пластмассу, используемых для физической защиты важных документов), документ может быть легко идентифицирован в виде аутентичного в течение всего нескольких секунд с помощью аппарата для считывания флуоресценции. Композиция кодов остается секретной только до появления идентификатора ключа на экране. Для усиления способа секретной защиты множество невидимых меток могут быть добавлены на внутреннюю сторону документа или на наружную поверхность бумаги или документа, и/или их компонуют посредством чернил, используемых в процессе печатания, или впрессовывают в саму подложку.

Чернила, видимые в инфракрасной области, могут быть читаемыми или исчезающими. При печати они могут выглядеть одинаково, но при рассмотрении под ультракрасным освещением одни чернила будут читаемыми и одни будут исчезающими. Одним примером применения этих двух типов чернил в качестве элемента защиты было бы печатание штрих-кодов с помощью обоих типов чернил. Печатание истинной считываемой области штрих-кода с помощью чернил, считываемых в инфракрасной области, а других областей штрих-кода с помощью чернил, исчезающих в инфракрасной области, но добиться того, чтобы такой код выглядел как обычный штрих-код. При считывании с помощью сканера для считывания штрих-кода только считываемый в инфракрасной области считывается сканером. При попытках подделки при изготовлении дубликата штрих-кода в виде того, как он выглядит на напечатанном документе с помощью обычных чернил, штрих-код отбраковывался бы при считывании сканером, поскольку сканер считывал бы идеальный штрих-код. Видимые в инфракрасной области чернила являются пригодными для мокрого или сухого способа офсетной печати.

Фотохромные чернила могут быть цветными или бесцветными. При облучении УФ-светом чернила мгновенно меняют цвета. Как только источник УФ-излучения удаляют, чернила вернутся к их исходному цвету. Уникальные свойства фотохромных чернил не могут быть воспроизведены сканером или копировальным устройством. Аутентичность документа с помощью фотохромных чернил на нем может быть проверена при облучении солнечным светом, УФ-излучением или другими сильными источниками искусственного освещения. Такие чернила могут быть для мокрого или сухого способа офсетной печати с помощью флексографии.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Детектирование гранул при движении в капилляре.

Покрытые стрептавидином полистирольные гранулы размером 6 мкм подвергали мечению с помощью флуоресцеина путем инкубирования с биотинилированным антителом, за которым следует соответствующее детектирующее антитело, конъюгированное с флуоресцентным красителем. Для получения раствора-носителя гранул без седиментации предварительно смешивали Applied Biosystems Polymer (Performance Optimized Polymer-4) с PBS в соотношении 1:1. Для проталкивания гранул через капилляр длиной 25 см, внутренним диаметром 51 мкм использовали насос при постоянной скорости.

Флуоресценцию возбуждали при 488 нм с использованием 4 mW лазера на ионах аргона. Каждый пик флуоресценции соответствует одиночной 6 мкм грануле, проходящей через 60 мм поперечное сечение лазерного луча (см. фиг.8). Минимальная пиковая амплитуда, детектируемая в этих сериях, составляла приблизительно 104 импульсов/секунду при уровне фона приблизительно 20000 импульсов/секунду с соотношением сигнал/шум выше чем 3. Эксперименты с немечеными гранулами показали, что они не продуцируют сигнал выше уровня фона.

Пример 2. Спектральное кодирование микрогранул (фиг.4)

Допустим, что имеют D типов люминесцентных красителей с различными разбавителями люминесцентных спектров в буфере и имеющие G_i градаций в каждом из указанных типов красителя (1≤i≤D). Допустим, что хотят создать набор N гранул, которые несут С цветовых кодов, где

$$C\le {\displaystyle \prod _{i=1}^D{G}_i}$$

Для получения N гранул, закодированных с помощью указанных кодов, делают следующее:

Создают W луночных плашек, каждая луночная плашка содержит w_k лунок, так что

$${\displaystyle \prod _{k=1}^W{W}_k=C}$$

где $$W_k={\displaystyle \prod _{i=1}^{dj}{G}_i}$$

и dj означает число типов лиминесцентных красителей, так что

$${\displaystyle \sum _{j=1}^W{d}_j=D}$$

a) Берут первый набор d₁ люминесцентных красителей, готовят w₁ различных комбинаций первого набора указанных люминесцентных красителей и помещают их в w₁ лунок первого луночного планшета, одна комбинация красителя на одну лунку. Повторяют ту же самую процедуру W раз, каждый раз выбирая другие наборы красителей d_j и заполняя другой луночный планшет.

b) Распределяют М неокрашенных пористых гранул между указанными w₁ лунками первой луночной плашки.

c) Инкубируют указанные М гранулы в указанной луночной плашке так, что указанные люминесцентные маркеры абсорбируются указанными гранулами (процедура легирования гранул).

d) Экстрагируют указанные М гранулы из указанного луночного планшета и отделяют указанные М гранулы от указанных d₁ люминесцентных красителей.

e) Смешивают указанные экстрагированные М гранулы вместе.

f) Распределяют указанные М гранулы между w₂ лунками второй луночной плашки.

g) Повторяют шаги d)-g) W-2 раз.

h) Повторяют шаги d)-f) еще один раз.

i) Помещают указанные М гранулы с закодированным спектром излучения в контейнер.

После окончания процедуры лигирования гранул получают раствор, который содержит С индивидуальных кодов, называемых семействами гранул. К каждому семейству гранул присваивают ярлык от 1 до С. Каждое семейство состоит из многих членов - гранул, которые несут одинаковый код. Если во время процедуры кодирования очень большое число гранул М всегда равномерно распределяется между реакционными лунками, то каждое семейство будет состоять из приблизительно K членов,

где $$K=M/C\pm \sqrt{\frac{M}{C}}$$ . L гранул, которые произвольно отбирают из смеси гранул после процедуры кодирования, называют набором гранул и определяют число уникальных кодов в наборе для L≈М/К≈С. Предполагают, что существует С лунок, аналогичным образом меченных номерами от 1 до С. При отборе одной гранулы с ярлыком m из общего источника М гранул эту гранулу помещают в лунку с тем же самым ярлыком m. Для данных L отобранных случайным образом гранул желательно знать, сколько лунок содержат 1 и только одну гранулу. Для получения вероятности p(C,L) получения 1 и только 1 гранулы в данной лунке после размещения L отобранных случайным образом гранул вычисляют вероятность каждым возможным способом, в котором возможно достижение успеха и суммирование этих вероятностей. Для больших М и С получают р (C,L)=L/Nexp(-L/C). Максимальное значение для р~0,36, и его получают при L=C. Утверждают, что проблема является эквивалентной теореме Бернулли, с числом проб С, вероятность успеха р, среднее число удачных исходов N_SUCCSESS=С×р,

распределенное со стандартным отклонением $$y=\sqrt{Cp\left(1-p\right)}$$ . Таким образом, путем взятия фракции 1/K из смеси, содержащей М гранул, получают набор $$L=M/F=C\pm \sqrt{C}$$ гранул, содержащий ~36% гранул с уникальным кодом.

Для создания 10⁹ индивидуальных спектральных кодов в квантовых точках применяют 9 индивидуальных цветов с 10 градациями интенсивности. Поскольку интенсивность флуоресценции, производимая гранулой, легированной квантовыми точками, является пропорциональной числу квантовых точек, встроенных в гранулу, гранулы легируют различными количествами квантовых точек для создания градиентов интенсивности. Расстояние между средними интенсивностями соседней градации представляет собой двукратное среднеквадратическое отклонение.

Большое количество неокрашенных пористых гранул распределяют между десятью лунками, заполненными растворами различных концентраций квантовых точек первого цвета (QD₁ см. фиг.4). После встраивания QD₁ в гранулы содержимое всех 10 лунок 10 смешивают. Гранулы отмывают и равномерно и произвольно распределяют между следующим набором из десяти лунок, заполненных различными концентрациями QD₂. Процедуру повторяют для каждого отдельного цвета.

Квалифицированный в данной области специалист производит кодирование пористых полистирольных гранул с помощью квантовых точек, как описано в публикации Gao & Nie Analytical Chemistry 2004, 16, 2406-2410. Для этого используют квантовые точки с ядерной структурой CdSe, покрытой ZnS, покрытые слоем ТОРО. Используют полистирольные пористые микрогранулы с порами между 10 и 30 нм. Легирование одноцветной квантовой точки производят введением контролируемого количества квантовых точек в пористые гранулы, суспендированные в бутаноле. Смесь перемешивают до тех пор, пока практически только квантовые точки остаются в растворе супернатанта. Отделяют гранулы центрифугированием и промывают их с помощью этанола.

Предпочтительным является экстрагирование и отмывка гранул способом, при котором гранулы продолжают подвергаться действию жидкой среды для предотвращения образования пузырьков газа внутри пористых гранул, затрудняющих абсорбцию квантовых точек. В одном варианте изобретения это выполняют разбавлением суспензии, обеспечивая оседание гранул на дно лунки, удалением части раствора, например отсасыванием верхней половины раствора с помощью пипетки. В случае, если лунка содержит проницаемую мембрану, например стеклообразную фритту, возможно приложение избыточного давления к мембране для поддержания раствора в лунке во время процесса легирования и затем удаления части раствора, применяя отсасывание.

Кроме того, для уменьшения числа стадий экстрагирования, отмывки и переноса предпочтительным является создание лунок с квантовыми точками с более чем одним цветом в каждой лунке. Например, предполагают, что квалифицированный в данной области специалист может использовать 96-луночную плашку и помещать различные концентрации квантовых точек, имеющих красный цвет, рядами, а различные концентрации квантовых точек, имеющих зеленый цвет, столбцами. Таким образом, после абсорбции гранулами квантовых точек, гранулы имеют два цветовых индикатора. Предполагают также, что может быть использовано больше, чем два цвета. Например, комплексные плашки, описанные выше, могут иметь варьирующие концентрации трех, четырех, пяти и так далее цветовых индикаторов в каждой плашке. Имея больше лунок с большими вариациями цветов, обеспечивают возможность получения большего количества гранул с уникальной концентрацией цвета перед экстрагированием, промывкой, рекомбинацией и перераспределением. Затем делают третье, четвертое и так далее легирование, обеспечивающее дополнительное разнообразие.

В предпочтительных вариантах также предполагают, что может быть желательным применение различных относительных концентраций цветов для квантовых точек в гранулах в зависимости от применения. Как описано в некоторых вариантах воплощения изобретения, детектирование флуоресценции каждой гранулы производят с использованием набора зеркал, преломляют или пропускают определенные длины волн электромагнитного излучения. Интенсивность света теряется каждый раз при отражении или прохождении света через зеркало. Таким образом, в зависимости от расположения детектора цвета в системе, такого как CCD-детектор, может быть желательным увеличение относительной концентрации имеющих цвет квантовых точек при размещении детектирующего инструмента в том месте, которое требует прохождения флуоресценции через большинство зеркал. Например, в некоторых вариантах изобретения предпочтительным является увеличение концентрации зеленых флуоресцирующих квантовых точек в концентрации гранул и расположение инструмента, детектирующего зеленый цвет, в положение, имеющее наибольшее число зеркал, и предпочтительным является снижение концентрации красных флуоресцирующих квантовых точек в концентрации гранул и расположение инструмента, детектирующего красный цвет, в положение, имеющее наименьшее число зеркал.

Пример 3. Спектральная идентификация гранул с закодированным спектром излучения с использованием меченых ДНК-фрагментов

Система содержит оптическую подсистему обнаружения, жидкостную подсистему и подсистему сбора данных (см. фиг.5 и 6). Оптическая система содержит аргонный ионный лазер (488 нм, 0,5-1 Вт), генератор (генераторы) оптической линии (для облучения всего поперечного сечения монолитного микрокапиллярного массива), линзы массива для передачи флуоресцентного сигнала за пределы коллектора монолитного микрокапиллярного массива, фильтр нижних частот с оптической плотностью 5 ОЕ для отсечения длины волны лазера, набор дихроических зеркал (90% светопроницаемость/ 90% отражение) и набор CCD-камер (Cascade 128+, Photometries) с узкими полосовыми фильтрами для сведения к минимуму спектральных перекрестных помех между различными типами квантовых точек. Для мечения ДНК используют красители, поглощающие в ближней ИК-области. Детектируют флуоресценцию меченной ДНК камерой CCD. Для гранул размером 5 мкм возможно альтернативное применение CMOS-камеры (MV D 1024-160, Photonfocus AG).

Набор гранул, закодированных с помощью цветов квантовых точек, разбавляют в буфере и проталкивают их через капиллярный канал. Верх канала облучают лазерным лучом при 488 нм. При приближении гранул к верху канала и пересечении лазерного луча возбуждается флуоресценция в гранулах, проходящих через лазерно-заграждающий фильтр, оборачивающую линзовую систему и систему дихроических зеркал. Флуоресцентные изображения детектируют CCD-камерами. Дополнительная CCD-камера на верхушке колонны детектирует флуоресценцию меченной ДНК (смотри первое дихроическое зеркало на фиг.5 вблизи лазера). Все CCD-камеры, специально предназначенные одноплатные компьютеры, CCD-компьютеры, которые передают синхросигнал на CCD-камеры таким образом, что кадры во всех CCD-камерах являются синхронизированными и все цвета, излучаемые гранулой, детектируют одновременно. Цветные изображения записывают и данные наблюдений переносят в процессор вычислительной машины для дальнейшей обработки, анализа и хранения.

Сбор данных

Каждая CCD-камера имеет индивидуальный одноплатный компьютер, присоединенный к ней. Получение исходных данных и обработку произойдет на этих компьютерах. Обработка исходных данных заключается в обработке изображения и получении файла, который содержит интенсивности флуоресценции, измеренные от каждого капилляра массива каждого корпуса. Полученные данные переносят из CCD-компьютеров в компьютер PROCESSOR по сети.

Устранение противоречий гранул

Специалист в данной области имеет машину, обеспечивающую считывание всех цветов на одиночной грануле. В целях этой дискуссии, допускают, что K представляет собой число различных цветов на данной грануле, и G представляет собой число градации одного цвета. Таким образом, имеют G^K возможных индивидуальных гранул.

При измерении гранулы, специалист получает, таким образом, K-мерный вектор V, с параметрами 0-G для каждого элемента. Так как квалифицированный в данной области специалист не может измерить интенсивность каждого цвета в абсолютном выражении, зато может измерить их относительную интенсивность. Нормируют вектор к диапазону 0-G через следующий алгоритм, где V[i] означает i-тый элемент вектора V, max(V) означает максимальное значение отдельного элемента V):

maximum=max(V) для i=1 до K: V[i]=V[i]/maximum

После этой процедуры имеют нормированную регистрацию каждой гранулы. Имея зарегистрированное большое число гранул, специалист может подсчитать число появлений каждого V в наборе гранул.

Это может быть выполнено эффективно с помощью следующего алгоритма:

Набор гранул размера N представляют в виде trie-структуры (префиксное дерево), где каждый узел префиксного дерева представляет собой градацию. Как только достигнут заключительный узел trie-структуры (пер., трай-структуры), его счет увеличивается на 1. Для подсчета числа цветовых комбинаций, которые встречаются только один раз, проходят trie-структуру и возвращаются только к концевому узлу древовидной схемы со счетом 1.

Префиксное дерево имеет G и число узлов N. Понятно, что вставка в префиксное дерево занимает O(G) время. Таким образом, вставка N элементов занимает время O(N*G). На практике G является довольно малым и, таким образом, суммарное время прогона операции встраивания является действительно O(N), что является оптимальным, поскольку это представляет собой размер ввода.

Префиксное дерево представляет собой упорядоченную древовидную структуру данных, которую применяют для хранения ассоциативной матрицы, где обозначения представляют собой упорядоченные списки (векторы). В отличие от двоичного дерева поиска, никакой узел в дереве не хранит ключ, связанный с тем узлом; взамен этого, его положение в дереве показывает, с каким ключом он ассоциирован. Все потомки какого бы то ни было узла имеют общий префикс строки, ассоциированной с этим узлом, и корень ассоциирован с пустой строкой. К сожалению, trie-структура является по существу структурой произвольной выборки данных и должна быть сохранена в основной памяти. Для 1 миллиарда гранул потребовалось бы более 10 гигабайт памяти для trie-структуры. Одно решение представляет собой кластеризацию, каким бы то ни было образом, гранул для считывания в куски программы, которые встраиваются в основную память, и все же для конкретного вектора всегда включают в себя все наступления событий у него. Специалист может сделать это следующим образом:

Перед введением векторов считывания в trie-структуру выполняют создание области памяти на основе хэширования каждого вектора и картирование результата в целочисленный диапазон 0- N/(емкость памяти), приводящему к кускам, грубо говоря, N/(емкость памяти). Таким образом, hash(V) mod (N/(емкость памяти)) дает одну область памяти, в которой текущий вектор должен находиться. Специалист в данной области присоединяет V к области в памяти, и как только она растет выше предопределенного размера (например, 1 МБ), специалист присоединяет ее к файлу области памяти на диске и удаляет копию в памяти. Процедура занимает O(N) времени, в то время как хэш занимает 0(I) времени для подсчета.

Свойство хэш-функций состоит в том, что если два хэша являются одинаковыми, тогда два ввода являются одинаковыми. Таким образом, если специалист хранит вектор V в области памяти В1, тогда все векторы, которые являются такими же, как V, были сохранены в области памяти В1. Таким образом, алгоритм выглядит:

для каждого V при вводе:

присоединяют V к номеру области памяти ([hash(V) mod (N/(размер памяти))), если номер области памяти ([hash(V) mod (N/(размер памяти))) заполнен:

сохранить его на диске

удалить его

для каждого V в области памяти:

создать trie-структуру

для каждого V в В:

ввести V в trie-структуру

счетчик с накоплением значений на листовом узле V в trie-структуре около 1

проход trie-структуры и распечатка всех листьев со счетом = 1

Этот алгоритм требует время O(N)+O(G×N) и для ожидаемого массива данных полностью вписывается в основную память. Затраченное время занимается считыванием и записью областей памяти на диск. Как указывают, схема доступа к алгоритму является последовательной, таким образом, специалист может оценить возможную скорость обработки информации путем деления ожидаемого числа данных на скорость обработки информации на диске. Для современного компьютера скорость обработки информации 100 МБ/сек не является слишком высокой. Таким образом, массив данных с N=1×10⁹ займет 1×10¹⁰ байт, что составляет 10 ГБ. При необходимости 4-секундных проходов (1 для ввода данных, 1 для запоминания области памяти, 1 для считывания области памяти для введения в trie-структуру и 1 для сохранения результатов) специалист полностью записывает 40ГБ, которые при скорости обработки информации 100 МБ/секунду потребуют 400 секунд, или бит за 10 минут.

Автоматическая струйная система обеспечивает множественные считывания того же самого набора гранул после способа получения и сбора данных в системе секвенирования ДНК, где тот же самый набор гранул детектируют после каждого цикла удлинения. Система состоит из двух шприцев, 4 коллекторов, монолитного мультикапиллярного массива, насосов, моторов и приводов. Специалист загружает набор гранул в первый шприц и проталкивает через коллекторы и массив для каждой рамы. Данные наблюдений переносят по сети из CCD-компьютеров в процессор вычислительной машины (см. фиг.6).

Скорость детектирования может быть определена следующим образом: r_DET=(N_CAP×f_CCD)/l, где f_CCD означает скорость передачи кадров CCD и l означает число кадров, необходимых для детектирования 1 гранулы. Например, для l=5 и f_CCD=500/секунду и 1000≤N_cap≥100000 будут иметь 1051/секунду ≤r_DET≥1071/секунду.

Оптическая система включает в себя множественные элементы, которые вводят потерю флуоресценции (фиг.5). Суммарные потери включают в себя: потери при сборе света (авторы изобретения допускают 2% от общей эффективности как с оборачивающей линзой, так и с CCD объективами); потери при отражении (максимальные потери при отражении определяют в виде 0,59 для 5 зеркал); эффективность детектирования (минимум 40% для выбранных CCD-камер). Таким образом, суммарная эффективность оптической системы составит ~0,5%. Дихроические зеркала, расположенные в ряд, являются причиной скачкообразных флуоресцентных сигналов в зависимости от положения зеркал. Если зеркала имеют идентичные потери η, то сигнал, детектированный от i-того зеркала, будет ηⁱ. Таким образом, при увеличении количества квантовых точек N_QD, детектируемое посредством данного зеркала при 1/ηⁱ, получат интенсивность флуоресценции одинаковую для всех зеркал.

Предполагаемый флуоресцентный сигнал, который может быть получен от пористой гранулы диаметром d, может быть рассчитан при условии, что интенсивность сигнала является прямо пропорциональной числу квантовых точек в грануле. Описанный выше способ последовательного добавления QD легирующих добавок к гранулам требует того, чтобы поры гранул не насыщались до конца процесса легирования. Если n_MAX означает максимальное число QDs на единицу объема, которое может быть внедрено в гранулу, тогда для системы детектирования, изображенной на фиг.5, число QDs i-того типа, которые детектируют посредством i-того зеркала, составит

$$n_i=\frac{1}{{\eta }^i}\times \frac{1-\eta }{1/{\eta }^5+1/{\eta }^4-2}\times \frac{n_{MAX}\times \left(4/3\right)\pi d^3}{\gamma }$$

где γ означает число градаций интенсивности в каждом типе QD и n_MAX может быть определено в виде ~3700 гранул/мкм³. Таким образом, в данной системе детектирования минимальное число квантовых точек одного цвета на гранулу N_MIN составит 58 и 912 для гранул размером 2 мкм и 5 мкм соответственно. Если одна квантовая точка может продуцировать φ=10-20 фотонов на миллисекунду на 1 мВт мощности возбуждения в оптической системе с 0,5% эффективностью накопление/детектирование флуоресценции. Таким образом, минимальное число фотонов, детектируемое от одной гранулы

$${\phi }_{MIN}=\varphi \times N_{MIN}{P}_{LASER}/F_{CCD}$$

Для мощности лазерного излучения P_LASER=10 мВт и f_CCD=1000/секунду ϕ_MIN=6000-12000 для гранул 2 мкм и увеличивается до 90000-180000 фотонов на кадр для гранул 5 мкм.

Данные, полученные CCD-камерами, затем копируют на отдельный компьютер, который выполняет восстановление сигнала по цвету и называет характерные признаки гранул. Восстановление сигнала по цвету является обязательным, поскольку квантовые точки могут иметь перекрывание спектра. Восстановление сигнала по цвету делают так же, как и при секвенировании ДНК, используя цветовую матрицу, которую определяют заблаговременно для всех типов квантовых точек. При присвоении характерных индивидуальных признаков гранулам, может возникнуть желание использовать абсолютные значения флуоресцентных сигналов, полученных во всех цветовых каналах, или может возникнуть желание использовать только отношения интенсивностей в различных цветовых каналах (например, принимают во внимание, что 1:1:1:1:1:1:1:1:1 и 5:5:5:5:5:5:5:5:5 в виде одинакового характерного признака). В случае, когда имеют Q≤9 типов квантовых точек и у градаций в каждом типе квантовых точек, то число уникальных характерных признаков в наборе гранул будет меньше в

$$F=\left(2\times 5^0+3^0+2^{0+1}-7\right)/{\gamma }^0$$ раз.

Для данного случая при Q=9 и γ=10, получают F приблизительно 4%. Выход запрашиваемых гранул составит ~10⁹ характерных признаков гранул, которые должны быть проанализированы в отношении уникальности. Это выполняют с использованием усовершенствования стандартного подхода, который использует структуру данных в виде префиксного дерева. Собственные расчеты показывают, что обработка и анализ уникальности набора 10⁹ гранул займет несколько минут при выполнении на настольном компьютере стандартной комплектации.

Пример 4. Изготовление гранул с маркерами нуклеиновых кислот

В одном варианте изобретения гранулы с закодированным спектром излучения могут быть применены в качестве главной платформы для обнаружения нуклеиновых кислот - маркеров заболеваний (см. фиг.1). Например, квалифицированный в данной области специалист производит миллиард гранул с помощью способов, в виде описанных в примере 2. Затем гранулы покрывают стрептавидином и связывают их с биотинилированными олигонуклеотидами (олиги). Олиги представляют собой последовательности, которые гибридизуются с биологическими маркерами нуклеиновых кислот, предпочтительно маркерами заболеваний.

Каждая лунка содержит одну нуклеиновую кислоту-маркер, и каждая нуклеиновая кислота содержит биотиновую молекулу. Например, амплифицируют 1000 индивидуальных нуклеиновых кислот-маркеров заболеваний в 1000 отдельных лунок. Распределяют миллиард гранул в каждую из лунок, содержащих маркеры и стрептавидин, таким образом, что каждая гранула содержит одну последовательность, которая соответствует маркеру заболевания. Гранулы каждой лунки пропускают через систему детектирования в виде описанной в примере 3 и создают компьютерный файл, который идентифицирует каждый код, который присутствует на каждой грануле, и регистрируют соответствующую нуклеиновую кислоту в лунке. Это делают для каждой гранулы в каждой лунке. Пренебрегают или принимают во внимание на статистической основе гранулы с одинаковым покрытием цветовыми маркерами так, что путаница не возникает относительно содержания нуклеиновых кислот конкретно закодированной гранулы. Предпочтительно только гранулы с уникальным кодом коррелируют с маркером конкретного заболевания.

После регистрации цветовых кодов гранул смешивают один миллиард чистых гранул способом, при котором распределяют 1000 нуклеиновых кислот-маркеров заболеваний. Помещают миллион из миллиарда смешанных гранул в камеру. Камеру с перемешанными гранулами подвергают воздействию раствора, содержащего или предположительно содержащего нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется с нуклеиновой кислотой-маркером. Соответствующим образом промывают и собирают гранулы. Гранулы подвергают воздействию интеркалирующего агента двойной спирали, такого как этидиум бромид, для определения гибридизации. Анализируют гранулы на цветовые коды, имеющие положительную индикацию гибридизации, и сопоставляют наличие или отсутствие заболевания на основе соответствующего маркера заболевания с помощью данных компьютерного файла.

В предпочтительном варианте готовят большой набор N гранул, которые несут C_U уникальных особых спектральных кодов (например, N≈3,6×10⁹ и C_U≈10⁹), разбавленные в буфере и помещенные в сосуд, каждая гранула несет биомолекулу, например стрептавидин, который обеспечивает связывание ДНК-молекул. Готовят луночный планшет, содержащий w лунок (например, w=1000), каждая лунка содержит сложные молекулы генетического маркера одного типа, различные генетические маркеры находятся в различных лунках. Генетический маркер представляет собой фрагмент ДНК или РНК специфической последовательности. Все генетические маркеры содержат биомолекулы, которые разрабатывают для их связывания с гранулами. Разделяют N гранул равномерно между w лунками и инкубируют луночную плашку таким образом, чтобы указанные молекулярные маркеры связывались с указанными гранулами. Считывают спектральные коды всех гранул в каждой из w лунок и помещают эту информацию в файл (его называют "PASSPORT" файл). PASSPORT файл содержит коды каждой индивидуальной гранулы и информацию о and типе маркера, который эта гранула может нести. Считывание кодов гранул может быть выполнено с помощью высокопроизводительной системы обнаружения гранул в капилляре, которую описывают в другом месте данной патентной заявки. Указанное устройство для детектирования имеет обеспечение для сбора всех гранул после считывания в отдельную емкость. Указанные гранулы отмывают и снова разбавляют их в подходящем буфере. Распределяют все N гранулы по K флаконам так, чтобы каждый флакон содержал n≈N/K гранул, в том числе приблизительно c_U≈C_U/K гранул, которые несут уникальные коды (например, при K=1000 C_U составит приблизительно 10⁶ гранул с уникальным кодом на один флакон, которые несут все w типы генетических маркеров, приблизительно 1000 гранул каждый тип маркера). Проводят гибридизацию путем помещения тестируемой пробы в пробирку и инкубирования пробирки в подходящих условиях (время, температура и так далее). Если при гибридизации случается специфический тип маркера на специфической грануле, то полученная двухцепочечная ДНК может быть детектирована путем мечения с использованием флуоресцентного красителя, который специфически связывается с двухцепочечной ДНК (например, SYBR green), или путем любого другого известного способа мечения, который используют в методах гибридизации. Гранулы с гибридизованной ДНК отмывают и разбавляют их во флаконе с помощью свежего буфера. Считывают спектральные коды всех указанных гранул с гибридизованной ДНК в указанном флаконе и помещают эту информацию в файл (его называют "VIAL" файл). VIAL файл содержит коды каждой индивидуальной гранулы в указанном флаконе и информацию по гибридизации гранулы (указанная информация может включать в себя интенсивность флуоресценции, ассоциированную с присутствием и количеством гибридизованной ДНК и так далее). Считывание кодов гранул может быть выполнено с помощью отдельного устройства для считывания капилляров (фиг.15). Специалист в данной области использует подходящее программное обеспечение для сравнения кодов гранул в VIAL файле с кодами в PASSPORT файле и определяет, какие специфические генетические маркеры гибридизовались. Выполняет статистический анализ результатов, полученных в методе гибридизации.

Пример 5. Изготовление монолитных мультикапиллярных массивов (пер., картриджей)

Способ иллюстрируют на фиг.7. Специалист в данной области начинает изготовление с набора стеклянных наконечников, их число является эквивалентным желаемому числу каналов. Размер и форму наконечников и толщину их стенок выбирают в зависимости от желаемого внутреннего размера капилляров и пространства между ними. Наконечники спрессовывают вместе в картридж, укладывают в стеклянную камеру квадратной формы и вытягивают при высокой температуре. После окончания вытягивания обрезают сплошную капиллярную структуру для предоставления монолитных мультикапиллярных картриджей (MMCAs) необходимых длин. Вследствие адгезии полученный картридж имеет монолитную структуру. Способ производства обеспечивает образование стандартных квадратных картриджей или прямоугольных капилляров с трансляционной симметрией. Существенные преимущества ММСА включают в себя отсутствие любых специально приспособленных деталей в зоне детектирования.

Пример 6. Одномолекулярная ПЦР на микрочастицах в эмульсиях типа масло в воде

Специалист в данной области может проанализировать ПЦР-продукт электрофорезом в агарозном геле и определить количество выход ДНК с помощью набора PicoGreen dsDNA kit. Связывание праймеров с магнитными гранулами, покрытыми стрептавидином, делают путем суспендирования гранул в буфере для связывания и добавления праймера, конъюгированного с биотином. При необходимости готовят смесь эмульгатора в масле с использованием 7% (мас./об.) ABIL WE09, 20% (об./об.) минерального масла и 73% (об./об.) Tegosoft DEC и затем встряхивают на вортексе эту смесь. Специалист может ставить реакцию амплификации путем смешивания праймеров, матричной ДНК, dNTPs (пер., дезоксинуклеозидтрифосфатов), буфера для полимеразы и воды, и добавления, по порядку, одной стальной гранулы, смеси типа масло в эмульгаторе и смеси для ПЦР в одну лунку накопительной плашки. Специалист может запечатать плашку с помощью липкой ленты и перевернуть плашку вверх дном для гарантированного свободного движения стальной гранулы в лунке.

Специалист может собрать адапторный набор TissueLyser (эмульсии также могут быть созданы с помощью магнитного мешальника (магнитной мешалки) или гомогенизатора) путем послойной укладки 96-луночной накопительной плашки, содержащей эмульсионную смесь для ПЦР, между верхней и нижней пластинами адаптера, каждая приведенная в соответствие с облицовкой подушки для надавливания 96-луночной накопительной плашки, и поместить собранный комплект в держатель TissueLyser и плотно закрыть держатель. При использовании менее чем 192 лунок, уравновешивают TissueLyser с помощью второго адапторного набора одинакового веса. Специалист может перемешать один раз в течение 10 секунд при 15 Гц и один раз в течение 7 секунд при 17 Гц, температурный цикл эмульсий, и ресуспендировать гранулы в 0,1 М NaOH и инкубировать в течение 2 минут. Пробирку помещают в магнитный сепаратор на 1 минуту и осторожно удаляют супернатант. Детектирование ДНК на гранулах может быть произведено с помощью флуоресцентной гибридизацией олигонуклеотидов. Могут использовать проточную цитометрию для обнаружения относительной интенсивности флуоресценции праймеров, гибридизованных с ДНК на гранулах.

Количество ДНК, используемой в эмульсионной ПЦР, может изменяться в относительно широких пределах. Оптимально 15% гранул должны содержать ПЦР-продукты. Использование слишком малого количества матрицы дает в результате слишком незначительное количество положительных гранул, подвергая риску чувствительность анализа. Использование слишком большого количества матрицы дает в результате слишком много компартментов, содержащих множество матриц, создавая помехи для точного количественного определения фракции исходных матриц, содержащих последовательность интереса. Немагнитные гранулы могут быть применены, но должно быть использовано центрифугирование вместо магнитов для манипулирования гранулами.

Эффективность амплификации на твердых подложках в эмульсиях снижается вместе с увеличением длины ампликона. Предпочтительная длина ампликона (в том числе праймеров) составляет 70-110 п.о. Специалист может использовать универсальный праймер в качестве обратного праймера. Но могут использовать также вложенный обратный праймер, который производит ампликон короче, чем продукт стадии преамплификации для снижения неспецифической амплификации на гранулах или для уменьшения размера ПЦР-продукта, связанного с гранулой. Использование более высоких концентраций полимеразы дает в результате более высокий выход ПЦР-продуктов, связанных с гранулами. Другой способ увеличения количества ПЦР-продукта, связанного с гранулами, представляет собой амплификацию по типу катящегося кольца.

Пример 7. Изготовление монолитных мультикапиллярных картриджей

Специалист в данной области начинает с набора стеклянных наконечников. Размер и форму наконечников и толщину их стенок выбирают в зависимости от желаемого внутреннего размера капилляров и пространства между ними. Наконечники спрессовывают вместе в картридж, укладывают в стеклянную камеру квадратной формы и вытягивают при высокой температуре для сплавления их вместе. После окончания вытягивания цельная капиллярная структура может быть обрезана для предоставления необходимых длин. Вследствие адгезии полученный картридж имеет монолитную структуру. Способ производства обеспечивает образование стандартных квадратных картриджей или прямоугольных капилляров с трансляционной симметрией. Будучи монолитным, картридж действует в виде среды с малыми потерями при распространении света.

Специалисты в данной области изготавливают 32×32 и 64×128-капиллярные картриджи со сторонами квадрата 5 мкм и 10 мкм поперечных сечений капилляров, и шагом матрицы 10 мкм и 15 мкм. Для предотвращения потерь меченной ДНК на стенках капилляров используют капиллярную стенку, покрытую, например, БСА.

Пример 8. ПНР на закодированных гранулах

Гранулы, ковапентно покрытые стрептавидином, связывали с биотинилированными олигонуклеотидами (олиги) (см. фиг.14). Водную смесь, содержащую все необходимые компоненты для ПЦР, плюс гранулы с пришитыми праймерами и матричную ДНК, перемешивают вместе со смесью масло/детергент для создания микроэмульсий. Водные компартменты содержат в среднем менее, чем одну матричную молекулу и менее чем одну гранулу. Микроэмульсии проходят температурный цикл как в традиционной ПЦР. В случае, если ДНК-матрица и гранула находятся вместе в одном водном компартменте, то олигонуклеотиды, связанные с гранулами, действуют в качестве праймеров для амплификации.

Пример 9. Аутентичность документов

В некоторых вариантах изобретение относится к способу применения набора многоцветных гранул для уникального мечения несъедобной для человека продукции. Специалист в данной области (то есть, агентство) сначала создает, как описано выше, набор гранул размера N, каждая гранула помечена различной цветовой комбинацией (то есть каждая гранула имеет различную метку). Из этого набора посылают N, М гранул клиенту, который желает пометить ряд продукции. Специалисты называют это набором для мечения. Затем клиент берет небольшую, измеренную часть гранул из набора для мечения, который у него есть, и покрывает каждый образец продукции, который он желает пометить, с помощью небольшой, измеренной части (число гранул в этом наборе составляет Т). Теперь продукция является меченной, и следовательно, детектирование может происходить в любой момент. Поднабор гранул в образце продукции отделяют и прочитывают. Теперь детектор имеет набор меток. Этот набор меток посылают в агентство, которое затем сообщает детектору, кто заказал набор для маркировки, и любую информацию, которую получатель набора для мечения хотел сообщить детекторам.

Специалист подсчитывает относительные пропорции М, N и Т, необходимые для метки, и затем с очень высокой вероятностью, однозначно определяет набор для мечения на основании одной пробы. Сначала специалист вводит дополнительный фактор, R:

фракция гранул в пробе, которая была восстановлена для детектирования.

Исходя из того, что N сумма гранул, М-размерный набора для мечения, Т гранул на пробу и T×R гранул на попытку детектирования, специалист получает; вероятность нахождения гранулы в другом наборе, если гранула находится в наборе для мечения, составляет: (M/N). Вероятность нахождения T×R гранул в ОДНОМ особенном наборе составляет, поскольку они являются независимыми друг от друга: (М/N)^T×R. Это называют вероятностью столкновения.

Для подсчета вероятности любых из 2 выборок, являющихся одинаковыми, ссылаются на парадокс дня рождения. Он гласит, что для объектов с вероятностью столкновения X, и K объектов, вероятность 2, не являющихся одинаковыми, приблизительно составляет

(1-X)^C(K,2), которое приводят к (1-X)^{(1/2×K×(K-1))}

Хотят иметь K объект с вероятностью В, которая не является той же самой. Для этого, мы должны решить (для K)

(1-X)^{(1/2×K×(K-1))}=B

Для этого получают

K=(In[1-Х]+{[log[1-Х]]}^1/2×{8^×log[В]+ln[1-Х]}^1/2)/(2^×ln[1-X])

Таким образом, для М=10⁸, N=10⁹ и R=1, вероятность столкновения составляет 0,1^T. Для Т=20, соответственно, вероятность столкновения составляет 10²⁰. Если хотят, чтобы суммарная вероятность столкновения составляла не больше чем 95, тогда мы можем иметь вплоть до 3×10⁹ индивидуальных объектов.

Пример 10 иллюстрирует перемещение гранул в электрическом поле.

Две пробирки (фиг.16), которые содержат буферный раствор и содержат гранулы с закодированным спектральным штрих-кодом, соединяют однокапиллярным или мультикапиллярным картриджем. Применяют функционализированные карбоксильными группами, 500 нм полистирольные дивинилбензольные гранулы, легированные квантовыми точками (CrystalPlex Plex 890 William Pitt Way, Pittsburgh, PA 15238). Прикладывают электрический потенциал между указанными пробирками. Если гранулы несут электрический заряд, то они продвигаются по капилляру. Детектирование гранул выполняют с помощью возбуждаемой лазером флуоресценции.

1. Способ определения последовательности нуклеотидного типа в нуклеиновой кислоте и приготовления гранул с флуоресцентным маркером, включающий
а) обеспечение:
i) множества мезопористых стрептавидин-покрытых гранул, где каждая гранула несет спектральный код и связывает идентичные копии биотинилированной одноцепочечной нуклеиновой кислоты, присоединенной к гранулам за счет биотин-стрептавидинового взаимодействия;
ii) лунок, содержащих отдельный раствор для каждого нуклеотида, где каждый отдельный раствор содержит свободный нуклеотид, который помечен одной и только одной из четырех различных флуоресцентных меток;
b) контактирование гранул, связанных с нуклеиновой кислотой, с растворами в лунках, в условиях, при которых свободный нуклеотид прикрепляется к нуклеиновой кислоте, которую несут гранулы, так, чтобы встроиться в цепочку, комплементарную к указанной несущей цепочке, для создания связанных с нуклеиновой кислотой гранул, помеченных флуоресцентной меткой;
c) изолирование каждой из связанных с нуклеиновой кислотой гранул, помеченных флуоресцентной меткой;
d) обнаружение флуоресцентной метки на каждой из изолированных связанных с нуклеиновой кислотой гранул;
e) определение указанного люминесцентного электромагнитного сигнала, полученного от каждой из изолированных связанных с нуклеиновой кислотой гранулы, помеченной флуоресцентной меткой;
f) запись полученных сигналов;
g) устранение противоречий определенных сигналов для создания уникально закодированных гранул, где каждая уникально закодированная гранула несет молекулы нуклеиновой кислоты с уникальной последовательностью, и
h) идентификация и запись помеченных флуоресцентной меткой нуклеотидов, связанных с каждой уникально закодированной гранулой;
i) сбор указанных гранул в едином сосуде;
j) удаление указанных флуоресцентных меток из связанных с гранулами нуклеотидов;
k) удлинение указанной комплементарной цепочки путем неоднократного повторения этапов от b) до k);
l) анализ сигналов для определения нуклеотидной последовательности.

2. Способ по п.1, в котором указанные свободные нуклеотиды включают обратимый терминатор.

3. Способ по п.2, где после шага е) указанный обратимый терминатор является незащищенным.