Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы



Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы
Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы

 


Владельцы патента RU 2492243:

КОНИНКЛЕЙКЕ ФИЛИПС ЭЛЕКТРОНИКС Н.В. (NL)
КОЛД СПРИНГ ХАРБОР ЛЭБОРЕТЕРИ (US)

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к способу анализа онкологических заболеваний молочной железы, и может быть использовано в медицине. Способ включает определение статуса геномного метилирования динуклеотидов CpG в каждой последовательности из группы последовательностей SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10, полученных из образцов человеческой ткани молочной железы, введение одного или нескольких результатов теста на определение статуса метилирования в классификатор, полученный исходя из диагностической поливариативной модели, построенной на основе базы данных по молочной железе и группы последовательностей SEQ ID NO.1-10. Затем рассчитывают вероятность того, получен ли образец из нормальной ткани или ткани рака молочной железы, и рассчитывают ассоциированную величину р для достоверности в прогнозе. Матрица содержит не более 100 различных молекул нуклеиновой кислоты и включает нуклеиновые кислоты с последовательностями, которые идентичны последовательностям ДНК, соответствующим SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10. Изобретение позволяет эффективно идентифицировать, диагностировать, лечить и наблюдать клеточно-пролиферативные заболевания молочной железы, а также определять предрасположенность к клеточно-пролиферативным заболеваниям молочной железы. 2 н. и 7 з. п. ф-лы, 3 ил., 2 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области биологии и химии, более конкретно к области молекулярной биологии и генетики человека. Изобретение относится к области идентификации метилированных сайтов в ДНК человека, в частности метилированных сайтов в некоторых определенных последовательностях, которые при метилировании указывают на рак молочной железы.

Уровень техники

Во всем мире рак молочной железы занимает пятое место среди самых распространенных причин смерти от рака (после рака легких, рака желудка, рака печени и рака толстого кишечника). В 2005 рак молочной железы был причиной смерти 502000 пациентов (7% летальных исходов от рака; почти 1% всех летальных исходов) во всем мире. Среди женщин во всем мире рак молочной железы представляет собой самую распространенную форму рака и самую частую причину летального исхода от рака.

В Соединенных Штатах Америки рак молочной железы занимает третье место среди самых распространенных причин смерти от рака (после рака легких и рака толстого кишечника). Считается, что в 2007 в США рак молочной железы явился причиной 40910 летальных исходов (7% летальных исходов от рака; почти 2% всей смертности). Среди женщин в США рак молочной железы является самой распространенной формой рака и второй из самых частых причин смерти от рака (после рака легких). Женщины в США имеют риск развития инвазивного рака молочной железы 1 на 8 и риск рака молочной железы, приводящего к их летальному исходу, 1 на 33.

Рак молочной железы диагностируется с помощью патологической (микроскопической) оценки ткани молочной железы, удаленной хирургическим путем. Ткань или клетки могут быть получены большим числом способов перед окончательной обработкой для гистологической или цитологической оценки. К таким способам относятся аспирационная диагностическая пункция, аспираты из сосков, протоковый лаваж, толстоигольная биопсия и локальная биопсия, осуществляемая хирургическим путем. Эти диагностические стадии при сочетании с радиографическим изображением, как правило, точны в диагностике поражения молочной железы, такого как рак. Иногда предхирургические способы, такие как аспирационная диагностическая пункция, могут не дать достаточного количества ткани для постановки диагноза или могут совсем не распознать рак. Для детекции метастаза иногда используют тесты с получением изображения, к ним относятся рентген грудной клетки, остеосцинтиграфия, СТ, MRI и PET-сканирование. Несмотря на то, что исследования с получением изображения можно использовать в определении наличия метастазирующего заболевания, их не используют для этого, и они сами по себе не диагностируют рак. Лишь с помощью микроскопической оценки биопсийного образца можно поставить диагноз рака. Са 15.3 (углеводный антиген 15.3, эпителиальная слизь) представляет собой маркер опухоли, определяемый в крови, который может быть использован для отслеживания активности заболевания с течением времени после окончания лечения. Тестирование маркера опухоли, присутствующего в крови, как правило, не осуществляют для скрининга рака молочной железы, и оно обладает неудовлетворительными рабочими показателями для этой цели.

Поэтому было бы полезно иметь способ анализа онкологических заболеваний молочной железы, который был бы быстрым, достоверным и мог быть теоретически осуществлен необученным персоналом. Такой способ теоретически не требовал бы анализа обученным врачом.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу анализа онкологических заболеваний молочной железы, включающему определение в панели последовательностей ДНК статуса геномного метилирования одного или нескольких динуклеотидов CpG в каждой последовательности, где последовательности ДНК выбирают из группы SEQ ID NO.1-100, в частности из группы последовательностей, соответствующих SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10 и SEQ ID NO.50-SEQ ID NO.60.

Представляющие интерес области приведены в таблице 1А и таблице 1В («начало» и «конец»).

Области CpG представляют собой области с большим числом цитозина и гуанина, прилегающих друг к другу в скелете ДНК (т.е. связанных фосфодиэфирными связями). Они расположены внутри и около примерно 40% промоторов генов млекопитающих (около 70% в промоторах человека). Под «р» в обозначении CpG понимают фосфодиэфирную связь между цитозином и гуанином.

Длина области CpG обычно составляет 300-3000 пар оснований. Эти области отличаются содержанием динуклеотидов CpG, равным или большим, чем можно было бы предположить статистически (≈6%), тогда как остальная часть генома имеет гораздо меньшую частоту встречаемости CpG (≈1%), явление, называемое супрессией CG. В отличие от сайтов CpG в кодирующей области гена в большинстве случаев сайты CpG в областях CpG промоторов неметилированы при экспрессии генов. Эта находка привела к предположению, что метилирование сайтов CpG в промоторе гена может ингибировать экспрессию гена. Метилирование является основой импринтинга наряду с модификациями гистонов. Принятое формальное определение области CpG - это область по меньшей мере из 200 п.н. и с процентом GC больше 50% и с соотношением обнаруженные/ожидаемые CpG больше 0,6.

В рамках изобретения динуклеотид CpG представляет собой динуклеотид CpG, который может быть обнаружен в метилированном и неметилированном состоянии in vivo, в частности, у человека.

Изобретение относится к способу, в котором первичный рак детектируют, используя паттерн метилирования одной или нескольких последовательностей, описанных в настоящем описании, а также в котором полученный паттерн метилирования используют для прогнозирования терапевтического ответа на лечение рака молочной железы.

В рамках изобретения под индивидуумом понимают всех людей, пациентов, животных, вне зависимости от того, наблюдаются ли у них или нет патологические изменения. В рамках изобретения образцом диагностического пациента может быть любой образец, собранный из клеток, тканей, органов, организмов или подобного. В предпочтительном варианте осуществления пациентом по изобретению является человек. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления изобретения пациентом является человек, предположительно страдающий заболеванием, выбранным из следующей группы: первичный рак молочной железы, вторичный рак молочной железы, поверхностная эпителиально-стромальная опухоль, опухоль стромы полового тяжа яичников, опухоль из герминативных клеток.

Способ используется в улучшенной диагностике, лечении и мониторинге клеточно-пролиферативных заболеваний молочной железы, например, содействуя улучшенной идентификации и дифференциации между подклассами указанного заболевания и определению генетической предрасположенности к указанным заболеваниям. Изобретение представляет улучшения существующего уровня техники в том, что оно дает возможность высокоспецифичной классификации клеточно-пролиферативных заболеваний молочной железы, таким образом, содействуя улучшенному и информированному лечению пациентов.

В рамках изобретения заявленные последовательности также охватывают последовательности, которые обратно комплементарны указанным последовательностям.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлен способ определения дифференциально метилированных областей генома. Это более подробно изложено в примерах.

На фиг.2 показаны сгруппированные образцы (колонки) против локусов метилирования (ряды). Показатели метилирования могут различаться между опухолями (левая часть полосы сверху) и нормальной тканью (правая часть полосы сверху).

На фиг.3 показано группирование способа построения изобретения и его характерные особенности. Собирают образец пациента и определяют статус метилирования специфических последовательностей любым из предпочтительных вариантов осуществления. Затем результаты вводят в классификатор, такой как машина опорных векторов, которая классифицирует как опухолевый образец или нормальный образец и дает величину р.

Подробное описание вариантов осуществления

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что для анализа онкологических заболеваний молочной железы можно использовать небольшую селекцию последовательностей ДНК. Это осуществляют, определяя статус геномного метилирования одного или нескольких динуклеотидов CpG в какой-либо из последовательностей, описанных в настоящем описании, либо обратно комплементарной ей. В целом идентифицировали около 900 последовательностей, которые подходят для такого анализа. Оказалось, что особенно подходят 100 последовательностей.

На основе лишь 10 последовательностей, таких как верхние десять элементов из таблицы 1А или 1В (величина р 0,0001), возможно достичь точности классификации 94% (суммарное правильное прогнозирование в отношении вопроса, получен ли данный образец из опухоли молочной железы или нет, по сравнению со всем осуществленным прогнозированием 49/52). Чувствительность детекции опухоли составляла 92,5% (37/40), специфичность детекции опухоли=100%. Увеличение количества элементов до 50 дает коэффициент классификации 96% (50/52 классифицировано правильно).

Последовательности могут быть обнаружены в генах, как можно видеть в таблице 1А ниже.

Таблица 1A
SEQ ID NO. ID Хромосома Начало Конец Величина p Название гена
1 ID173583 chr8 125810238 125810819 0,0000217 MTSS1
2 ID135122 chr4 9040795 9041453 0,000058 DUB3
3 ID59231 chr15 87711410 87711904 0,0000000747 hsa-mir-9-3
4 ID135160 chr4 9459627 9459776 0,0000000115 DRD5
5 ID123222 chr22 43445548 43445907 0,000000192 PRR5
6 ID41349 chr12 105476974 105477298 0,000000362 RFX4
7 ID146518 chr5 140703634 140703867 0,000000443 PCDHGA3
8 ID66687 chr16 65169983 65170374 0,000000574 AY862139
9 ID11596 chr1 146066973 146067308 0,000000872 AK123662
10 ID112724 chr20 22514937 22515431 0,0000012 FOXA2
11 ID56406 chr15 50874380 50874668 0,00000131 ONECUT1
12 ID11658 chr1 146486000 146486341 0,00000157 AK123662
13 ID114005 chr20 39198472 39198934 0,00000162 PLCG1
14 ID41387 chr12 105851242 105851742 0,00000276 MGC17943
15 ID130737 chr3 138963266 138963653 0,0000029 SOX 14
16 ID27050 chr11 3819507 3820119 0,00000306 RHOG
17 ID98568 chr19 63407518 63407732 0,00000467 ZNF274
18 ID160851 chr7 35070796 35071213 0,0000062 TBX20
19 ID9698 chr1 92126308 92126790 0,00000624 BRDT
20 ID35001 chr11 124134059 124134403 0,0000129 AY189281
21 ID188098 chrX 113641444 113641884 0,0000135 BC028688
22 ID41218 chr12 103034912 103035336 0,0000139 NFYB
23 ID4450 chr1 23416592 23417362 0,0000151 HNRPR
24 ID97179 chr19 56695742 56696075 0,0000166 SIGLEC12
25 ID137603 chr4 89285337 89285745 0,0000208 PKD2
26 ID77777 chr17 55854004 55854719 0,0000242 LOC124773
27 ID146531 chr5 140715120 140715429 0,0000303 PCDHGB2
28 ID76724 chr17 44159203 44159574 0,0000679 PRAC
29 ID135120 chr4 9006410 9006713 0,0000874 DUB3
30 ID135121 chr4 9017069 9017727 0,0000911 AY509884
31 ID71929 chr17 7695823 7696284 0,000130076 LOC92162
32 ID11593 chr1 146066575 146066841 0,000154186 AK123662
33 ID120446 chr22 20546877 20547317 0,0001669 MAPK1
34 ID146484 chr5 140601695 140601937 0,000192752 PCDHB15
35 ID103546 chr2 86334450 86334476 0,000264959 MRPL35
36 ID161220 chr7 43853299 43853383 0,00030013 DBNL
37 ID11654 chr1 146485690 146485868 0,000310651 AK123662
38 ID146595 chr5 140777723 140778009 0,000318226 PCDHGA11
39 ID173389 chr8 121206506 121207025 0,000396103 COL14A1
40 ID160133 chr7 26919212 26919376 0,000432818 HOXA2
41 ID118279 chr21 42946007 42946287 0,000498108 PDE9A
42 ID68965 chr16 86694584 86695293 0,000498402 AK126852
43 ID16024 chr1 224770811 224771150 0,000548832 BC043916
44 ID91933 chr19 18831977 18832267 0,000607126 AK125797
45 ID146581 chr5 140768066 140768556 0,000680057 PCDHGA10
46 ID61023 chr16 954593 954879 0,000792141 AK127296
47 ID146570 chr5 140757958 140758452 0,000996446 PCDHGA9
48 ID171504 chr8 65454257 65455748 0,000953039 hsa-mir-124a-2
49 ID168737 chr8 9798186 9798550 0,000137444 hsa-mir-124a-1
50 ID12521 chr1 153203369 153203671 0,000101994 hsa-mir-9-1

Последовательности могут быть обнаружены в межгенных областях, как можно видеть в таблице 1В.

Таблица 1B
SEQ ID NO. ID Хромосома Начало Конец Величина p
51 ID33426 chr11 89160048 89160322 1,14E-10
52 ID90896 chr19 15148984 15149357 1,14E-10
53 ID29499 chr11 49026728 49027002 4,06E-10
54 ID169777 chr8 24827761 24828171 6,48E-10
55 ID109204 chr2 220021958 220022344 8,65E-10
56 ID103749 chr2 91295935 91296161 1,82E-09
57 ID99161 chr2 2812784 2813304 1,82E-09
58 ID45297 chr13 27400198 27400742 3,38E-09
59 ID166666 chr7 149354316 149354562 6,06E-09
60 ID167174 chr7 152884159 152884405 6,96E-09
61 ID34211 chr11 113989177 113989682 9,11E-09
62 ID152478 chr6 42253517 42253868 9,63E-09
63 ID24712 chr10 130382122 130382412 9,63E-09
64 ID49246 chr14 28324500 28324758 1,30E-08
65 ID34960 chr11 123811259 123816128 1,34E-08
66 ID112713 chr20 22506327 22506681 1,59E-08
67 ID54570 chr15 24795835 24796140 2,70E-08
68 ID89508 chr19 9469673 9470021 2,98E-08
69 ID 13622 chr1 177614171 177614509 3,10E-08
70 ID 1820 chr1 3672455 3672910 3,10E-08
71 ID29015 chr11 45136542 45137024 3,10E-08
72 ID91861 chr19 18622132 18622478 3,46E-08
73 ID77745 chr17 55571595 55571965 4,18E-08
74 ID98238 chr19 61846590 61847055 4,44E-08
75 ID76689 chr17 44074514 44074967 4,50E-08
76 ID76692 chr17 44075076 44075400 6,20E-08
77 ID59231 chr15 87711410 87711904 7,47E-08
78 ID124608 chr3 6878205 6878499 8,97E-08
79 ID10950 chr1 116868496 116868706 9,58E-08
80 ID159953 chr7 24097508 24097911 9,58E-08
81 ID115475 chr20 58536847 58537548 1,23E-07
82 ID126115 chr3 38714269 38714730 1,92E-07
83 ID71392 chr17 6057091 6057605 2,51E-07
84 ID105601 chr2 121341432 121341916 2,61E-07
85 ID168382 chr8 1982797 1983256 2,61E-07
86 ID147288 chr5 158456751 158457100 2,69E-07
87 ID137304 chr4 81466911 81467150 3,30E-07
88 ID179567 chr9 101579069 101579476 3,92E-07
89 ID3487 chr1 16606704 16606778 4,25E-07
90 ID92361 chr19 34425570 34426104 4,25E-07
91 ID177598 chr9 66276397 66276499 4,45E-07
92 ID3846 chr1 18994906 18995319 5,42E-07
93 ID35773 chr12 125067 125386 5,88E-07
94 ID117488 chr21 33327565 33327930 7,29E-07
95 ID89802 chr19 10450948 10451249 8,72E-07
96 ID64615 chr16 29702807 29703873 8,92E-07
97 ID168612 chr8 7917174 7917432 9,20E-07
98 ID16187 chr1 225850241 225850586 9,73E-07
99 ID73339 chr17 21160807 21161232 1,13E-06
100 ID 18029 chr10 11462206 11463043 1,53E-06

Гены, которые образуют основу настоящего изобретения, предпочтительно используют для формирования «панели генов», т.е. коллекции, содержащей конкретные генетические последовательности по настоящему изобретению и/или соответствующие им информативные сайты метилирования. Формирование панелей генов дает возможность быстрого и специфического анализа специфических аспектов рака молочной железы. Панель(и) генов, описанная(ые) и используемая(ые) в этом изобретении, может(гут) быть с неожиданно высокой эффективностью использована(ы) для диагностики, лечения и мониторинга, а также анализа предрасположенности к клеточно-пролиферативным заболеваниям молочной железы, в частности, опять же для детекции опухоли молочной железы.

Кроме того, применение большого числа сайтов CpG из различного набора генов дает возможность относительно высокой степени чувствительности и специфичности в сравнении со способами диагностики и детекции по одному гену.

Изобретение относится к способу анализа онкологических заболеваний молочной железы, включающему определение в панели по меньшей мере из четырех последовательностей ДНК статуса геномного метилирования одного или нескольких динуклеотидов CpG в каждой последовательности, где последовательности выбирают из группы последовательностей согласно SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10 и SEQ ID NO.50-SEQ ID NO.60.

В одном из вариантов осуществления предпочтительно, чтобы определяли статус метилирования одной или нескольких последовательностей, соответствующих SEQ ID NO.1-100, где последовательность имеет величину р, определенную в настоящем описании, которая меньше, чем 1Е-4 (0,0001), как указано в таблице 1А или 1В.

В одном из вариантов осуществления способа по изобретению анализ представляет собой детекцию рака молочной железы у индивидуума и при этом осуществляют следующие стадии: (а) получение образца от анализируемого индивидуума, (b) определение в панели по меньшей мере из четырех последовательностей ДНК статуса метилирования одного или нескольких динуклеотидов CpG в каждой последовательности, где последовательности ДНК выбирают из группы последовательностей согласно SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10 и SEQ ID NO.50-SEQ ID NO.60.

Статус метилирования областей CpG указывает на рак молочной железы. Предпочтительно, тем не менее, статус метилирования определяют для каждого CpG и определяют дифференциальный паттерн метилирования, поскольку не все области CpG обязательно должны быть метилированы.

Необязательно, осуществляют следующие стадии: (а) один или несколько результатов теста на определение статуса метилирования вводят в классификатор, который получают исходя из диагностической поливариативной модели, (b) рассчитывают вероятность того, получен ли образец из нормальной ткани или ткани рака молочной железы, и/или (с) рассчитывают ассоциированную величину р для степени достоверности в прогнозе.

Например, авторы изобретения используют классификатор метода опорных векторов для «изучения» важных характеристик опухоли или нормального образца на основе предварительно определенного набора тканей, полученных от пациентов. В настоящее время алгоритм выводится классификатором (уравнение, в котором переменные представляют собой коэффициенты метилирования из набора используемых элементов). Коэффициенты метилирования образца нового пациента затем вносят в этот классификатор. Результат может быть 1 или 0. Для получения величины р используют расстояние от критического уровня.

Предпочтительно, чтобы дополнительно определяли статус геномного метилирования одной или нескольких последовательностей ДНК, выбранных из группы последовательностей, соответствующих SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.49 и SEQ ID NO.61-SEQ ID NO.100.

В одном из вариантов осуществления статус метилирования определяют по меньшей мере для десяти последовательностей ДНК, по меньшей мере двадцати последовательностей, по меньшей мере тридцати последовательностей, по меньшей мере сорока последовательностей или более чем сорока последовательностей из последовательностей согласно SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.100. Особенно предпочтительно, чтобы статус метилирования определяли для всех последовательностей, соответствующих SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.100.

В одном из вариантов осуществления статус метилирования определяют для последовательностей ДНК, соответствующих SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10 и SEQ ID NO.50-SEQ ID NO.60. По существу изобретение также относится к определению статуса метилирования лишь одной из последовательностей, соответствующих SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.100.

Существует большое число способов определения статуса метилирования молекулы ДНК. Предпочтительно, чтобы статус метилирования определяли с помощью одного или нескольких способов, выбранных из следующей группы: бисульфитное секвенирование, пиросеквенирование, одноцепочечный конформационный анализ, чувствительный к метилированию (MS-SSCA), анализ кривых плавления с высоким разрешением (HRM), однонуклеотидное удлинение праймеров, чувствительное к метилированию (MS-SnuPE), расщепление по специфическим парам оснований/MALDI-TOF, ПЦР, специфичная к метилированию (MSP), способы на основе микроматриц и расщепление рестриктазой MspI. Общий обзор дополнительных известных способов определения 5-метилцитозина может быть получен из следующей обзорной статьи: Rein, T., DePamphilis, M.L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255. Дополнительные способы описаны в заявке на патент США 2006/0292564А1.

В предпочтительном варианте осуществления статус метилирования определяют путем расщепления с помощью MspI, лигирования адапторов, расщепления ферментом McrBC, ПЦР-амплификации, мечения и последующей гибридизации.

Предпочтительно, чтобы анализируемый образец был получен из типа тканей, выбранного из группы тканей, например тканевой биопсии, полученной из анализируемой ткани, вагинальной ткани, языка, поджелудочной железы, печени, селезенки, яичника, мышцы, соединительной ткани, нервной ткани, ткани желудочно-кишечного тракта, опухолевой ткани, жидкостей организма, крови, сыворотки, слюны и мочи.

В предпочтительном варианте осуществления определяют первичный рак молочной железы.

В одном из вариантов осуществления способа по изобретению полученный паттерн метилирования используют для прогнозирования терапевтического ответа на лечение рака молочной железы.

Настоящее изобретение также относится к зондам, таким как олигонуклеотиды, которые находятся в области вблизи сайтов CpG. Олигомеры по настоящему изобретению обычно используются в так называемых «наборах», которые содержат по меньшей мере один олигонуклеотид для каждого из динуклеотидов CpG в последовательности от SEQ ID NO.1 вплоть до SEQ ID NO.100 или по меньшей мере для 10, предпочтительно 20, более предпочтительно 30, наиболее предпочтительно более чем 50 указанных последовательностей. Изобретение также относится к обратному комплементу олигонуклеотидов, которые расположены в области сайтов CpG.

Зонды, используемые для такого анализа, определяют исходя из одного или нескольких из следующих условий: (1) последовательность зонда встречается в геноме человека лишь один раз; (2) плотность нуклеотидов С/G в зонде составляет от 30% до 70%; (3) характеристики плавления гибридизации и другие критерии соответствуют описанным в статье Mei R et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, Sept.30; 100(20).11237-42.

В очень предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к набору олигонуклеотидов, которые специфичны для последовательностей, соответствующих SEQ ID NO.1-10 и/или SEQ ID NO:50-60, или SEQ ID NO.50-60. Олигонуклеотид по изобретению может быть специфичным для последовательности, которая встречается in vivo, или он может быть специфичен для последовательности, которую обработали бисульфитом. Такой зонд имеет длину от 10 до 80 нуклеотидов, более предпочтительно длину от 15 до 40 нуклеотидов.

В случае наборов олигонуклеотидов по настоящему изобретению предпочтительно, чтобы по меньшей мере один олигонуклеотид связывался с твердой фазой. Дополнительно предпочтительно, чтобы все олигонуклеотиды одного набора связывались с твердой фазой.

Настоящее изобретение дополнительно относится к набору по меньшей мере из 10 зондов (олигонуклеотидов и/или PNA-олигомеров), используемому для детекции состояния метилирования цитозина геномной ДНК путем анализа указанной последовательности или обработанных версий указанной последовательности (согласно SEQ ID NO.1 вплоть до SEQ ID NO.100 и последовательностей, комплементарных им).

Эти зонды дают возможность улучшить детекцию, диагностику, лечение и мониторинг клеточно-пролиферативных заболеваний молочной железы.

Набор олигонуклеотидов также может быть использован для определения однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) путем анализа указанной последовательности или обработанных версий указанной последовательности, соответствующей одной из последовательностей SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.100.

По настоящему изобретению предпочтительно, чтобы расположение различных олигонуклеотидов и/или PNA-олигомеров (так называемая «матрица»), доступных по настоящему изобретению, было подобрано таким образом, чтобы также связываться с твердой фазой.

Эта матрица из последовательностей различных олигонуклеотидов и/или PNA-олигомеров может отличаться тем, что она располагается на твердой фазе в виде прямоугольной или гексагональной решетки. Поверхность твердой фазы предпочтительно состоит из силикона, стекла, полистирола, алюминия, стали, железа, меди, никеля, серебра или золота. Тем не менее, подходящими альтернативами являются нитроцеллюлоза, а также пластмассы, такие как найлон, который может существовать в виде гранул, или также как смоляные матрицы.

Поэтому дополнительным объектом настоящего изобретения является способ получения матрицы, фиксированной на материале носителя, для улучшенной идентификации, диагностики, лечения и наблюдения клеточно-пролиферативных заболеваний молочной железы и/или определения предрасположенности к клеточно-пролиферативным заболеваниям молочной железы. В указанном способе по меньшей мере один олигонуклеотид по настоящему изобретению связывается с твердой фазой. Способы получения таких матриц известны, например, из патента США № 5744305, с помощью твердофазной химии и светочувствительных защитных групп. Дополнительный объект настоящего изобретения относится к ДНК-чипу для улучшенной идентификации, диагностики, лечения и мониторинга клеточно-пролиферативных заболеваний молочной железы. Более того, ДНК-чип позволяет определять предрасположенность к клеточно-пролиферативным заболеваниям молочной железы.

ДНК-чип содержит по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту и/или олигонуклеотид по настоящему изобретению. ДНК-чипы известны, например, из патента США № 5837832.

Изобретение также относится к композиции или матрице, содержащей нуклеиновые кислоты с последовательностями, которые идентичны по меньшей мере 10 последовательностям, соответствующим с SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.100, где композиция или матрица содержит не более 100 различных молекул нуклеиновых кислот.

Настоящее изобретение относится к композиции или матрице, содержащей по меньшей мере 5 последовательностей с суммарной величиной р менее 0,001, предпочтительно менее 0,0001.

Более того, объектом настоящего изобретения является набор, который может быть составлен, например, из реагента, содержащего бисульфит, набора праймерных олигонуклеотидов, содержащего по меньшей мере два олигонуклеотида, последовательности которых в каждом случае соответствуют или комплементарны сегменту длиной по меньшей мере 15 оснований нуклеотидных последовательностей, заданных в SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.100. Предпочтительно, чтобы праймеры имелись для последовательностей с SEQ ID NO. 1 по SEQ ID NO. 10 и с SEQ ID NO. 50 по SEQ ID NO. 60.

ПРИМЕРЫ

ОБРАЗЦЫ

Образцы пациентов получали из Norwegian Radium Hospital, Oslo, Norway и National Cancer Institute's Cooperative Human Tissue Network (CHTN), и согласие пациентов получали согласно требованиям законодательства.

ОБЛАСТИ CPG

Аннотированные области CpG получали из программного средства для просмотра генома UCSC. Эти области предсказывали используя опубликованное определение Gardiner-Garden (Gardiner-Garden, M. and M. Frommer (1987). “CpG islands in vertebrate genomes.” J Mol Biol 196(2): 261-82), включающее следующие условия: длина>=200н.п., %GC>=50%, наблюдаемые/предполагаемые CpG>=0,6. В геноме существует ~26219 областей CpG в диапазоне от 200 н.п. до 2000 н.п. Эти области хорошо покрываются фрагментацией рестриктазой Msp I.

Матрицы выпускались фирмой Nimblegen Systems Inc, используя формат 390К для следующих технических данных. Для создания 50-мерной черепичной (tiling) матрицы использовали аннотацию областей CpG из генома человека build 33 (hg17). Для равномерного распределения области 50-меры переносили по обе стороны от координат последовательности области. Формат 390К обладает 367658 доступными элементами, которые не вместили бы всех областей при 50-мерном звене. Поэтому авторы изобретения остановились на областях, представленных на основе размера, анализируя лишь области CpG размера 200н.п.-2000н.п. Для представления фонового сигнала создавали контрольные зонды. Подготовка образца: описание было дано ранее (Lucito, R., J. Healy, et al. (2003). “Representational oligonucleotide microarray analysis: a high-resolution method to detect genome copy number variation” Genome Res 13(10): 2299-305), со следующими изменениями. Используемая первичная эндонуклеаза рестрикции представляет собой MspI. После расщепления лигировали следующие линкеры (MspI24-мер и MSPI12-мер). 12-Мер не фосфорилируется и не лигирует. После лигирования материал очищают с помощью фенола-хлороформа, осаждают, центрифугируют и ресуспендируют. Материал делят пополам, половину расщепляют эндонуклеазой McrBC, а для другой половины симулируют расщепление. По меньшей мере четыре пробирки объемом 250 мкл использовали для каждой пары образцов для увеличения копийности каждого с проведением реакции в объеме 100 мкл. Условия проведения цикла: 95°C в течение 1 мин, 72°C в течение 3 мин на протяжении 15 циклов с последующим удлинением в течение 10 мин при 72°C. При завершении содержимое пробирок для каждой пары объединяли. Копии очищали путем экстракции смесью фенол:хлороформ, осаждали, ресуспендировали и определяли концентрацию. ДНК метили, как описано, с незначительными изменениями (Lucito, R., J. Healy, et al. (2003). “Representational oligonucleotide microarray analysis: a high-resolution method to detect genome copy number variation” Genome Res 13(10): 2299-305). В кратком изложении 2 мкг ДНК-матрицы помещали (растворив в ТЕ-буфере при рН 8) в пробирки для проведения ПЦР объемом 0,2 мл. Добавляли 5 мкл случайных девятичленных полимеров (продукция фирмы Sigma Genosys), доводя с помощью dH2O до 25 мкл, и перемешивали. Пробирки помещали в Tetrad при 100°C в течение 5 мин, после чего на лед в течение 5 мин. К продукту добавляли 5 мкл буфера NEB, по 2,5 мкл каждого dNTP (0,6 нм dCTP, 1,2 нм dATP, dTTP, dGTP), 5 мкл метки (Cy3-dCTP или Cy5-dCTP), производства фирмы GE Healthcare, 2 мкл фрагмента Кленова NEB и 2 мкл dH2O. Способы гибридизации и отмывки соответствовали сообщенным ранее (Lucito, R., J. Healy, et al. (2003). “Representational oligonucleotide microarray analysis: a high-resolution method to detect genome copy number variation” Genome Res 13(10): 2291-305) за исключением того, что температуру печи для гибридизации повышали до 50°C. Матрицы сканировали с помощью набора для сканера Axon GenePix 4000B при размере пикселя 5 мкм. Для количественного определения интенсивности свечения матриц использовали программное обеспечение GenePix Pro 4.0. Данные, полученные с помощью матриц, вводили в S-PLUS для дополнительного анализа.

АНАЛИЗ ДАННЫХ

Изображения, полученные с помощью микроматриц, сканировали на сканере GenePix 4000B и получали данные используя программное обеспечение Nimblescan (продукция фирмы Nimblegen Systems Inc). Для каждого зонда среднее геометрическое коэффициентов (GeoMeanRatio) McrBc и контрольных обработанных образцов рассчитывали для каждого эксперимента и ассоциированной с ним смены красителя. Коэффициенты GeoMeanRatio всех образцов в совокупности данных затем нормализовали, используя способ квантильной нормализации (Bolstad,B.M., R.A. Irizarry, et al. (2003). “A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias” Bioinformatics 19(2): 185-93). Коэффициенты нормализации для каждого эксперимента затем сжимали до получения одной величины для всех зондов в каждом фрагменте, полученном после расщепления рестриктазой MspI, используя модель медианного сглаживания. Сжатые данные затем использовали для дополнительного анализа.

Для идентификации самых существенных областей использовали дисперсионный анализ. Для определения самых постоянно встречающихся изменений в метилировании между опухолевыми и нормальными образцами авторы изобретения использовали подход t-теста. Используя предельную величину р 0,001 после поправки на множественное тестирование (False Discovery Rate, Benjamini and Hotchberg (Benjamini 1995)), авторы получили список из 916 фрагментов MspI, где наблюдается различное метилирование этих 916 фрагментов исходя из ассоциации с генами.

Управляемое обучение: для идентификации количества элементов, требуемого для установления отличия опухолевых образцов от нормальных, авторы использовали классификатор с управляемым обучением. Для получения точности классификации использовали общедоступную библиотеку опорных векторов (SVM) (LibSVM Версия 2.8), используя способ с исключением объектов по одному (Lin, C.J. and Chang C.C. (2001). LIBSVM: a library for support vector machines). Элементы метилирования для классификации сначала выбирали, используя t-тест только среди данных режима обучения. SVM затем обучали на первых 10, 50 и 100 элементах, используя основной компонент радиальной базисной функции (RBF).

Для N образцов для идентификации фрагментов с существенными различиями в коэффициентах метилирования t-тесты осуществляли для (N-1) образцов. Для базы данных по молочной железе эту процедуру осуществляли 52 раза для всех 52 образцов молочной железы, так что в процессе расчетов t-теста каждый образец удаляется один раз. Коэффициенты метилирования элементов первых 10 фрагментов из (N-1) образцов затем использовали для обучения SVM, и коэффициенты от одного образца, не использованного для обучения SVM, использовали для тестирования. Основываясь только на 10 элементах, авторы могут достичь точности классификации 94% (суммарно правильные прогнозы/все прогнозы, 49/52). Чувствительность идентификации опухоли составила 92,5% (37/40), специфичность идентификации опухоли составила 100%). Увеличение количества элементов до 50 дает степень классификации 96% (50/52 классифицировано верно). Интересно, что два образца опухоли, которые классифицировали как нормальные в этом анализе, оказались также приближены к нормальным как в анализе экспрессии генов, так и анализе ROMA.

ДЕТЕКЦИЯ МЕТИЛИРОВАННЫХ САЙТОВ

В предпочтительном варианте осуществления способ включает следующие стадии: на первой стадии способа образец геномной ДНК должен быть выделен из источников, таких как клеточные линии, образцы ткани или крови. Экстракцию ДНК можно осуществить средствами, которые являются стандартными для специалиста в данной области. К ним относятся применение детергентных лизатов, обработка ультразвуком и интенсивное перемешивание со стеклянными бусинами. После того как нуклеиновые кислоты были экстрагированы, геномную двухцепочечную ДНК использовали в анализе.

В предпочтительном варианте осуществления ДНК может быть расщеплена перед следующей стадией способа, причем это можно осуществить любыми средствами, принятыми на существующем уровне техники, в частности, но ими не ограничиваясь, с помощью эндонуклеаз рестрикции.

На второй стадии способа образец геномной ДНК обрабатывают таким образом, чтобы цитозиновые основания, которые неметилированы в 5'-положении, преобразовать в урацил, тимин или другое основание, которое отличается от цитозина с точки зрения реакции гибридизации. Далее в настоящем описании это необходимо понимать как «предварительную обработку».

Описанную выше обработку геномной ДНК предпочтительно осуществляют с помощью бисульфита (сульфита, дисульфита) и последующего щелочного гидролиза, который приводит к преобразованию неметилированных цитозиновых нуклеиновых оснований в урацил или другое основание, которое отличается от цитозина с точки зрения реакции основания вайрин (vairine). При использовании для проведения реакции бисульфитного раствора добавление происходит по неметилированным цитозиновым основаниям. Более того, должен присутствовать денатурирующий реагент или растворитель, а также перехватчик радикалов. Последующий щелочной гидролиз тогда приводит к преобразованию неметилированных цитозиновых нуклеиновых оснований в урацил. Конвертированную ДНК затем используют для детекции метилированных цитозинов.

Фрагменты амплифицируют. Исходя из статистических и практических соображений предпочтительно амплифицируют более десяти различных фрагментов, имеющих длину 100-2000 пар оснований. Амплификация нескольких сегментов ДНК может быть осуществлена одновременно в одной и той же емкости для проведения реакции. Как правило, амплификацию осуществляют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Создание таких праймеров очевидно для специалиста в данной области. Они должны включать по меньшей мере два олигонуклеотида, каждая из последовательностей которых обратно комплементарна или идентична сегменту длиной по меньшей мере 15 пар оснований нуклеотидных последовательностей, описанных в приложении (SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.100). Указанные праймерные олигонуклеотиды предпочтительно отличаются тем, что они не содержат никаких динуклеотидов CpG. В особенно предпочтительном варианте осуществления способа последовательность указанных праймерных олигонуклеотидов создают, чтобы выборочно отжигать и амплифицировать лишь интересующую ДНК, специфичную для клеток молочной железы, таким образом, минимизируя амплификацию фона или не относящейся к ней ДНК. В контексте настоящего изобретения под фоновой ДНК понимают геномную ДНК, которая не имеет паттерна метилирования, специфичного для соответствующей ткани, в данном случае соответствующая ткань представляет собой клетки молочной железы, как здоровые, так и патологически измененные.

По настоящему изобретению предпочтительно, чтобы в процессе амплификации по меньшей мере один праймерный олигонуклеотид связывался с твердой фазой. Различные последовательности олигонуклеотидов и/или PNA-олигомеров могут быть расположены на гладкой твердой фазе в виде прямоугольной или гексагональной решетки, причем поверхность твердой фазы предпочтительно состоит из силикона, стекла, полистирола, алюминия, стали, железа, меди, никеля, серебра или золота. Тем не менее, также возможно использование других материалов, таких как нитроцеллюлоза или пластмассы. Фрагменты, полученные путем амплификации, могут нести прямо или косвенно детектируемую метку. Предпочтительны метки в виде флуоресцентных меток, радионуклидов или отделяемых фрагментов молекул, имеющих типичную массу, которые могут быть детектированы в масс-спектрометре. Для лучшей возможности обнаружения в масс-спектрометре предпочтительно, чтобы получаемые фрагменты обладали единичным положительным или отрицательным суммарным зарядом. Детекция может быть осуществлена и визуализирована посредством лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии при участии матрицы (MALDI) или путем использования масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI).

На следующей стадии ампликоны нуклеиновой кислоты анализируют для определения статуса метилирования геномной ДНК до обработки.

Анализ нуклеиновой кислоты после обработки может быть осуществлен с использованием альтернативных способов. Некоторые способы анализа специфического статуса метилирования обработанных нуклеиновых кислот известны, другие альтернативные способы будут очевидны специалисту в данной области.

Используя некоторые способы, известные в данной области, анализ может быть осуществлен во время стадии амплификации способа. В одном из таких вариантов осуществления статус метилирования заранее выбранных позиций CpG в нуклеиновых кислотах, содержащих SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.100, может быть определен путем использования праймерных олигонуклеотидов, специфичных для метилирования. Эта техника описана в патенте США № 6265171.

1. Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы человека, включающий определение статуса геномного метилирования динуклеотидов CpG в каждой последовательности из группы последовательностей SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10, полученных из образцов человеческой ткани молочной железы, включающий введение одного или нескольких результатов теста на определение статуса метилирования в классификатор, который получают исходя из диагностической поливариативной модели, построенной на основе базы данных по молочной железе и группы последовательностей SEQ ID NO.1-10; расчет вероятности того, получен ли образец из нормальной ткани или ткани рака молочной железы; и расчет ассоциированной величины р для достоверности в прогнозе.

2. Способ по п.1, в котором указанная группа последовательностей дополнительно включает последовательности, выбранные из группы SEQ ID NO.50-SEQ ID NO.60, а классификатор получают исходя из диагностической поливариативной модели, построенной на основе базы данных по молочной железе и группы последовательностей SEQ ID NO.50-SEQ ID NO.60.

3. Способ по п.1 или 2, дополнительно включающий получение образца молочной железы от анализируемого человека.

4. Способ по п.1 или 2, в котором указанный классификатор представляет собой классификатор метода опорных векторов для изучения важных характеристик опухоли или нормального образца на основе предварительно определенного набора тканей, полученных от пациентов.

5. Способ по п.1 или 2, дополнительно включающий определение статуса геномного метилирования одного или более динуклеотидов CpG в одной или нескольких последовательностях ДНК, соответствующих SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.49 и SEQ ID NO.61-SEQ ID NO.100, а классификатор получают исходя из диагностической поливариативной модели, построенной на основе базы данных по молочной железе и группы последовательностей SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.49 и SEQ ID NO.61-SEQ ID NO.100.

6. Способ по п.1 или 2, в котором статус геномного метилирования определяют для последовательностей, соответствующих SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10 и SEQ ID NO.50-SEQ ID NO.60, а классификатор получают, исходя из диагностической поливариативной модели, построенной на основе базы данных по молочной железе и группы последовательностей SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10 и SEQ ID NO.50-SEQ ID NO.60.

7. Способ по п.1 или 2, в котором статус геномного метилирования определяют посредством одного или нескольких способов, выбранных из следующей группы:
а. бисульфитное секвенирование;
b. пиросеквенирование;
с. одноцепочечный конформационный анализ, чувствительный к метилированию (MS-SSCA);
d. анализ кривых плавления высокого разрешения (HRM);
е. однонуклеотидное удлинение праймеров, чувствительное к метилированию (MS-SnuPE);
f. нуклеотид-специфическое расщепление/MALDI-TOP;
g. ПЦР, специфичная к метилированию (MSP);
h. способы на основе микроматриц и
i. расщепление рестриктазой Msp I.

8. Способ по п.1 или 2, в котором определяемый рак молочной железы представляет собой первичный рак.

9. Матрица для улучшенной идентификации, диагностики, лечения и наблюдения клеточно-пролиферативных заболеваний молочной железы и/или определения предрасположенности к клеточно-пролиферативным заболеваниям молочной железы, где матрица содержит не более 100 различных молекул нуклеиновой кислоты и включает нуклеиновые кислоты с последовательностями, которые идентичны последовательностям ДНК, соответствующим SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии. .

Изобретение относится к генной диагностике офтальмологических расстройств и предназначено для диагностики аутосомно-доминантной оптической нейропатии. .

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу и набору для определения наличия или отсутствия мутации в гене PIK3CA. .

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для повышения биогенного продуцирования метана. .

Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для видоспецифичной экспресс-идентификации вируса Эбола-Заир методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченых зондов для видоспецифической экспресс-идентификации вируса Эбола-Судан методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно - к областям диагностической медицинской микробиологии, медицинской биохимии, прикладной иммунохимии и разработки диагностических тест-систем, касается разработки нового способа для высокочувствительного определения белка летального фактора сибирской язвы (LF) в инфицированных образцах биологического происхождения и окружающей среде.

Изобретение относится к области молекулярной биологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу оценки степени пролиферации лимфоцитов с помощью маркерных генов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР РВ)

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие геномы двух новых штаммов свиного цирковируса типа 2В. Эти два новых штамма свиного цирковируса можно использовать для получения вакцины или иммуногенной композиции для иммунизации свиней против синдрома послеотъемного мультисистемного истощения (PMWS). Изобретение может быть использовано в животноводстве для защиты свиней от цирковируса свиней типа 2В. 5 н. и 14 з.п. ф-лы, 6 ил., 11 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и химии. Предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, а также соответствующая кассета экспрессии, клетка-продуцент биосенсора и выделенный флуоресцентный биосенсор. Группа изобретений может быть использована для детекции пероксида водорода в живых клетках, обладающих увеличенным полупериодом восстановления. 5 н.п. ф-лы, 1 табл., 3 ил., 4 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к реагенту для предотвращения по меньшей мере одного ошибочного старта в амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР), способу предотвращения по меньшей мере одного ошибочного старта в амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР-амплификация) и наборам, которые включают данный реагент. Реагент используется при полимеразной цепной реакции (ПЦР), проводимой в присутствии 1,25 единиц термостабильной ДНК-полимеразы на 25 мкл реакционной смеси при концентрации не более 650 нМ. Реагент представляет собой не удлиняющийся ДНК-полимеразой олигонуклеотид, имеющий структуру ствол-петля, и не является гибридизационым зондом для указанного амплифицированного продукта ДНК. Ствол имеет длину более чем шесть нуклеотидов, стабилизирован на конце, отдаленном от петли, нефлуоресцентными веществами, выбранными из группы: гаситель флуоресценции и нуклеотидный аналог, позволяющими достичь более тесной связи между олигонуклеотидами в стволе, чем гибрид ДНК-ДНК. Температура плавления ствола (Tm) ниже 94°C. Петля представляет собой олигонуклеотидный и/или углеродный линкер. Предложенное изобретение позволяет предотвращать ошибочный старт (ненамеренный отжиг) в амплификациях и анализах с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 25 ил., 3 табл., 14 пр.
Изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к способу молекулярно-генетического типирования штаммов Bordetella pertussis. Способ включает выделение ДНК из штаммов B.pertussis, проведение полимеразной цепной реакции с одновременным введением специфических праймеров PF-PR для получения ампликонов фрагмента промотора коклюшного токсина ptxP, рестрикции полученных ампликонов эндонуклеазами KpnI и MluI и электрофорезу продуктов рестрикции в агарозном геле. Дифференциацию штаммов B.pertussis проводят путем сравнения размера ампликонов фрагментов ДНК промотора ptxP исследуемых штаммов B.pertussis с контрольными образцами ДНК штаммов B.pertussis. Изобретение может быть использовано для ускоренного выявления эпидемических штаммов с измененной генетической структурой при проведении микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга штаммов возбудителя коклюша и для дальнейшей разработки на их основе перспективных диагностических и профилактических препаратов. 1 пр.

Изобретение относится к области медицины. Предложен набор для многопрофильного иммунологического анализа антител в препаратах крови. Набор включает подложку, которая представляет собой пластину в виде гребня, на поверхности каждого зубца которого дискретно нанесены антигены возбудителей вирусных инфекций и положительный контроль в виде иммуноглобулинов человека, в качестве отрицательного контроля один из сегментов зубца подложки оставлен свободным от специфических белков для оценки фоновых явлений, причем подложка дополнительно блокирована неспецифическими природными или синтетическими полимерами. В состав набора также входит емкость для проведения анализа, выполненная в виде многоячеистой аналитической ванны с возможностью введения каждого зубца подложки в отдельную ячейку ванны, растворы для отмывок, разведения образца и конъюгата, конъюгат и систему проявления. Изобретение обеспечивает усовершенствованную тест-систему для диагностики инфекционных заболеваний, в том числе для оценки у детей гуморального иммунитета к вакциноуправляемым вирусным инфекциям: кори, краснухе, эпидемическому паротиту и полиомиелиту. 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 2 пр.

Изобретение раскрывает дифференциацию штаммов возбудителя чумы основного подвида античного и средневекового биоваров. Определение проводят методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Способ предусматривает выделение ДНК, проведение ПЦР с применением синтезированных праймеров Med(24) и Med(19) для амплификации фрагментов хромосомных генов исследуемого штамма. Дифференциацию осуществляют путем сравнения размеров полученных амплифицированных фрагментов исследуемого штамма с размерами фрагментов генов, характерных для штаммов средневекового биовара 198 и 82 п.н. и для штаммов античного биовара 222 и 101 п.н. Способ позволяет эффективно и надежно проводить дифференциацию штаммов Y.pestis основного подвида античного и средневекового биоваров. 2 пр.
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ мультиплексного ПЦР-анализа и набор для его осуществления. Способ включает использование неблокированных прямых и обратных праймеров и гомологичных им блокированных прямых и обратных праймеров. Выделяют ДНК из биологического или клинического материала. Проводят мультиплексную ПЦР с первыми 5-10 циклами амплификации в виде трехшаговой ПЦР и с последующими 25-35 циклами амплификации в виде двухшаговой ПЦР в буфере для постановки реакции, содержащем катионы калия (I) и катионы магния (II), на основе буферной системы с pH 7,0-7,5 при 40-85°C, включающей соль глутаминовой кислоты, трис(гидроксиметил)аминометан и ортофосфорную кислоту. Выбирают соотношение количества молекул неблокированных праймеров и количества молекул гомологичных им блокированных праймеров с некомплементарным участком из 1-8 нуклеотидов на 3'-конце, выбранных из ряда: некомплементарный первый нуклеотид, некомплементарный второй нуклеотид, некомплементарный третий нуклеотид, некомплементарный четвертый нуклеотид, некомплементарный пятый нуклеотид, некомплементарный шестой нуклеотид, некомплементарный седьмой нуклеотид, некомплементарный восьмой нуклеотид или их сочетания, составляющее от 2:1 до 4:1, при отсчете номера нуклеотида блокированного праймера с 3'-конца. Предложенное изобретение позволяет уменьшить продолжительность мультиплексной ПЦР без повышения концентрации Taq-полимеразы, при предотвращении получения ложных результатов, связанных с различиями концентраций нуклеотидных последовательностей-мишеней. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 3 пр.

Изобретение относится к способу скрининга веществ, способных влиять на процесс старения клетки путем использования нуклеосомных матриц. Способ включает в себя сборку нуклеосом из донорного хроматина с использованием очищенных препаратов гистонов Н2А, Н2В, Н3, Н4 натурального происхождения на ДНК-матрицах, где ДНК несет определенные мутации, ассоциированные с различными заболеваниями или со старением, активацию элонгации, внесение различных тестируемых агентов, способных стабилизировать или дестабилизировать компоненты матрицы, проведение транскрипции, оценку продуктов транскрипции. Для оценки продуктов или интермедиатов транскрипции возможно использование различных методов электрофоретического анализа, а также методы кристаллографии. Способность изменять активность транскрипции позволяет соответственно маркировать тестируемые вещества как влияющие на процесс старения. 12 з.п.ф-лы, 1 ил.
Изобретение относится к области биотехнологии. Тест-система для обнаружения РНК вируса блютанга 14-го серотипа путем проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени включает олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд, комплементарные участкам вариабельного 2-го сегмента, имеющие следующий нуклеотидный состав (5'-3'): 14/2/qf GCT GTC GGG TAT AGG TAG GA; 14/2/z FAM - GTG AAC GTG GGG TCA TCT TCA С - BHQ1; 14/2/qr ACG TGT CCG ATG CTG СТА TC. Данная тест-система обладает повышенной специфичностью и чувствительностью при сокращении времени проведения работы по определению серотипа вируса блютанга. 2 табл., 1 пр.
Наверх