Способ определения биологического ритма



Способ определения биологического ритма
Способ определения биологического ритма
Способ определения биологического ритма
Способ определения биологического ритма
Способ определения биологического ритма
Способ определения биологического ритма
Способ определения биологического ритма
Способ определения биологического ритма
Способ определения биологического ритма
Способ определения биологического ритма
Способ определения биологического ритма
Способ определения биологического ритма
Способ определения биологического ритма

 


Владельцы патента RU 2512069:

СОНИ КОРПОРЕЙШН (JP)

Изобретение относится к области хронобиологии. Способ определения циркадного цикла у субъекта на основе временных рядов данных по уровням экспрессии, полученных при измерении уровней экспрессии двух часовых генов в биологических образцах, которые берут у субъекта три раза в сутки. Причем часовые гены имеют разные фазы циркадного цикла изменений уровня экспрессии. Способ позволяет определить биологический ритм с большой точностью и сводит к минимуму количество раз взятия биологических образцов у субъекта. 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл., 3 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение имеет отношение к способу определения биологического ритма у субъекта. В частности, настоящее изобретение касается способа определения биологического ритма посредством взятия биологических образцов у субъекта всего лишь три раза в сутки.

Уровень техники

Известно, что различные биологические явления у живых организмов проявляют "периодический ритм", который совершает автономные колебания. Этот периодический ритм называется "биологическим ритмом". В частности, известно, что "циркадный ритм", период которого составляет около суток, в большой степени контролирует такие биологические явления, как цикл сна/бодрствования, температура тела, кровяное давление и суточные колебания секреции гормонов. Кроме того, циркадный ритм задействован в активности ума и тела, спортивных способностях и чувствительности к лекарственным препаратам.

Биологический ритм контролируется кластером генов, именуемых "часовыми генами". Часовые гены действуют в качестве "внутренних часов", самостоятельно вызывающих периодические колебания экспрессии, активности, локализации и т.д. часовых генов.

Очевидно, что генный полиморфизм и мутации часовых генов являются причиной возникновения рака, диабета, сосудистых заболеваний, нейродегенеративных и других заболеваний. Более того, недавно было высказано предположение, что генный полиморфизм и мутации часовых генов участвуют в возникновении таких психических заболеваний, как биполярный психоз и меланхолия.

С другой стороны, биологический ритм не только автономно контролируется внутренними часами, но и подвергается ограничениям из-за жизни в обществе. Например, в цикле сна/бодрствования могут быть отличия в ритме (фазовые отличия) между "циклом отхода ко сну/вставания в действительной жизни" и "запускаемым внутренними часами циклом сна/бодрствования" вследствие различий во времени регулярного отхода ко сну и времени вставания.

Считается, что отличия в биологическом ритме вызывают так называемый "синдром смены часовых поясов" и нарушения сна, а также вышеприведенные психические заболевания. Для лечения таких заболеваний предпринимаются попытки перенастроить аномальные внутренние часы с помощью облучения светом.

Более того, предпринимаются попытки довести до максимума действие лекарств с помощью биологического ритма. Полагают, что действие лекарств также подвержено суточным колебаниям из-за колебаний уровня экспрессии молекул (молекул-мишеней препарата), на которые воздействует препарат, и циркадного ритма ферментов (ферментов метаболизма препарата), метаболизирующих препарат. Поэтому была выдвинута концепция "ориентированной по времени медицинской помощи", которая стремится довести до максимума лечебное действие путем установки надлежащего времени введения для каждого препарата.

Кроме того, в более известных случаях, с использованием циркадного ритма активности ума и тела и спортивных способностей началось изучение такого периода активности, в который достигают максимума способности к обучению и тренировке, и такого времени приема внутрь, в которое с трудом происходит увеличение веса (или легко происходит увеличение веса).

В связи с вышесказанным полагаем, что точная оценка биологического ритма имеет положительное значение для улучшения такого плохого физического состояния, как синдром смены часовых поясов, предупреждения различных заболеваний, осуществления ориентированной по времени медицинской помощи, проявления своих способностей и похудания.

В PTL 1 раскрыт способ определения внутреннего времени организма на основе данных по измерению уровня продукта экспрессии гена в стандартном образце, взятом у живого индивидуума. В этом способе определения внутреннего времени организма составляется таблица молекулярных часов для оценки внутреннего времени организма на основе уровня экспрессии продукта экспрессии гена (т.е. мРНК).

Список цитируемых документов

PTL 1: International Publication No. 2004/012128.

Раскрытие изобретения

В PTL 1 не раскрыт конкретный ген мишени для измерения. Биологические ритмы обычно оценивают, используя часовой ген в качестве мишени для измерения на основе изменений уровня экспрессии часового гена во времени.

Однако для измерения изменений уровня экспрессии часового гена во времени необходимо постоянно брать биологические образцы у субъекта. То есть для оценки биологического ритма с большой точностью необходимо брать биологические образцы у субъекта на протяжении 24 часов с интервалом в несколько часов, чтобы получить временной ряд данных по уровню экспрессии часового гена.

Для субъекта (данного индивидуума) взятие биологических образцов по несколько раз в день таким образом очень обременительно. Более того, субъекта иногда будят среди ночи, чтобы взять биологический образец. Это влияет на цикл сна/бодрствования у субъекта, что может привести к изменению самого биологического ритма.

Полагаем, что нужно уменьшить нагрузку на организм субъекта при взятии биологических образцов для того, чтобы расширить пределы оценки биологического ритма, к примеру, с целью улучшения такого плохого физического состояния, как синдром смены часовых поясов и предупреждения различных заболеваний.

Соответственно, главной целью настоящего изобретения является получение способа, которым достигается определение биологического ритма с большой точностью и сводится к минимуму количество раз взятия биологических образцов у субъекта.

Для достижения вышеприведенной цели настоящим изобретением предусмотрен способ определения биологического ритма у субъекта на основе временных рядов данных по уровням экспрессии, полученных при измерении уровней экспрессии двух часовых генов в биологических образцах, взятых у субъекта три раза в сутки, причем часовые гены имеют разные фазы циркадного цикла изменений уровня экспрессии.

В частности, способ определения биологического ритма включает стадии:

(1) взятия биологических образцов у субъекта три раза за 24 часа;

(2) измерения уровней экспрессии двух часовых генов в биологических образцах, причем эти два часовых гена имеют разные фазы циркадного цикла изменений уровня экспрессии; и

(3) вычисления циркадных циклов из временных рядов данных по уровням экспрессии, полученных на стадиях (1) и (2).

При измерении двух часовых генов, имеющих разные фазы циркадного цикла изменений уровня экспрессии, взятие биологических образцов у субъекта может производиться всего лишь три раза в сутки.

На стадии (3) этого способа определения биологического ритма циркадные циклы рассчитывают из временных рядов данных по уровням экспрессии по приведенным ниже формулам (I) и (II):

В формуле (I): Ea(t), Aa, ω и Ca означают уровень экспрессии, амплитуду, начальную фазу и величину смещения одного из часовых генов в момент времени t. А в формуле (II): Eb(t), Ab, и Cb означают уровень экспрессии, амплитуду и величину смещения другого часового гена в момент времени t. Кроме того, θ означает разность фаз между двумя часовыми генами.

Этот способ определения биологического ритма предпочтительно включает вычисление данных моделирования из графика, полученного путем аппроксимации косинусом временного ряда данных по уровням экспрессии, причем данные моделирования отражают изменения уровня экспрессии через каждый час; вычисление выборочных данных по трем точкам из трех произвольных точек времени и уровней экспрессии в этих точках из данных моделирования по приведенным выше формулам (I) и (II); вычисление разницы по времени между данными моделирования и выборочными данными по трем точкам в те моменты, в которые уровни экспрессии достигают максимума; и вычисление трех точек времени, в которых среднее значение разницы по времени составляет менее 0,6, а стандартная ошибка разницы по времени составляет менее 0,4; и взятие биологических образцов три раза в сутки именно в эти три точки времени как точки взятия образцов. В частности, можно определить биологический ритм с большой точностью при взятии биологических образцов у субъекта три раза в сутки с интервалом в 8 часов.

В этом способе определения биологического ритма часовыми генами могут быть ген Per3 и ген Nr1d2.

В общем случае "фаза" означает такое количество, которое характеризует, за один период, положение и состояние точек типа пиков и провалов при периодическом изменении. Циркадный цикл изменений уровня экспрессии часового гена можно наблюдать в виде волновой функции косинуса, представленной формулой (III) ниже. При этом E(t) - уровень экспрессии часового гена в момент времени t, A - амплитуда уровня экспрессии, а C - величина смещения:

В настоящем изобретении "фаза" задается выражением внутри скобок косинуса в формуле (III), а именно: "2π(t+ω)/24" в формуле (III). Кроме того, "начальная фаза" есть "ω", определяющая фазу в момент времени t=0. А "разность фаз" означает разность начальных фаз ω между часовыми генами.

В соответствии с настоящим изобретением предусмотрен способ, которым достигается определение биологического ритма с большой точностью и сводится к минимуму количество раз взятия биологических образцов у субъекта.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлен график, полученный нанесением точек времени, в которых уровни экспрессии достигают максимума в циркадных циклах изменения уровней экспрессии гена Per3 и гена Nr1d2 (Пример 1). По оси X (горизонтальной оси) - время, за которое достигает максимума уровень экспрессии гена Per3, а по оси Y (вертикальной оси) - время, за которое достигает максимума уровень экспрессии гена Nr1d2. На фиг. пунктирной линией обозначено положение графика в том случае, когда разница по времени (разность фаз) между точками составляет 2 часа.

На фиг.2 представлен график, полученный нанесением разницы по времени в точках, в которых уровни экспрессии достигают максимума, между данными моделирования и циркадными циклами, рассчитанными по тем интервалам, в которых образцы брали три раза (пример 2). На фиг. по оси X (горизонтальной оси) -стандартная ошибка разницы по времени по интервалам взятия образцов, а по оси Y (вертикальной оси) - среднее значение.

На фиг.3 представлены графики циркадного цикла изменений уровня экспрессии Per3, рассчитанные при выполнении всех профилей взятия образцов по трем точкам интервала "8:08" (A) или интервала "9:15" (B) по данным моделирования (Пример 2). На фиг. цифрой 1 обозначен циркадный цикл Per3 по данным моделирования, а цифрой 2 обозначен циркадный цикл Nr1d2 по данным моделирования. Далее цифрой 3 обозначен циркадный цикл Per3 по данным взятия образцов по трем точкам, а цифрой 4 обозначен циркадный цикл Nr1d2 по данным взятия образцов по трем точкам.

На фиг.4 представлены графики циркадного цикла изменений уровня экспрессии гена Per3 и гена Nr1d2, рассчитанные при взятии образцов по трем точкам с интервалом в 8 часов (Пример 3). На фиг. символами a1, b1 и c1 соответственно обозначены циркадные циклы гена Per3 при взятии образцов по трем точкам профилей a, b и c, а символами a2, b2 и c2 соответственно обозначены циркадные циклы гена Nr1d2 при взятии образцов по трем точкам профилей a, b и c. Далее символами d1 и d2 обозначены циркадные циклы гена Per3 и гена Nr1d2, полученные при взятии образцов по семи точкам.

Осуществление изобретения

1. Способ определения биологического ритма

Авторы настоящего изобретения посчитали, что количество раз, когда у субъекта берутся биологические образцы, можно сократить путем определения биологического ритма по различиям в циклах изменений уровня экспрессии между несколькими часовыми генами, и рассмотрели это предположение. Затем авторы изобретения обнаружили, что биологический ритм можно определить с большой точностью путем измерения двух часовых генов с различными фазами циркадного цикла изменений уровня экспрессии при взятии биологических образцов у субъекта всего лишь три раза в сутки. То есть в способе определения биологического ритма по настоящему изобретению измеряются уровни экспрессии двух часовых генов с различными фазами циркадного цикла изменений уровня экспрессии для биологических образцов, взятых у субъекта три раза в сутки, а биологический ритм субъекта прогнозируется на основе полученного временного ряда данных по уровням экспрессии.

Если два часовых гена a и b имеют различные фазы циркадного цикла изменений уровня экспрессии и разность фаз равняется "0", то циркадные циклы изменения уровней экспрессии часовых генов можно смоделировать с помощью приведенных ниже формул косинусных графиков (I) и (II):

При этом в формуле (I): Ea(t), Aa, ω и Ca означают уровень экспрессии, амплитуду, начальную фазу и величину смещения часового гена а в момент времени t. А в формуле (II): Eb(t), Ab, и Cb означают уровень экспрессии, амплитуду и величину смещения часового гена b в момент времени t.

В том случае, когда известна разность фаз θ между двумя часовыми генами a и b, формулы косинусных графиков (I) и (II) включают 5 неизвестных констант (ω, Aa, Ab, Ca и Cb). Измеряя уровни экспрессии Ea(t) и Eb(t) часовых генов a и b в биологических образцах, взятых у субъекта в момент времени t, по формулам косинусных графиков (I) и (II) можно получить 2 уравнения. Следовательно, на этой модели, получая 6 уравнений по формулам косинусных графиков (I) и (II) при взятии (отборе) биологических образцов в три разных момента времени t, можно рассчитать циркадные циклы изменений уровней экспрессии часовых генов a и b.

Математически для нахождения 5 неизвестных требуется 5 уравнений. В настоящем изобретении, при моделировании циркадных циклов изменений уровней экспрессии часовых генов a и b с известной разностью фаз θ между ними по приведенным выше формулам косинусных графиков (I) и (II), рассчитывают 5 неизвестных на основе 6 уравнений. А именно, принимая разность фаз θ между часовыми генами a и b в качестве ограничивающего условия, можно более точно рассчитать неизвестные ω, Aa, Ab, Ca и Cb. Таким образом, с большой точностью можно рассчитать циркадный цикл уровня экспрессии часового гена, что является биологическим явлением, точная оценка которого обычно проводится с трудом.

Более конкретно, способ определения биологического ритма включает стадии: (1) взятия биологических образцов у субъекта три раза в сутки; (2) измерения уровней экспрессии двух часовых генов в биологических образцах, причем эти два часовых гена имеют разные фазы циркадного цикла изменений уровня экспрессии; и (3) вычисления циркадных циклов изменений уровней экспрессии часовых генов из временных рядов данных по уровням экспрессии, полученных на предыдущих стадиях.

В способе определения биологического ритма по настоящему изобретению примеры субъектов в широком смысле включают, наряду с человеком, и таких лабораторных животных, как мыши, крысы и обезьяны.

2. Взятие биологических образцов

Биологические образцы, взятые у субъекта, не имеют особых ограничений, если только они представляет собой биологическую ткань, содержащую продукт экспрессии (мРНК) часового гена. В отношении легкости взятия образцов предпочтительно берут биологическую ткань из поверхности тела, как то волосы, слизистые ротовой полости или кожу.

Волосы можно брать путем вырывания с корнем. Корни вырванных волос содержат клетки волосяной сумки, и в них можно измерить мРНК часовых генов. При этом "клетки волосяной сумки" представляют собой группу клеток, которые образуют внутреннюю оболочку корней, внешнюю оболочку корней и сосочки, прилегающие к корням вырванных из тела волос.

Например, в том случае, когда субъектом является человек, место взятия волос не имеет ограничений, и можно использовать волосы из головы, бороды, ног или рук и т.п. Чтобы уменьшить разброс при измерении, предпочтительно каждый раз берут образцы из участков, близких друг к другу.

В случае человека приблизительное количество волос, отбираемых за один раз, составляет от 5 до 10 для волос головы, от 3 до 5 для бороды и от 10 до 20 для волос рук. Используя количество волос, большее или равное вышеприведенному количеству волос, можно экстрагировать достаточное количество мРНК для количественного определения уровней экспрессии часовых генов.

Образцы из слизистых ротовой полости можно получить путем соскабливания из поверхности ротовой полости, к примеру, с помощью щеточки или шпателя. При этом можно измерить мРНК часовых генов в соскобленных клетках слизистых оболочек ротовой полости.

Образцы слизистых оболочек ротовой полости предпочтительно получают из слизистых оболочек, находящихся на внутренней выстилке щеки. Чтобы уменьшить разброс при измерении, образцы слизистых оболочек ротовой полости предпочтительно берут из слизистых оболочек и левой, и правой щеки.

Авторы настоящего изобретения исследовали, какой промежуток времени между взятием образцов при трехкратном взятии образцов дает очень точное определение биологического ритма. В результате этого они обнаружили, что большая точность достигается при взятии биологических образцов у субъекта три раза в сутки с интервалом в 8 часов (см. Пример 2).

Иными словами, в способе определения биологического ритма по настоящему изобретению можно определить биологический ритм с наибольшей точностью при трехкратном взятии образцов с тем, что промежуток времени между взятием первого и второго образца и промежуток времени между взятием второго и третьего образца одновременно составляет 8 часов.

3. Измерение уровня экспрессии

Уровень экспрессии часового гена в биологическом образце можно измерить общеизвестным способом. Например, из биологического образца экстрагируют ДНК с помощью коммерчески доступного набора для выделения РНК и синтезируют кДНК по реакции обратной транскрипции, используя в качестве матрицы выделенную РНК. Затем количественно определяют уровень экспрессии с использованием кДНК при помощи комплексного аналитического метода типа ДНК-микроматрицы (ДНК-чипа) либо индивидуального аналитического метода типа ПЦР в реальном времени.

Подлежащие измерению часовые гены могут представлять собой группу часовых генов, идентифицированных к настоящему времени. Репрезентативные примеры часовых генов включают ген Per3 (номер доступа в NCBI NM_016831), ген Per2 (NM_022817), ген Bmal1 (NM_001030272), ген Npas2 (NM_002518), ген Nr1d2 (NM_02174), ген Nr1d2 (NM_005126), ген Dbp (NM_001352) и ген Cry1 (NM_004075).

В способе определения биологического ритма по настоящему изобретению измеряются уровни экспрессии двух из этих часовых генов для получения временных рядов данных по уровням экспрессии, причем эти два гена имеют разные фазы суточных колебаний уровней экспрессии. При этом в случае, когда субъектом является не человек, а другие организмы, измеряются уровни экспрессии гомологов (гомологичных генов) вышеприведенных часовых генов человека у данных организмов.

Комбинацию из двух часовых генов можно выбрать свободно, если только они имеют разные фазы суточных колебаний уровней экспрессии. Фазы суточных колебаний уровней экспрессии двух свободно выбранных часовых генов можно определить, к примеру, методом, описанным ниже в примере 1.

В качестве предпочтительной комбинации двух часовых генов можно использовать ген Per3 и ген Nr1d2. Ген Per3 и ген Nr1d2 устойчиво экспрессируются в биологических образцах и проявляют большие суточные колебания (амплитуды) уровней экспрессии. Таким образом, биологический ритм можно точно определить путем вычисления циркадных циклов изменения уровней экспрессии гена Per3 и гена Nr1d2 из этих временных рядов данных по уровням экспрессии.

4. Вычисление циркадного цикла

Циркадные циклы изменения уровней экспрессии часовых генов рассчитывают по приведенным ниже формулам (I) и (II) из временных рядов данных по уровням экспрессии, показывающих изменения уровней экспрессии генов во времени:

При этом в формуле (I): Ea(t), Aa, ω и Ca означают уровень экспрессии, амплитуду, начальную фазу и величину смещения часового гена а в момент времени t. А в формуле (II): Eb(t), Ab, и Cb означают уровень экспрессии, амплитуду и величину смещения часового гена b в момент времени t. Кроме того, θ означает разность фаз между двумя часовыми генами.

По вышеприведенным формулам (I) и (II) можно получить 6 уравнений из временных рядов данных по уровням экспрессии двух часовых генов при трехкратном взятии образцов. Из этих 6 уравнений получают 5 неизвестных ω, Aa, Ab, Ca и Cb методом сопряженных градиентов или др. Таким образом можно рассчитать циркадные циклы изменения уровней экспрессии часовых генов, причем циркадные циклы будут отражать биологический ритм субъекта.

Как описано выше, в способе определения биологического ритма по настоящему изобретению измеряются уровни экспрессии двух часовых генов с разными фазами циркадного цикла изменений уровня экспрессии при взятии образцов по трем точкам, при этом с большой точностью можно рассчитать циркадные циклы изменения уровней экспрессии и тем самым определить биологический ритм субъекта.

Устанавливая, что взятие биологических образцов у субъекта производится всего лишь три раза в сутки, можно уменьшить нагрузку на организм субъекта при взятии биологических образцов. Более того, при взятии образцов по трем точкам с интервалом в 8 часов можно брать образцы только в тот период времени, когда субъект бодрствует. Таким образом, можно точно определить биологический ритм без ущерба для цикла сна/бодрствования у субъекта.

Пример 1. Определение разности фаз между геном Per3 и геном Nr1d2

В этом примере выбрали ген Per3 (в дальнейшем просто "Per3") и ген Nr1d2 (в дальнейшем просто "Nr1d2") в качестве двух часовых генов с разными фазами циркадного цикла изменений уровня экспрессии и определяли разность фаз между циркадными циклами изменения уровней экспрессии этих генов.

Брали волосы из головы у 15 мужчин и женщин в возрасте от 20 до 50 лет. Корни волос, включая прикрепленные к ним клетки волосяной сумки, быстро погружали в буфер для лизиса клеток (набор RNEasy Microkit: QIAGEN) для получения раствора лизата клеток. Волосы брали с интервалом в 3-4 часа, а за каждый раз отбирали 5-20 волос.

Из раствора лизата клеток, хранившегося при -70°C, экстрагировали общую РНК в соответствии с методикой, приложенной к буферу для лизиса клеток, и проводили реакцию обратной транскрипции. Для количественного определения уровней экспрессии Per3 и Nr1d2 проводили ПЦР в реальном времени, используя продукт обратной транскрипции в количестве 1/20 этого продукта. ПЦР в реальном времени проводили на приборе PRISM 7300 (ABI) с помощью зонда SYBR Green (ABI) или TaqMan MGB (ABI). Уровни экспрессии Per3 и Nr1d2 подвергали коррекции по уровню экспрессии 18S-pPHK, служившей внутренним стандартом, получая временные ряды данных по уровням экспрессии.

Строили графики по полученным временным рядам данных по уровням экспрессии с аппроксимацией по приведенной ниже формуле косинуса (IV) с периодом в 24 часа нелинейным методом наименьших квадратов, получая разность фаз между циркадными циклами изменения уровней экспрессии Per3 и Nr1d2:

где E(t) - уровень экспрессии в момент времени t, A - амплитуда уровня экспрессии, ω - начальная фаза, а C - величина смещения.

Результаты представлены на фиг.1. График получен при нанесении моментов времени t, в которые уровень экспрессии E(t) достигал максимума на графике после аппроксимации по формуле косинуса (IV). Моменты времени t, в которые достигал максимума уровень экспрессии E(t) гена Per3, наносили по оси X, а моменты времени t, в которые достигал максимума уровень экспрессии E(t) гена Nr1d2, наносили по оси Y.

Как видно из фиг.1, у 15 субъектов момент времени t, в который достигал максимума уровень экспрессии E(t) гена Per3, имел широкий разброс от 0 до 12. Точно так же момент времени t, в который достигал максимума уровень экспрессии E(t) гена Nr1d2, имел широкий разброс от 0 до 12.

Однако разница по времени (разность фаз) между моментом времени t, в который достигал максимума уровень экспрессии E(t) гена Per3, и моментом времени t, в который достигал максимума уровень экспрессии E(t) гена Nr1d2, составляла примерно 2 часа для каждого из субъектов. На фиг.1 пунктирной линией представлено положение графика в том случае, когда разность фаз между Per3 и Nr1d2 составляет 2 часа.

Среднее значение и стандартное отклонение разности фаз между Per3 и Nr1d2 по 15 субъектам равнялись 2,3 и 0,8, соответственно. По этой разности фаз (в дальнейшем "разность фаз θ") проводили моделирование циркадных циклов изменения уровней экспрессии Per3 и Nr1d2 по приведенным ниже формулам функции косинуса (V) и (VI) соответственно:

где EPer3(t) - уровень экспрессии Per3 в момент времени t, APer3 - амплитуда уровня экспрессии, ω - начальная фаза Per3, а CPer3 - величина смещения;

где ENr1d2(t) - уровень экспрессии Nr1d2 в момент времени t, ANr1d2 - амплитуда уровня экспрессии, θ - разность фаз между циркадными циклами изменения уровней экспрессии Per3 и Nr1d2, a CNr1d2 - величина смещения.

Пример 2. Изучение интервала между взятием образцов

При использовании вышеприведенных формул графиков косинуса (V) и (VI) можно рассчитать циркадные циклы изменений уровня экспрессии Per3 или Nr1d2 при взятии образцов по меньшей мере три раза и таким образом оценить биологический ритм субъекта. Так, в данном примере, определяли интервал времени между трехкратным взятием образцов с тем, чтобы с наибольшей точностью оценить биологический ритм. Принимая, что взятие образцов проводится три раза в сутки, исследовали все возможные интервалы между взятием образцов (276 профилей).

Сначала рассчитывали почасовые изменения уровней экспрессии двух генов по формуле косинуса (IV), приведенной в примере 1, и проводили аппроксимацию графиков по временным рядам данных по уровням экспрессии Per3 и Nr1d2. Затем отбирали три произвольные точки времени t и уровни экспрессии V(t) в этих точках в качестве данных из образцов по трем точкам из расчетных данных моделирования, представляющих почасовые изменения уровней экспрессии.

Эти три произвольные точки времени t и уровни экспрессии V(t) в этих точках подставляли в формулы (V) и (VI) и получали амплитуды уровней экспрессии APer3 и ANr1d2, начальную фазу ω гена Per3 и величины смещения CPer3 и CNr1d2 методом сопряженных градиентов.

Метод сопряженных градиентов выполняли по приведенной ниже методике. А именно, сначала определяли сумму квадратов d из подставленных в формулы (V) и (VI) уровней экспрессии V(t) и уровней экспрессии E(t) из данных моделирования, представляющих почасовые изменения уровней экспрессии, как расстояние между данными при взятии образцов по трем точкам и данными моделирования по приведенной ниже формуле (VII):

Затем методом сопряженных градиентов получали амплитуды APer3 и ANr1d2; начальную фазу ω и величины смещения CPer3 и CNr1d2, сводящие к минимуму расстояние d. Отметим, что в том случае, когда применялся нелинейный метод наименьших квадратов, эти неизвестные константы было невозможно получить, так как расстояние d не сходилось к минимальному значению.

При этом, когда применяется метод сопряженных градиентов, начальные значения неизвестных констант существенно влияют на получаемые константы. Так, если выбраны неправильные начальные значения, то расстояние d сходится к локальному экстремуму и поэтому невозможно получить правильные циркадные циклы.

Поэтому в таком случае в качестве правильных начальных значений амплитуд APer3 и ANr1d2 принимали среднее значение амплитуды A из данных моделирования, представляющих почасовые изменения уровней экспрессии. Кроме того, в качестве начальных значений величин смещения CPer3 и CNr1d2 принимали среднее значение из данных при взятии образцов по трем точкам. Отметим, что в отношении амплитуды A по данным моделирования амплитуда APer3 гена Per3 составила 0,8014513, а амплитуда ANr1d2 гена Nr1d2 составила 0,6402411.

Кроме того, начальную фазу ω гена Per3 ограничивали целыми числами от 0 до 23, чтобы облегчить операционный анализ. Затем получали начальную фазу ω, обеспечивающую минимальное расстояние d, задавая по одному целые числа от 0 до 23 в качестве начальных значений и применяя метод сопряженных градиентов.

Как описано выше, получали разницу по времени между моментом времени t, в который достигал максимума уровень экспрессии V(t) по формуле (V), по которой определяли амплитуду APer3 уровня экспрессии, начальную фазу ω гена Per3 и величину смещения CPer3, и моментом времени, в который достигал максимума уровень экспрессии V(t) по данным моделирования. Затем исследовали интервал между взятием образцов с тем, чтобы свести к минимуму разницу по времени.

В качестве первого времени взятия образцов принимали все времена через каждый час от 0 до 23. Затем исследовали комбинации (276 профилей) промежутков времени между тремя моментами взятия образцов с тем, чтобы второе и третье взятие образцов завершались в пределах 24 часов от первого. В отношении комбинаций из всех промежутков времени получали среднее значение и стандартную ошибку разницы по времени. Стандартная ошибка показывает, насколько циркадный цикл, рассчитанный при данном интервале взятия образцов, зависит от первого времени взятия образцов. А среднее значение показывает точность рассчитанного циркадного цикла. Таким образом, можно сказать, что рассчитанный циркадный цикл становится более точным по мере уменьшения стандартной ошибки и среднего значения.

В таблицах 1-5 представлены средние значения и стандартные ошибки, полученные в отношении комбинаций из всех интервалов. Комбинации всех интервалов времени в таблицах 1-5 приведены в порядке уменьшения стандартной ошибки и среднего значения интервалов. Интервалы представлены путем сочетания промежутка времени между первым и вторым взятием образцов и промежутка времени между вторым и третьим взятием образцов. Например, "13:06" на фиг. означает, что интервал между первым и вторым взятием образцов составляет 13 часов, а интервал между вторым и третьим взятием образцов составляет 6 часов.

Кроме того, на фиг.2 представлен график, на котором каждая из комбинаций интервалов нанесена таким образом, что стандартная ошибка приводится по оси X, а среднее значение - по оси Y.

Таблица 1
Интервал Станд. ошибка Среднее Интервал Станд. ошибка Среднее Интервал Станд. ошибка Среднее
8:08 0,000 0,127 5:10 0,045 0,130 13:05 0,057 0,134
7:09 0,017 0,129 9:10 0,045 0,130 5:06 0,057 0,134
9:08 0,017 0,129 10:05 0,045 0,128 4:10 0,062 0,131
8:07 0,017 0,129 5:09 0,045 0,128 10:10 0,062 0,132
9:07 0,017 0,127 10:09 0,045 0,130 10:04 0,062 0,131
7:08 0,017 0,127 9:05 0,045 0,129 9:04 0,062 0,131
8:09 0,017 0,127 6:12 0,046 0,129 4:11 0,062 0,131
7:07 0,026 0,129 6:06 0,046 0,129 11:09 0,062 0,132
7:10 0,026 0,129 12:06 0,046 0,129 4:09 0,063 0,132
10:07 0,026 0,129 5:11 0,047 0,129 9:11 0,063 0,131
9:06 0,030 0,128 11:08 0,047 0,128 11:04 0,063 0,133
6:09 0,030 0,129 8:05 0,047 0,128 12:08 0,064 0,134
9:09 0,030 0,127 11:05 0,048 0,128 4:12 0,064 0,132
6:08 0,032 0,127 8:11 0,048 0,129 8:04 0,065 0,133
10:06 0,032 0,127 5:08 0,048 0,130 8:12 0,065 0,133
8:10 0,032 0,127 7:12 0,051 0,131 4:08 0,065 0,132
8:06 0,032 0,127 12:05 0,051 0,130 12:04 0,065 0,132
6:10 0,032 .0,127 5:07 0,051 0,131 5:05 0,066 0,132
10:08 0,032 0,128 5:12 0,051 0,131 14:05 0,066 0,133
11:07 0,037 0,129 12:07 0,051 0,130 5:14 0,066 0,133
6:11 0,037 0,129 7:05 0,051 0,130 13:04 0,067 0,134
7:06 0,038 0,129 5:13 0,057 0,131 7:13 0,067 0,133
11:06 0,038 0,129 13:06 0,057 0,130 4:07 0,067 0,132
7:11 0,038 0,129 6:05 0,057 0,131 4:13 0,068 0,133
6:07 0,038 0,129 6:13 0,057 0,134 7:04 0,068 0,132
Таблица 2
Интервал Станд. ошибка Среднее Интервал Станд. ошибка Среднее Интервал Станд. ошибка Среднее
13:07 0,068 0,133 13:03 0,084 0,136 16:03 0,094 0,141
6:14 0,071 0,133 8:13 0,084 0,135 5:16 0,094 0,142
14:04 0,071 0,133 3:08 0,084 0,135 3:16 0,097 0,142
4:06 0,071 0,133 13:08 0,084 0,135 16:05 0,098 0,139
6:04 0,072 0,133 3:13 0,085 0,137 5:03 0,098 0,139
4:14 0,072 0,133 8:03 0,085 0,137 4:17 0,100 0,139
14:06 0,072 0,133 7:14 0,085 0,137 3:04 0,100 0,143
4:05 0,077 0,134 14:03 0,085 0,139 17:03 0,100 0,143
5:15 0,077 0,134 3:07 0,085 0,139 3:03 0,105 0,146
15:04 0,077 0,134 3:14 0,086 0,139 18:03 0,105 0,146
5:04 0,077 0,134 14:07 0,086 0,136 3:18 0,105 0,145
15:05 0,077 0,136 7:03 0,086 0,136 17:05 0,106 0,142
4:15 0,077 0,135 4:16 0,087 0,136 16:06 0,106 0,143
10:11 0,082 0,135 4:04 0,087 0,137 6:02 0,106 0,143
3:10 0,082 0,135 16:04 0,087 0,137 2:16 0,107 0,145
11:03 0,082 0,135 3:15 0,088 0,137 5:02 0,107 0,144
3:11 0,083 0,137 15:06 0,088 0,137 2:17 0,107 0,145
11:10 0,083 0,135 6:03 0,088 0,137 4:02 0,108 0,140
10:03 0,083 0,136 6:15 0,089 0,138 2:18 0,108 0,140
9:12 0,083 0,135 15:03 0,089 0,136 2:01 0,108 0,141
3:09 0,083 0,137 3:06 0,089 0,140 18:04 0,109 0,142
12:03 0,083 0,137 17:04 0,091 0,139 1:20 0,109 0,143
12:09 0,084 0,138 4:03 0,092 0,136 3:01 0,109 0,143
3:12 0,084 0,136 3:17 0,092 0,136 20:03 0,110 0,143
9:03 0,084 0,136 3:05 0,094 0,141 2:03 0,110 0,143
Таблица 3
Интервал Станд. ошибка Среднее Интервал Станд. ошибка Среднее Интервал Станд. ошибка Среднее
3:19 0,110 0,143 20:02 0,136 0,165 1:14 0,160 0,167
19:02 0,111 0,142 8:02 0,136 0,171 15:02 0,160 0,170
2:04 0,111 0,143 2:05 0,136 0,170 7:15 0,162 0,170
18:02 0,111 0,143 10:12 0,138 0,171 2:07 0,162 0,169
4:18 0,112 0,143 2:10 0,139 0,167 21:02 0,162 0,166
18:05 0,113 0,141 12:02 0,139 0,168 22:01 0,165 0,166
1:18 0,113 0,141 7:02 0,140 0,162 15:08 0,165 0,162
5:01 0,114 0,141 2:15 0,141 0,166 1:15 0,165 0,163
2:19 0,114 0,142 15:07 0,142 0,168 8:01 0,170 0,176
3:02 0,114 0,142 7:01 0,144 0,170 6:17 0,171 0,179
19:03 0,116 0,144 16:07 0,144 0,165 1:06 0,171 0,181
2:11 0,116 0,146 1:16 0,145 0,167 17:01 0,172 0,175
11:02 0,116 0,146 2:12 0,147 0,168 21:01 0,173 0,182
11:11 0,118 0,145 12:10 0,148 0,168 8:15 0,173 0,179
1:21 0,118 0,144 10:02 0,148 0,166 15:01 0,176 0,175
16:02 0,119 0,147 2:14 0,151 0,174 1:08 0,177 0,169
2:06 0,122 0,148 14:08 0,151 0,175 6:01 0,177 0,170
6:16 0,122 0,148 13:09 0,151 0,176 17:06 0,179 0,175
17:02 0,122 0,145 2:13 0,153 0,167 1:17 0,180 0,179
5:17 0,126 0,146 9:13 0,154 0,165 1:22 0,180 0,181
2:20 0,126 0,146 2:09 0,154 0,166 1:01 0,183 0,176
14:02 0,127 0,147 13:02 0,157 0,175 20:01 0,183 0,172
2:08 0,130 0,151 9:02 0,157 0,176 3:20 0,184 0,172
8:14 0,130 0,152 9:01 0,157 0,171 1:03 0,187 0,172
2:02 0,130 0,152 14:09 0,160 0,166 18:01 0,188 0,179
Таблица 4
Интервал Станд. ошибка Среднее Интервал Станд. ошибка Среднее
1:05 0,188 0,178 1:02 0,209 0,187
5:18 0,191 0,176 1:19 0,210 0,189
19:01 0,191 0,173 19:04 0,213 0,184
4:19 0,192 0,171 4:01 0,213 0,185
1:13 0,195 0,188 1:04 0,215 0,179
10:01 0,195 0,186 13:01 0,288 0,328
2:21 0,196 0,194 1:10 0,289 0,327
13:10 0,199 0,176 10:13 0,290 0,331
1:09 0,200 0,175 1:12 0,321 0,445
14:01 0,200 0,172 11:01 0,322 0,444
9:14 0,203 0,179 12:11 0,323 0,443
16:01 0,203 0,180 1:11 0,355 0,515
1:07 0,204 0,180 12:01 0,355 0,516
7:16 0,208 0,181 11:12 0,356 0,514
Таблица 5
Интервал Станд. ошибка Среднее Интервал Станд. ошибка Среднее
9:15 3,27 12,78 3:21 4,20 22,66
8:16 3,47 14,57 21:03 4,26 22,89
23:01 3,55 15,25 19:05 4,31 23,21
16:08 3,64 15,82 13:11 4,38 24,09
2:22 3,75 17,57 15:09 4,48 25,25
22:02 3,82 17,96 7:17 4,57 26,00
1:23 3,87 18,17 17:07 4,65 26,59
6:18 3,92 18,96 5:19 4,77 30,21
14:10 3,98 19,57 4:20 4,87 29,47
20:04 4,03 20,02 10:14 5,08 32,81
12:12 4,08 21,25 18:06 5,40 38,23
11:13 4,15 21,23

Как видно из таблиц 1-5 и фиг.2, стандартная ошибка и среднее значение достигают минимума в интервале "8:08". Из этого ясно, что циркадный цикл может быть рассчитан с большой точностью при трехкратном взятии образцов с тем, что интервал между первым и вторым взятием образцов и интервал между вторым и третьим взятием образцов одновременно составляет 8 часов.

Кроме того, стандартная ошибка и среднее значение являются достаточно низкими в комбинациях интервалов, приведенных в таблицах 1-4. Полагаем, что при использовании этих интервалов взятия образцов можно рассчитать правильные циркадные циклы. С другой стороны, оказалось, что комбинации интервалов, приведенные в таблице 5, не подходят, так как стандартная ошибка и среднее значение являются высокими.

На фиг.3 представлен циркадный цикл изменений уровня экспрессии Per3, рассчитанный при выполнении всех профилей взятия образцов по трем точкам для интервала "8:08" (А) или интервала "9:15" (В) по данным моделирования. На фиг. цифрой 1 обозначен циркадный цикл Per3 по данным моделирования, а цифрой 2 обозначен циркадный цикл Nr1d2 по данным моделирования. Далее цифрой 3 обозначен циркадный цикл Per3 по данным взятия образцов по трем точкам, а цифрой 4 обозначен циркадный цикл Nr1d2 по данным взятия образцов по трем точкам.

Как видно из фиг.3(А), в том случае, когда интервал между первым и вторым взятием образцов и интервал между вторым и третьим взятием образцов одновременно составляет 8 часов, циркадные циклы Per3 и Nr1d2 по данным моделирования и по данным взятия образцов по трем точкам хорошо согласуются друг с другом, что означает, что циркадные циклы могут быть рассчитаны с большой точностью.

С другой стороны, в том случае, когда интервал между первым и вторым взятием образцов составляет 9 часов, а интервал между вторым и третьим взятием образцов составляет 15 часов, циркадные циклы Per3 и Nr1d2 по данным моделирования и по данным взятия образцов по трем точкам не согласуются друг с другом, что означает, что циркадные циклы невозможно рассчитать.

Пример 3. Оценка биологического ритма при взятии образцов по трем точкам

Из приведенных в Примере 2 результатов оказалось, что циркадный цикл можно рассчитать с большой точностью при взятии образцов три раза с интервалом в 8 часов. Поэтому была сделана попытка определить биологический ритм при фактическом выполнении взятия образцов по трем точкам с интервалом в 8 часов. Взятие образцов по трем точкам проводили по трем профилям, приведенным ниже в таблице 6.

Таблица 6
Время взятия образцов
Первый раз Второй раз Третий раз
По трем точкам a 12:00 20:00 28:00
По трем точкам b 16:00 24:00 32:00
По трем точкам с 20:00 28:00 36:00

При взятии образцов по трем точкам профилей a-c в каждый момент времени количественно определяли уровни экспрессии Per3 и Nr1d2 методом, описанным в Примере 1. Затем по той же методике, что описана в Примере 2, в формулы (V) и (VI) подставляли три точки времени t и уровни экспрессии E(t) в этих точках и получали амплитуды APer3 и ANr1d2 уровней экспрессии, начальную фазу ω гена Per3 и величины смещения CPer3 и CNr1d2 методом сопряженных градиентов. Таким образом рассчитывали циркадные циклы изменения уровней экспрессии Per3 и Nr1d2.

Результаты представлены на фиг.4. На фиг. символами a1, b1 и c1 соответственно обозначены циркадные циклы гена Per3 при взятии образцов по трем точкам профилей a, b и c, а символами a2, b2 и c2 соответственно обозначены циркадные циклы гена Nr1d2 при взятии образцов по трем точкам профилей a, b и c. Далее символами d1 и d2 обозначены циркадные циклы, полученные при аппроксимации по приведенной выше формуле косинуса (IV) нелинейным методом наименьших квадратов временных рядов данных по уровням экспрессии, полученных при взятии образцов семь раз с 12:00 до 36:00. Символом d1 обозначен циркадный цикл Per3, а символом d2 обозначен циркадный цикл Nr1d2.

Как видно из фиг.4, при взятии образцов по трем точкам профилей a-c циркадные циклы изменения уровней экспрессии Per3 и Nr1d2 были рассчитаны с высокой воспроизводимостью. Ошибка по фазе между циркадными циклами изменения уровней экспрессии Per3 и Nr1d2 при взятии образцов по трем точкам профилей a-c и циркадными циклами (см. символы d1 и d2 на фиг.) при взятии образцов семь раз составила в среднем 0,75 часов.

Как видно из этого результата, при взятии образцов по трем точкам в отношении уровней экспрессии генов Per3 и Nr1d2 с разными фазами циркадного цикла изменений уровня экспрессии оказалось, что были рассчитаны циркадные циклы изменения уровней экспрессии, по которым с большой точностью можно определить биологический ритм субъекта.

Промышленная применимость

Способ определения биологического ритма по настоящему изобретению может применяться для осуществления медицинской службы времени, проявления своих способностей и похудания. Более того, способ может применяться для предупреждения различных заболеваний, вызванных смещением биологического ритма, и для улучшения такого плохого физического состояния, как синдром смены часовых поясов.

1. Способ определения циркадного цикла у субъекта на основе временных рядов данных по уровням экспрессии, полученных при измерении уровней экспрессии двух часовых генов в биологических образцах, взятых у субъекта три раза в сутки, причем часовые гены имеют разные фазы циркадного цикла изменений уровня экспрессии, включающий:
(1) стадию взятия биологических образцов у субъекта три раза в сутки;
(2) стадию измерения уровней экспрессии двух часовых генов в биологических образцах, причем эти два часовых гена имеют разные фазы циркадных циклов изменения уровней экспрессии; и
(3) стадию вычисления циркадных циклов из временных рядов данных по уровням экспрессии, полученных на стадиях (1) и (2), в котором на стадии (3) циркадные циклы рассчитывают из временных рядов данных по уровням экспрессии по приведенным ниже формулам (I) и (II):

где в формуле (I): Ea(t), Aa, ω и Ca означают уровень экспрессии, амплитуду, начальную фазу и величину смещения одного из часовых генов в момент времени t; в формуле (II): Eb(t), Ab, и Cb означают уровень экспрессии, амплитуду и величину смещения другого часового гена в момент времени t; а θ означает разность фаз между двумя часовыми генами,
где интервал между взятием образцов выбран из:
8:08, 7:09, 9:08, 8:07, 9:07, 7:08, 8:09, 7:07, 7:10, 10:07, 9:06, 6:09, 9:09, 6:08, 10:06, 8:10, 8:06, 6:10, 10:08, 11:07, 6:11, 7:06, 11:06, 7:11, 6:07, 5:10, 9:10, 10:05, 5:09, 10:09, 9:05, 6:12, 6:06, 12:06, 5:11, 11:08, 8:05, 11:05, 8:11. 5:08, 7:12, 12:05, 5:07, 5:12, 12:07, 7:05, 5:13, 13:06, 6:05, 6:13,13:05, 5:06, 4:10, 10:10, 10:04, 9:04, 4:11, 11:09, 4:09, 9:11, 11:04, 12:08, 4:12, 8:04, 8:12, 4:08, 12:04, 5:05, 14:05, 5:14, 13:04, 7:13, 4:07, 4:13, 7:04, 13:07, 6:14, 14:04, 4:06, 6:04, 4:14, 14:06, 4:05, 5:15, 15:04, 5:04, 15:05, 4:15, 10:11, 3:10, 11:03, 3:11, 11:10, 10:03, 9:12, 3:09, 12:03, 12:09, 3:12, 9:03, 13:03, 8:13, 3:08, 13:08, 3:13, 8:03, 7:14, 14:03, 3:07, 3:14, 14:07, 7:03, 4:16, 4:04, 15:06, 6:03, 6:15, 15:03, 3:06, 17:04, 4:03, 3:17, 3:05, 16:03, 5:16, 3:16, 16:05, 5:03, 4:17, 3:04, 17:03, 3:03, 18:03, 3:18, 17:05, 16:06, 6:02, 2:16, 5:02, 2:17, 4:02, 2:18, 2:01, 18:04, 1:20, 3:01, 20:03, 2:03, 3:19, 19:02, 2:04, 18:02, 4:18, 18:05, 1:18, 5:01, 2:19, 3:02, 19:03, 2:11, 11:02, 11:11, 1:21, 16:02, 2:06, 6:16, 17:02, 5:17, 2:20, 14:02, 2:08, 8:14, 16:04, 3:15, 2:02, 20:02, 8:02, 2:05, 10:12, 2:10, 12:02, 7:02, 2:15, 15:07, 7:01, 16:07, 1:16, 2:12, 12:10, 10:02, 2:14, 14:08, 13:09, 2:13, 9:13, 2:09, 13:02, 9:02, 9:01, 14:09, 1:14, 15:02, 7:15, 2:07, 21:02, 22:01, 15:08, 1:15, 8:01, 6:17, 1:06, 17:01, 21:01, 8:15, 15:01, 1:08, 6:01, 17:06, 1:17, 1:22, 1:01, 20:01, 3:20, 1:03, 18:01, 1:05, 5:18, 19:01, 4:19, 1:13, 10:01, 2:21, 13:10, 1:09, 14:01, 9:14, 16:01, 1:07, 7:16, 1:02, 1:19, 19:04, 4:01, 1:04, 13:01, 1:10, 10:13, 1:12, 11:01, 12:11, 1:11, 12:01, 11:12.

2. Способ по п.1, включающий:
вычисление данных моделирования из графика, полученного путем аппроксимации косинусом временного ряда данных по уровням экспрессии, причем данные моделирования отражают изменения уровня экспрессии через каждый час;
вычисление выборочных данных по трем точкам из трех произвольных точек времени и уровней экспрессии в этих точках из данных моделирования по приведенным выше формулам (I) и (II);
вычисление разницы по времени между данными моделирования и выборочными данными по трем точкам в те моменты, в которые уровни экспрессии достигают максимума; и
вычисление трех точек времени, в которых среднее значение разницы по времени составляет менее 0,6, а стандартная ошибка разницы по времени составляет менее 0,4; и взятие биологических образцов три раза в сутки именно в эти три точки времени как точки взятия образцов.

3. Способ по п.2, в котором биологические образцы у субъекта отбирают три раза в сутки с интервалом в 8 часов.

4. Способ по п.1, в котором в качестве часовых генов используют ген Per3 и ген Nr1d2.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа количественного определения фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253». Способ предусматривает обеззараживание и выделение РНК из вируссодержащего материала, постановку реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме «реального времени» с использованием специфичных праймеров RV5-5'-GTTGGGCACTGAAACTGCTA-3', RV6-5'-GAATCTCCGGGTTCAAGAGT-3' и зонда RV7-5'-ROX-AATCCTCCTTGAACTCCATGCGACAGA-BHQ2.

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к анализу нарушений, связанных с раком яичников, и может быть использовано в медицине. Способ включает определение геномного статуса метилирования CpG-динуклеотидов в каждой последовательности из группы последовательностей SEQ ID NO:1-10 с использованием набора зондов, специфичных для указанных последовательностей и способных гибридизоваться с последовательностью по всей длине.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и фармакологии. Предложен способ для предсказания фармакологической эффективности адалимумаба для лечения ревматоидного артрита, где способ включает измерение уровня, по меньшей мере, одной из мРНК ADAMTS4 и мРНК ADAMTS5 в образце, полученном от субъекта, и определение того, эффективен ли адалимумаб против ревматоидного артрита у субъекта, на основе уровня, по меньшей мере, одной из мРНК ADAMTS4 и мРНК ADAMTS5, выступающего в качестве показателя.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора, включающего олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуоресцентно меченный зонд для идентификации ДНК аденовируса серотипов 3, 4, 7, 14, 21 методом гибридизационно-флуоресцентной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Изобретение относится к биотехнологии и касается рекомбинантного штамма E. coli TG1(pRVMoscow3253G-L) для получения ПЦР-стандартов для количественного определения кДНК вируса бешенства штамма «Москва 3253».
Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Treponema denticola методом полимеразной цепной реакции.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Candida albicans методом полимеразной цепной реакции.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Представлен способ, основанный на измерении в вагинальных соскобах уровня экспрессии мРНК генов интерлейкинов IL1B, IL8, IL10 и IL18 относительно представленности мРНК референсных генов B2M, GUS, TBP или HPRT; на основании полученных уровней экспрессии вычисляется значение канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ) следующим образом: Y=1,09*IL1B-0,61*IL8+0,21*IL10-0,11*IL18-0,91 (формула 1), где IL1B - относительный уровень экспрессии IL1B, IL8 - относительный уровень экспрессии IL8, IL10 - относительный уровень экспрессии IL10, IL18 - относительный уровень экспрессии IL18; IL=2^(Cpmin-Cpil)/NF (формула 2), где IL - относительный уровень экспрессии гена интерлейкина, Cpmin - коэффициент минимального значения уровня экспрессии, для IL1B Cpmin=17,9; IL8 Cpmin=16,6; IL10 Cpmin=28,8; IL18 Cpmin=23,3; Cpil - значение порогового цикла соответствующего IL в образце, определяемого автоматически; NF - фактор нормировки, вычисляется по формуле 3: (формула 3), где NF - фактор нормировки, вычисляемый как среднее геометрическое 4 факторов нормировки для референсных генов (см.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложенная тест-система для обнаружения РНК вируса блютанга включает серогруппспецифичные праймеры и ДНК-зонд, комплементарные участкам консервативного 10-го сегмента, имеющие следующий нуклеотидный состав (5' - 3'): BTV/10/qf - ACKggTgCWACgCAAACACA; BTV/10/z - FAM - AARgCTgCATTCgCATCgTACGC - BHQ1; BTV/10/qr - ACRTCATCACgAAACgCTTC.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам прогнозирования течения рака, и может быть использовано в медицине. Способ определения прогноза для пациента, страдающего раком NSCLC, включает определение уровней экспрессии ChoK бета или ChoK бета и ChoK альфа в образце от указанного пациента.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу дифференциации возбудителя сибирской язвы от других близкородственных видов рода Bacillus на основе определения различий в структуре хромосомных генов. Способ предусматривает пробоподготовку, выделение ДНК, постановку ПЦР. При этом при проведении ПЦР применяют олигонуклеотидные праймеры, комплементарные последовательностям хромосомных генов fliC и hom2, имеющие следующие последовательности:fliC-F: 5'-TGGAGCAGTAACAATTGG-3', fliC-R: 5'-GCACCACTGATAGAAATGTTAG-3', hom2-F: 5'-GACGTGTTAAAAGAAGCCCA-3', hom2-R: 5'-CACCAATTTCGTCTTTTACA-3' с последующим электрофоретическим анализом продуктов амплификации, при котором образование продукта амплификации размером 153 п.н. свидетельствует о принадлежности исследуемого штамма к виду В.anthracis, образование продукта амплификации размером 550 п.н. свидетельствует о принадлежности исследуемого штамма к другому виду рода Bacillus. Изобретение позволяет эффективно дифференцировать возбудителя сибирской язвы от других бациллярных видов. 1 ил., 1 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ мультиплексной детекции представителей родов Aeromonas и Flavobacterium предусматривает постановку ПЦР в один этап с использованием двух пар синтезированных праймеров к участкам гена малой субъединицы рибосомальной РНК (16S rRNA) в режиме реального времени к участку гена малой субъединицы рРНК Aeromonas: А1 - 5'-TTCGGGCCTTGCGCGATTGG-3' и А2 - 5'-CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3', обеспечивающие амплификацию фрагмента размером 920 п.н. с температурой плавления 85,21±0,05°С и к участку гена малой субъединицы рРНК Flavobacterium F1 - 5'-CGATGGATACTAGCTGTTGGG-3' и F2 - 5'-GACGACAACCATGCAGCACC-3',обеспечивающие образование фрагмента размером 242 п.н. с температурой плавления 81,23±0,50°С. При этом используют термоциклеры по программе: предварительная денатурация при температуре 95°С 5 мин, 40 циклов амплификации 95°С - 15 сек, 66°С - 60 сек; анализ результатов детектирования и определения искомых микроорганизмов по наличию или отсутствию специфических пиков амплифицированной ДНК. Способ обеспечивает быстрое, простое, точное выявление представителей родов Aeromonas и Flavobacterium в исследуемом образце. 1 з.п. ф-лы, 3 ил.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора праймеров для выявления генетического материала (РНК) и дифференциации вируса парагриппа человека 1, 2, 3 и 4 типов в клинических образцах. Представленный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых ДНК-зондов содержит четыре пары внутренних и четыре пары внешних олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также четыре флуоресцентно-меченых ДНК-зонда. Представленное изобретение позволяет проводить более достоверное и надежное выявление генетического материала (РНК) и дифференциацию вируса парагриппа человека 1, 2, 3 и 4 типов и может быть использовано в медицине, биотехнологии и эпидемиологии. 2 ил., 6 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и касается тест-системы и способа для обнаружения РНК вируса болезни Шмалленберг. Предложенная тест-система включает праймер Schm U, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-САА ССА GAA GAA GGC САА GA-3', праймер Schm L, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-TCT GGC АСА GGA TTT GAG AC-3' и зонд Schm Z, имеющий последовательность 5'-[Hex] CCC CAC САА AAG TAA GAT CGA CAC [BHQ2]-3'. Предложенный способ предусматривает выделение РНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции с использованием указанных праймеров и зонда и амплификацию РНК вируса с детекцией продуктов амплификации в реальном времени. Интерпретацию результатов проводят на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией (Threshold). Представленные изобретения могут быть использованы в ветеринарной вирусологии для выявления генома вируса болезни Шмалленберг. 2 н.п. ф-лы, 4 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и пищевой промышленности. Представлено растение ячменя, которое дает зерно и является гомозиготным, по меньшей мере, в двух локусах для введенных генетических вариаций, которые представляют собой: a) аллель, в которой удалена большая часть или все гены, кодирующие В-гордеин в локусе Hor2, и b) мутантную аллель в локусе Lys3 ячменя, так что зерно не содержит ни В-, ни С- гордеинов, и указанные генетические вариации присутствуют в ячмене линий Riso 56 и Riso 1508 соответственно, при этом отсутствие В-гордеинов является обнаружимым по отсутствию амплифицированной ДНК с использованием праймеров: 5'B1hor: 5'-CAACAATGAAGACCTTCCTC-3', 3'B1hor: 5'-TCGCAGGATCCTGTACAACG-3', а отсутствие С-гордеинов является обнаружимым по отсутствию 70 кДа полосы при исследовании спирторастворимого экстракта зерна посредством ДСН-ПААГ. Также представлены: зерно ячменя, полученное от указанного растения; пищевые продукты, не содержащие В- и С-гордеинов, полученные из указанного зерна, такие как мука, солод, пиво. Кроме того, описаны способы получения пищевых продуктов (муки, цельнозерновой муки, крахмала, солода) и напитков с использованием зерна, полученного от растения ячменя, имеющего указанные выше признаки. Предложен способ идентификации ячменного зерна, пригодного для производства пищевого продукта и/или напитка на основе солода, пригодного для употребления лицом с целиакией, включающий: a) получение одного или нескольких материалов: i) образца растения, способного давать указанное зерно, ii) зерна, iii) солода, полученного из зерна, и/или iv) экстракта указанного зерна; b) анализ материала со стадии а) на наличие, по меньшей мере, одного гордеина и/или, по меньшей мере, одного гена, кодирующего гордеин, с выбором зерна, имеющего генный набор указанного выше растения. Изобретение позволяет получать пищевые продукты или напитки на основе солода, которые не содержат В- и С-гордеинов. 14 н. и 13 з.п. ф-лы, 14 ил., 10 табл., 10 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ определения генотипа человека по полиморфизму в гене коллагена II типа COL2A1 С>А (rs1635529). Данный способ может быть использован при диагностике заболеваний пародонта в ротовой полости. Способ включает снятие кривых плавления с флуоресцентно-меченными аллель-специфичными олигонуклеотидными пробами. Используют общую для всех аллелей пару праймеров, отличающиеся для каждого аллеля флуоресцентно-меченные аллель-специфичные олигонуклеотидные пробы и универсальный олигонуклеотид, меченный гасителем флуоресценции, следующего нуклеотидного состава: COL2_29s TCTTGCCCAAAGGCTAGGCGGA, COL2_29a CCAGAGGGCGAGAAAGAAACGA, COL2_29p1 AAAAAGGAAAGTTTATC-FAM, COL2_29p2 AAAAAGGAACGTTTATC-HEX, COL2_29pq BHQ 1-TTTGGATTTTCACTCTCTT-3′-(P), где FAM - означает флуоресцентный краситель FAM, HEX - означает флуоресцентный краситель HEX, BHQ1 - означает присоединенный к 5′-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции. Относят образец к гомозиготе или гетерозиготе по данному аллелю по анализу форм кривых плавления ДНК, а именно по максимуму первой производной графиков флуоресценции. Предложенное изобретение позволяет более доступно проводить исследования по определению полиморфизма в гене коллагена II типа COL2A1 С>А (rs1635529) генотипа человека. 1 ил., 2 табл.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу идентификации возбудителя чумы и оценки количества микробных клеток, идентифицируемых в качестве возбудителя чумы в исследуемых пробах посредством ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени, включающий следующие стадии: выделение ДНК микроорганизма из исследуемых проб, подготовка калибровочной панели, исследование выделенной ДНК в ПЦР с использованием специфических праймеров и зондов с флуоресцентной меткой, идентификация исследуемой ДНК как ДНК микробного или немикробного штамма по наличию нарастания флуоресцентного свечения или его отсутствию соответственно, определение по калибровочной панели концентрации ДНК в пробе. Использование изобретения позволяет повысить эффективность идентификации исследуемой пробы и сократить сроки ее тестирования в режиме реального времени. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биохимии и медицины. Предложена L-нуклеиновая кислота - антагонист MCP-1 и способ её детектирования. Изобретение может быть использовано в лечении заболеваний, обусловленных MCP-1-механизмом патогенеза. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 50 ил., 1 табл., 9 пр.

Предложенная группа изобретений относится к области ветеринарии. Предложена иммуногенная композиция для собак, содержащая эффективное количество вирионов парвовируса с белком типа VP-2, содержащим нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4. Предложен диагностический набор для обнаружения парвовируса у диких и домашних животных, в том числе животных в зоопарках, заповедниках и исследовательских центрах, содержащий гибридизируемые нуклеиновые кислоты, специфические для обнаружения у указанных животных последовательности SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективные средства иммунизации собак против парвовируса, а также диагностические средства для обнаружения парвовируса у животных. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 5 пр.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины и ветеринарии. Предложен биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, содержащий носитель, по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, содержащую гены, кодирующие VEGF и/или SDF-1, и клетки, обеспечивающие репаративную регенерацию. Предложены способы получения вышеуказанного биокомпозита и набор для его приготовления. Предложены также способ обеспечения заживления повреждения у млекопитающего и способ доставки нуклеиновой кислоты. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективную регенерацию тканей после повреждения у млекопитающего за счет использования трехкомпонентного биокомпозита, состоящего из носителя, по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты и клеток, обеспечивающих репаративную регенерацию. 7 н. и 9 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.
Наверх