Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления днк пародонтопатогенного микроорганизма candida albicans методом полимеразной цепной реакции

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Candida albicans методом полимеразной цепной реакции. Указанный набор включает специфичные к фрагменту гена gr1 микроорганизма Candida albicans праймеры 5′-TTGCCATTCTTGGACGAAGG-3′ и 5′-CAACAATGGCAACTTTTTTAGG-3′, а также зонд (BHQ1)-5′-TCCTCCTTCAG(FdT)CCCTGGTGCTGA-3′-Р, где BHQ1 означает присоединенный к 5'- концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т. Предлагаемое изобретение является эффективным маркером для обнаружения присутствия в биологическом материале микроорганизма Candida albicans.

 

1. Область техники

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в медицине для диагностики заболеваний ротовой полости (гингивита, пародонтита).

На протяжении многих лет заболевания пародонта стабильно занимают по распространенности одно из ведущих мест в мире. Несмотря на широкое развитие инструментальных и лабораторных методов исследования, ранняя и точная диагностика различных стоматологических заболеваний до сих пор остается крайне актуальным вопросом.

Согласно современным представлениям основной причиной развития заболеваний пародонта является микробная инфекция. Candida albicans играет ключевую этиологическую роль в развитии быстропрогрессирующих пародонтитов. В последние годы разрабатываются различные методы молекулярно-генетической диагностики инфекций пародонта, которые позволяют выявлять последовательности ДНК, являющиеся характерными для определенного вида возбудителя. Метод полимеразной цепной реакции (ПНР) является оптимальным для идентификации бактерий, связанных с воспалительными процессами пародонта. Принцип ПНР заключается в многократном копировании (амплификации) определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида возбудителя. Благодаря высокой специфичности ПНР происходит амплификация исключительно ДНК искомого микроорганизма - любая сопутствующая флора не может оказать влияние на эффективность диагностики.

2. Уровень техники

Известны следующие аналоги данного изобретения:

Патент №2306341, дата публикации 20.09.2007 (с 08.04.2010 патент прекратил действие, но может быть восстановлен): «Набор реагентов для определения ДНК пародонтопатогенных микробов Prevotella intermedia sensu stricto, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции».

Это изобретение позволяет определить пять парадонтопатогенов в одном образце с помощью мультиплексной ПНР, что достигается использованием комбинации 16s rDNA-праймеров в определенных концентрациях:

Prevotella intermedia sensu stricto:

5′-GCATCTGACGTGGACCAA-3′, 0,15 µM;

Bacteroides forsythus:

5′-TACAGGGGAATAAAATGAGATACG-3′, 0,60 µM;

Actinobacillus actinomycetemcomitans:

5′-ATTGGGGTTTAGCCCTGGTG-3′, 0,20 µM;

Porphyromonas gingivalis:

5′-TGTAGATGACTGATGGTGAAAACC-3′, 0,30 µM;

обратный олигонуклеотидный праймер, общий для ДНК Porphyromonas gin.givalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacteroides forsythus и

Prevotella intermedia: 5′-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-3′, 1,20 µM,

а также два олигонуклеотидных праймера, специфичных для генома

Treponema denticola: 5′-GAATCGCTAGTAATCGCACATCAG-3′ и 5′-TTCAAACATTCCAGCGTCTTCATT-3′, при этом концентрация каждого праймера - 0,30 µМ.

Набор содержит также комплект для подготовки пробы и положительный и отрицательный контрольные образцы. Анализ продуктов HTTP осуществляется методом электрофореза.

Патент №2420591, дата публикации 10.06.2011. Изобретение представляет собой набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Porphyromonas gingivalis. Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение указанной бактерии в биологическом материале, забранном с помощью стоматологических зондов. Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Porphyromonas gingivalis, включающего в себя праймеры:

5′-TCCGACCGTCGAGCCTGTT-3′,

5′-CTGCCACAGCCAGTAGCCTT-3′

и зонд: (BHQ1)-5′-GCCGAAAGAA(FdT)TGCCGGCCG-3′-P.

Патент №2420589, дата публикации 10.06.2011. Изобретение представляет собой набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Prevotella intermedia. Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение указанной бактерии в биологическом материале, забранном с помощью стоматологических зондов. Указанный результат достигается путем использования при постановке ПНР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Prevotella intermedia, включающего в себя праймеры:

5′-CACTTGGCAAGCACAAAATGAA-3′,

5′-TGGGGTTATCGGTTTCTACGAA-3′

и зонд: (BHQ1)-5′-CGCACCCGAAC(FdT)GCTTGGCG-3′-P.

Патент №2420592, дата публикации 10.06.2010. Изобретение представляет собой набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Actinobacillus actinomycetemcomitans. Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение указанной бактерии в биологическом материале, забранном с помощью стоматологических зондов.

Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Actinobacillus actinomycetemcomitans, включающего в себя праймеры:

5′-CGCCTAGGGCTGCCTGAAT-3′,

5′-GCAGGTGAGGTTGCGCAGGA-3′

и зонд: (BHQ1)-5′-TTCGCCCGCC(FdT)CGCCCCTGA-3′-P.

Работа над созданием синтетических олигонуклеотидов (праймеров), которые используются в подобных наборах и являются их отличительной чертой, строится обычно следующим образом.

1) С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей геномов микроорганизмов либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности изучаемого микроорганизма выбирается участок генома, уникальный для данного вида микроорганизмов (или группы видов).

2) На основании выбранного участка генома с помощью специального программного обеспечения подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР.

На данном этапе работа заключается в сравнении геномных последовательностей разных микроорганизмов между собой и выборе уникального для нужного микроорганизма участка, не имеющего аналогов у других микроорганизмов.

Кроме того, необходимым условием оптимальной работы праймеров является соответствие между их расположением и числом мутаций в нуклеотидной последовательности генома микроорганизма. Это означает, что мутации, возможные в данном микроорганизме (естественно, те данные, о которых уже есть в базах или уже самостоятельно получены), не должны затрагивать выбранный для праймеров участок генома, так как замены в геномной последовательности (мутации) могут негативно сказаться на работе праймеров.

3) Изготовление праймеров заказывается в особом сервисном центре.

4) С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для конкретных целей (для определения наличия/отсутствия данного микроорганизма в биоматериале).

Предлагаемое изобретение отличает уникальный набор из двух праймеров и зонда, который позволяет обнаруживать ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Candida albicans, играющего ключевую этиологическую роль в развитии быстропрогрессирующих пародонтитов, с высокой диагностической чувствительностью и специфичностью.

3. Раскрытие изобретения

Технический результат, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, заключается в том, что ген gr1 является эффективным маркером для обнаружения присутствия в биологическом материале микроорганизма Candida albicans.

Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Candida albicans, включающего в себя праймеры:

5′- TTGCCATTCTTGGACGAAGG-3′,

5′- CAACAATGGCAACTTTTTTAGG-3′,

(BHQ1)-5′-TCCTCCTTCAG(FdT)CCCTGGTGCTGA-3′-P,

где BHQ1 означает присоединенный к 5′-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду T.

Указанный набор синтетических олигонуклеотидов является составной частью набора следующих веществ:

1) Пробирки с реакционной смесью, запаянной парафином. В данную смесь входят указанные праймеры и зонд, специфичные к участку ДНК Candida albicans, смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов, реакционный буфер (100 мМ Tris-HCl (рН 8.8 при 25°C), 500 мМ KCl, 0.8% Р40, 20 мМ MgCl2), внутренний контрольный образец (ВК).

И праймеры, и зонд представляют собой синтетические олигонуклеотиды. Праймеры, специфичные к маркерному участку генома Candida albicans - гену grl, вводятся в реакцию непосредственно для амплификации (наработки) продукта. Зонд (тоже специфичный к данному участку ДНК) имеет в своем составе флуоресцентную метку и гаситель флуоресценции. В случае образования специфического продукта ДНК зонд разрушается, действие гасителя на флуоресцентную метку прекращается, это ведет к возрастанию уровня флуоресценции данного зонда, что фиксируется специальными приборами - детектирующими амплификаторами. Интенсивность флуоресценции зонда свидетельствует о количестве образующегося продукта, что в свою очередь зависит от эффективности работы праймеров, количества стартового материала и других параметров реакции. Иными словами праймеры обеспечивают течение реакции, зонд - проявку ее результатов.

Внутренний контрольный образец (ВК) представляет собой ДНК-последовательность, вносимую в реакцию для оценки эффективности ее протекания. Наработка ВК идет независимо от наработки специфического продукта с помощью отдельных праймеров и зонда.

2) Раствор фермента Taq-полимеразы.

3) Положительный контрольный образец - ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 187 п.н. генома Candida albicans. Он вносится в пробирку (по аналогии с исследуемыми образцами) для того, чтобы иметь возможность сравнивать результаты, полученные в опытных пробирках с тем, как должно получаться при "положительной реакции". Соответственно, добавляемые в остальные пробирки образцы ДНК являются опытными.

4) Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент.

4. Осуществление изобретения

1) Биологический материал (соскобы, забранные стоматологическими зондами) перед проведением ПЦР с помощью предлагаемого набора праймеров проводится через процедуру пробоподготовки с использованием другого набора (набор реагентов для пробоподготовки, не является предметом данного патента); в ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую в свою очередь используют для ПЦР.

2) Необходимое количество пробирок с подготовленной реакционной смесью, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонд, маркируется согласно количеству анализируемых образцов.

3) Во все промаркированные пробирки, не повреждая слой парафина, добавляется раствор Taq-полимеразы.

4) Во все промаркированные пробирки (кроме пробирок K-(отрицательный контрольный образец), К+ (положительный контрольный образец)) вносится выделенная согласно п.1) ДНК.

5) В пробирку, маркированную K-, вносится отрицательный контрольный образец.

6) В пробирку, маркированную К+, вносится положительный контрольный образец.

7) Все пробирки устанавливаются в блок амплификатора, амплификация проводится согласно режимам, прописанным в инструкции к набору. Детекция результатов осуществляется детектирующим амплификатором автоматически во время амплификации (устройства: амплификаторы детектирующие ДТ-322, ДТ-96 (ЗАО "НПФ ДНК-Технология").

Анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору.

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Candida albicans методом полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что включает в себя праймеры:
5′-TTGCCATTCTTGGACGAAGG-3′,
5′-CAACAATGGCAACTTTTTTAGG-3′
и зонд (BHQ1)-5′-TCCTCCTTCAG(FdT)CCCTGGTGCTGA-3′-Р, где
BHQ1 означает присоединенный к 5′-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду T.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Представлен способ, основанный на измерении в вагинальных соскобах уровня экспрессии мРНК генов интерлейкинов IL1B, IL8, IL10 и IL18 относительно представленности мРНК референсных генов B2M, GUS, TBP или HPRT; на основании полученных уровней экспрессии вычисляется значение канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ) следующим образом: Y=1,09*IL1B-0,61*IL8+0,21*IL10-0,11*IL18-0,91 (формула 1), где IL1B - относительный уровень экспрессии IL1B, IL8 - относительный уровень экспрессии IL8, IL10 - относительный уровень экспрессии IL10, IL18 - относительный уровень экспрессии IL18; IL=2^(Cpmin-Cpil)/NF (формула 2), где IL - относительный уровень экспрессии гена интерлейкина, Cpmin - коэффициент минимального значения уровня экспрессии, для IL1B Cpmin=17,9; IL8 Cpmin=16,6; IL10 Cpmin=28,8; IL18 Cpmin=23,3; Cpil - значение порогового цикла соответствующего IL в образце, определяемого автоматически; NF - фактор нормировки, вычисляется по формуле 3: (формула 3), где NF - фактор нормировки, вычисляемый как среднее геометрическое 4 факторов нормировки для референсных генов (см.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложенная тест-система для обнаружения РНК вируса блютанга включает серогруппспецифичные праймеры и ДНК-зонд, комплементарные участкам консервативного 10-го сегмента, имеющие следующий нуклеотидный состав (5' - 3'): BTV/10/qf - ACKggTgCWACgCAAACACA; BTV/10/z - FAM - AARgCTgCATTCgCATCgTACGC - BHQ1; BTV/10/qr - ACRTCATCACgAAACgCTTC.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам прогнозирования течения рака, и может быть использовано в медицине. Способ определения прогноза для пациента, страдающего раком NSCLC, включает определение уровней экспрессии ChoK бета или ChoK бета и ChoK альфа в образце от указанного пациента.

Изобретение относится к области онкологии и молекулярной биологии. Предложен способ определения чувствительности клеток немелкоклеточного рака легких к действию препаратов, реактивирующих р53 белок, включающий выделение РНК из образцов, синтез кДНК генов CDKN1A, BTG2 и E2F1 методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени с последующим определением соотношения количества кДНК гена E2F1 к количеству кДНК гена CDKN1A или гена BTG2, где при величине соотношения E2F1/CDKN1A>3 или E2Fl/BTG2>1,5 считают клетки немелкоклеточного рака легких чувствительными к препаратам, реактивирующим белок р53.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в диагностических исследованиях, направленных на выявление возбудителей острых кишечных инфекций (ОКИ).

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ диагностики чувствительности М. tuberculosis (МБТ) к инъекционным противотуберкулезным препаратам резервного ряда.

Группа изобретений относится к области молекулярной биологии и электрохимии. По первому варианту способ осуществляют путем регистрации циклических вольтамперограмм рабочего электрода, модифицированного углеродными нанотрубками с нековалентно иммобилизованным на их поверхности олигонуклеотидным зондом, до и после внесения в исследуемый раствор образца нуклеиновой кислоты и по изменению емкостной характеристики делают вывод о наличии или отсутствии в образце участка, комплементарного олигонуклеотидному зонду.

Изобретение относится к паразитологии и касается способа видовой ДНК-дифференциации гельминтов - возбудителей церкариального дерматита человека. Дифференциацию четырех видов Trichobilharzia: Т.

Изобретение относится к молекулярной генетике. Способ включает: получение кДНК EML4-ALK с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) на матрице РНК гена EML4-ALK с использованием специфичных праймеров; амплификацию фрагментов гена EML4-ALK методом мультиплексной ПЦР на матрице кДНК, полученной на первом этапе ОТ-ПЦР, с помощью набора высокоспецифичных праймеров; получение флуоресцентно-меченого ПЦР-продукта на втором этапе ОТ-ПЦР; создание биочипа для анализа транслокаций EML4-ALK, содержащего набор иммобилизованных зондов; гибридизацию флуоресцентно-меченого ПЦР-продукта с зондами в гелевых ячейках на пластиковой подложке биочипа; регистрацию и интерпретацию результатов гибридизации.
Изобретение относится к молекулярной биологии и генетике клетки. Предложен способ, включающий этапы предварительной экстракции геномной ДНК, выделения специфической фракции однонитевых G-оверхенгов теломерной ДНК и последующей амплификации их минусовой цепи с дуплекс-специфическим анализом, причем этапы амплификации включают модификацию 3'-концов теломерных оверхенгов с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и осуществляются с использованием набора праймеров SEQ ID NO: 1-5.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в диагностических исследованиях, направленных на выявление возбудителей острых кишечных инфекций (ОКИ).
Изобретение относится к области медицины, в частности молекулярной биологии и онкологии, и касается системы маркеров, представляющую собой группу генов микроРНК: miR-129-2, miR-125b1, miR-137 и miR-375, для диагностики немелкоклеточного рака легкого, включая плоскоклеточный рак и аденокарциному.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к созданию рекомбинантных плазмид, обеспечивающих экспрессию полиэпитопных опухоль-ассоциированных антигенов в дендритных клетках, способных стимулировать специфические цитотоксические клетки, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения терапевтического агента для лечения клещевого энцефалита людей. Способ включает получение аптамеров, которые способны образовывать комплекс с третичной структурой поверхностного белка вируса.

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Предложен способ получения вектора экспрессии, кодирующего адаптированную рекомбиназу.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения тканевого активатора плазминогена человека. Рекомбинантной плазмидной ДНК рВК415, кодирующей полипептид с последовательностью тканевого активатора плазминогена человека, включающей также MAR - область прикрепления к ядерному матриксу гена лизоцима птиц, усилитель транскрипции вируса CMV, внутренний сайт инициации трансляции IRES вируса энцефаломиокардита, ген DHFR мыши, сигнал полиаденилирования вируса SV40, ген аминогликозид-3'-фосфотрансферазы, обеспечивающей устойчивость к генетицину (Neo) и кассету для экспрессии в клетках бактерий гена β-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампицилину, трансформируют клетки линии Cricetulus griseus CHO DHFR(-) с получением линии клеток Cricetulus griseus CHO 1F8, продуцирующей рекомбинантный белок тканевого активатора плазминогена со стабильно высоким выходом на уровне до 190 мг/л.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения рекомбинантного фактора свертываемости крови IX человека (hFIX). Рекомбинантная плазмидная ДНК рАК380, содержащая ген белка rhFIX, MAR - область прикрепления к ядерному матриксу гена лизоцима птиц, усилитель транскрипции вируса CMV, внутренний сайт инициации трансляции IRES вируса энцефаломиокардита, ген DHFR мыши, сигнал полиаденилирования вируса SV40, ген аминогликозид-3'-фосфотрансферазы для устойчивости к генетицину (Neo), кассету для экспрессии в клетках бактерий гена β-лактамазы для устойчивости к ампицилину, используется для получения рекомбинантного фактора hFIX в клетках линии Cricetulus griseus CHO 1E6.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к апоптотическим факторам, и может быть использовано в медицине. Получают композицию, включающую ингибитор TNF-подавляющей активности Core 1 митохондриального дыхательного комплекса III в опухолевой клетке на основе нуклеиновой кислоты; член суперсемейства фактора некроза опухоли (TNF) и носитель.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биоорганической химии и медицины. Заявляемые нанокомпозиты предназначены для направленного воздействия на генетический материал внутри клетки и подавления его дальнейшего функционирования.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Treponema denticola методом полимеразной цепной реакции. Указанный набор включает специфичные к фрагменту гена licCA микроорганизма Treponema denticola праймеры 5'-TAG CCG GAA AAA CGA AGG AGT G-3' и 5'-CCC TGC TTG TTT GCA AAC ATA G-3', а также зонд (BHQ1)-5'-AAC CCA GCC G(FdT)T TCG TCC TCC GAC-3'-P, где BHQ1 означает присоединенный к 5'- концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т. Предлагаемое изобретение является эффективным маркером для обнаружения присутствия в биологическом материале микроорганизма Treponema denticola.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Candida albicans методом полимеразной цепной реакции. Указанный набор включает специфичные к фрагменту гена gr1 микроорганизма Candida albicans праймеры 5′-TTGCCATTCTTGGACGAAGG-3′ и 5′-CAACAATGGCAACTTTTTTAGG-3′, а также зонд -5′-TCCTCCTTCAGCCCTGGTGCTGA-3′-Р, где BHQ1 означает присоединенный к 5- концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т. Предлагаемое изобретение является эффективным маркером для обнаружения присутствия в биологическом материале микроорганизма Candida albicans.

Наверх