Фосфолипидный флуоресцентный зонд и тест-система для определения активности фосфолипазы а2 в сыворотке крови



Фосфолипидный флуоресцентный зонд и тест-система для определения активности фосфолипазы а2 в сыворотке крови
Фосфолипидный флуоресцентный зонд и тест-система для определения активности фосфолипазы а2 в сыворотке крови
Фосфолипидный флуоресцентный зонд и тест-система для определения активности фосфолипазы а2 в сыворотке крови
Фосфолипидный флуоресцентный зонд и тест-система для определения активности фосфолипазы а2 в сыворотке крови
Фосфолипидный флуоресцентный зонд и тест-система для определения активности фосфолипазы а2 в сыворотке крови
Фосфолипидный флуоресцентный зонд и тест-система для определения активности фосфолипазы а2 в сыворотке крови
Фосфолипидный флуоресцентный зонд и тест-система для определения активности фосфолипазы а2 в сыворотке крови
Фосфолипидный флуоресцентный зонд и тест-система для определения активности фосфолипазы а2 в сыворотке крови

 


Владельцы патента RU 2517538:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ "РКНПК" Минздравсоцразвития России) (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. Академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) (RU)
Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научный центр "Научно-исследовательский институт органических полупродуктов и красителей" (ФГУП "ГНЦ "НИОПИК") (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к фосфолипидному флуоресцентному зонду, и может быть использовано в медицине. Указанный фосфолипидный флуоресцентный зонд, характеризующийся следующим названием 1-[13-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-3а,4а-диаза-s-индацен-8-ил)тридеканоил]-2-(10-{[(2-гидроксинафтил-1)азофенил-4]азофенил-4}деканоил)-sn-глицеро-3-фосфохолин, используют в составе тест-системы для определения активности фосфолипазы А2 группы IIA (секФЛА2(IIA)) в сыворотке крови, которая также содержит везикулярную фосфолипидную матрицу для включения зонда, состоящую из фосфатидилхолина, лизофосфатидилхолина и фосфатидилглицерина, буферный раствор и фосфолипазу А2 пчелиного яда в качестве стандарта. Изобретение позволяет достоверно определять активность секФЛА2(IIA)в сыворотке крови человека в клинических условиях. 2 н.п. ф-лы, 5 ил., 5 пр.

 

Настоящее изобретение относится к фосфолипидным флуоресцентным зондам, которые могут быть использованы в качестве субстратов для фосфолипаз А1 и А2, а также к тест-системе для определения активности различных представителей фосфолипазы А2(группы IB, IIА, IIC, IID, IIЕ, IIF, III, V, X, ХIIА), в том числе в сыворотке крови человека.

Основной фосфолипазой А2, присутствующей в крови при воспалении, является фосфолипаза А2 группы IIА (секФЛА2(IIА)). Поэтому определение активности секФЛА2(IIА) в крови является весьма актуальным, поскольку в последние годы установлено резкое возрастание активности данного фермента при различных заболеваниях, в том числе сердечно-сосудистых [J Am Coll Cardiol. 2005;46(7):1249-57]. Многочисленные исследования показали, что контроль активности секФЛА2(IIА) позволяет более точно диагностировать различные осложнения атеросклероза, такие как инфаркт, инсульт и т.д. Повышение активности этого фермента в крови пациентов в течение 2-х дней после острого инфаркта миокарда является свидетельством развития повторного инфаркта миокарда. Стабильное повышение активности секФЛА2(IIА) в крови пациентов после коронарной ангиопластики (операция по расширению просвета артерии) является показателем рестеноза (повторного сужения просвета сосуда), который развивается в течение 3-6 месяцев после операции [Mol Cell Biochem. 2005; 270:107-113]. Таким образом, данные об активности секФЛА2(IIА) в крови человека могут дать представления о том, как будут развиваться события после вмешательства кардиохирургов. Так как в настоящее время начинают применять лекарства на основе ингибиторов активности секФЛА2(IIА), измерение активности этого фермента в крови важно и для контроля за применением лекарственных препаратов.

В настоящее время тест-системы для определения активности секФЛА2(IIА) в клинической практике не существует. Присутствующий на рынке набор для определения активности секФЛА2(IIА), производимый фирмой Cayman chemical, не предназначен для клинических исследований, так как не позволяет проводить исследования в образцах крови человека. Этот набор реактивов позволяет определять активность секФЛА2(IIА) колориметрическим методом в образцах, очищенных от различных примесей, в том числе от тиолов, в большом количестве присутствующих в плазме крови человек, поскольку данные примеси влияют на интерференцию при измерении абсорбции.

Сотрудниками Института экспериментальной кардиологии РКНПК Минздравсоцразвития РФ разработан метод определения активности секФЛА2(IIА) в крови человека на основе радиоактивного субстрата [Mol Cell Biochem. 2005; 270:107-113]. Однако применение радиоактивности затрудняет его клиническое использование.

Применение флуоресцентно-меченых фосфатидилхолинов - субстратов секФЛА2(IIА) человека - представляется наиболее рациональным при создании диагностикума для определения активности этого фермента в сыворотке крови человека. Одним из подходов является дизайн синтетических аналогов фосфатидилхолина с модифицированными жирнокислотными цепями, одна из которых несет флуоресцентную группу, а другая - группировку-тушитель флуоресценции. Ввиду близости обеих группировок испускание флуорофора затушено (эффект проявляется на расстояниях менее 5-7 нм). Под действием фосфолипазы А2 одна из жирнокислотных групп отщепляется и, вследствие расхождения флуорофора и тушителя, интенсивность флуоресценции возрастает пропорционально фосфолипазной активности, которую можно получить, считывая испускание образца на флуориметре (или, что проще и дешевле, на флуоресцентном ридере). Такой подход уже применялся для определения активности ряда ферментов из различных природных источников (см., например, Anal. Biochem. 1994, 219,1-8; Anal. Biochem. 1999, v. 276, 27-35; Science. 2001, 292 (5520), 1385-1388). Так, аналог фосфатидилхолина, меченный BODIPY-алкильным (BODIPY=4,4-дифтор-4-бора-3а,4а-диаза-в-индацен) остатком с простой эфирной связью в sn-1 положении и несущий N-(2,4-динитрофенил)-8-аминооктаноильный остаток в sn-2 положении, оказался хорошим субстратом для сывороточной ацетилгидролазы фактора активации тромбоцитов (чувствительность 6 мкмоль мин(-1) мг(-1)) [Anal. Biochem. 1999, 276, 27-35]. В той же работе показано, что аналоги фосфатидилэтаноламина, несущие в sn-2 положении BODIPY-пентаноильную группу, а по аминогруппе полярной головки - 2,4-динитрофенильную группу-тушитель, являются хорошими субстратами для цитозольной фосфолипазы А2 (8 и 15 мкмоль мин(-1) мг(-1)). Минимальные количества детектируемых ферментов были 0.1 нг и 50 нг, соответственно. Один из указанных субстратов был успешно применен для визуализации активности фосфолипазы А2 в живых эмбрионах полосатого данио (известного больше как zebrafish) [Science. 2001, 292 (5520), 1385-1388]. Флуорофоры группы BODIPY имеют отличные спектральные характеристики - узкие длинноволновые максимумы поглощения и испускания, высокая чувствительность и устойчивость, независимость параметров флуоресценции от полярности окружения и пр. и получили к настоящему времени широкое применение. Сейчас BODIPY - большое семейство флуорофоров, различающихся заместителями в положениях 1,3,5,7 и 8 (заместители в положениях 2 и 6, как и отсутствие заместителей, снижают квантовый выход флуоресценции).

Аналогом зонда, представленного в настоящем изобретении, является флуоресцентно-меченый фосфатидилхолин производства фирмы Invitrogen (США) Red/Green BODIPY®PC-A2(KaT.№A10072)-1-O-(6-BODIPY®558/568-аминогексил)-2-BODIPY®FL С5-sn-глицеро-3-фосфохолин. В составе тест-системы EnzChek® Phospholipase А2 Assay Kit (Кат. №№El0217, El0218) указанный зонд позволяет детектировать активность фосфолипазы А2 пчелиного яда на уровне 0.05 Ед/мл (0.05 мкмоль субстрата х мин(-1) х мл(-1)). Данный набор предназначен для работы с клетками и клеточными лизатами. Недостатком зонда фирмы Invitrogen является то, что между флуорофором и местом расщепления молекулы зонда ферментом располагаются всего четыре метиленовых звена. Такое небольшое расстояние затрудняет образование фермент-субстратного комплекса, что понижает чувствительность детектирования фермента. Недостатком зонда фирмы Invitrogen является также то, что его BODIPY-группы способны образовывать нефлуоресцирующие димеры, а также эксимеры, испускающие по сравнению с мономерами в более длинноволновой области. И в том и в другом случае флуоресценция BODIPY оказывается затушенной.

Другими аналогами зонда, представленного в настоящем изобретении, являются пиренсодержащие фосфолипиды. Их предложено использовать для непрерывного мониторинга активности липаз и фосфолипаз, в том числе в сыворотке [Patent US4668623 (А) - 1987-05-26US]. В ранних работах Clin. Chem. 1985, 31, 714-717] использовали подходы, основанные на возрастании флуоресценции мономера пиренильного флуорофора, высвобождающегося в результате гидролиза исходных фосфолипидов, флуоресценция которых обусловлена, в основном, эксимерами пирена. Эксимеризация связана со склонностью к ассоциации пространственно сближенных остатков пирена. Однако затем было показано, что изменение соотношения интенсивности флуоресценции эксимер/мономер обусловлено посторонними физико-химическими факторами, а не действием фермента. В связи с этим, те же авторы [Anal. Biochem. 1988, 170, 248-255] разработали субстрат, несущий пиренил и группировку-тушитель - 1-пальмитоил-2-[6- (пирен-1-ил)гексаноил]-sn-глицеро-3-фосфо-N-тринитрофенил)аминоэтанол; под действием панкреатической секФЛА2(IIА) зонд расщепляется с высвобождением в водную фазу пиренилгексановой кислоты, что сопровождается разгоранием флуоресценции мономера пиренила. Однако в литературе отсутствуют сведения о применении данного зонда для измерений активности секФЛА2(IIА) в сыворотке, что может быть связано, например, с низким сродством данного субстрата к ферменту или с присутствием альбумина и других компонентов сыворотки.

Для измерения активности фосфолипазы А2 в присутствии альбумина была разработана тест-система с использованием фосфолипидов, несущих в sn-2-положении 10-пиренилдеканоильный остаток, в том числе - 1-пальмитоил-2-[10-(пирен-1-ил)деканоил]-sn-глицеро-3-монометилфосфатидовой кислоты (PFA) [Anal. Biochem. 1989, 177, 103-109]. В водной среде такие фосфолипиды образуют везикулы с минимальной флуоресценцией мономера (за счет эксимеризации пиренила). Высвобождающаяся в результате ферментативного расщепления 10-пиренилдекановая кислота «растворяется» в реакционной среде только в присутствии альбумина, который связывает жирные кислоты с высоким сродством. При этом наблюдается усиление флуоресценции пиренильного мономера. Тест-система с PFA позволяет измерять пикомолярные количества фосфолипидов, гидролизуемых в минуту под действием фермента из поджелудочной железы или из ядов, и может быть использована для оценки активности секФЛА2(IIА) в необработанных экстрактах с низкой удельной активностью. Фактически это единственный метод определения секФЛА2(IIА) в сыворотке крови, который применяется сегодня (например, J Am Coll Cardiol. 2005, 46, 1249 -1257). Чувствительность детектирования по фосфолипазе А2 из пчелиного яда - 0.0001 Ед/мл.

Недостатком описанной выше тест-системы для измерения активности секФЛА2(IIА) в присутствии альбумина [Anal. Biochem. 1989, 177, 103-109] является то, что ключевой зонд PFA не отличается стабильностью. Возможно, это одна из причин, по которой данная тест-система не получила широкого применения: судя по публикациям, она используется одним и тем же коллективом авторов [JAm Coll Cardiol. 2005, 46, 1249 -. Thromb. Vase. Biol. 2007, 27, 1177-1183].

Недостатком тест-системы для измерения активности секФЛА2(ИА) в присутствии альбумина [Anal. Biochem. 1989, 177, 103-109] является следующее: содержание альбумина в сыворотках различных пациентов значительно варьирует, что может приводить к артефактам при использовании метода, основанного на связывании с этим белком. Возможно, именно по этой причине данная тест-система не получила широкого применения.

Недостатком тест-системы фирмы Invitrogen является то, что она не предназначена для измерений активности секФЛА2(IIA) в сыворотке крови.

Таким образом, ни один из описанных флуоресцентных зондов и тест-системы с их использованием не обеспечивают возможности достоверно определять активность секФЛА2(IIA) в сыворотке крови человека в клинической практике.

Задачей настоящего изобретения было синтезирование устойчивого фосфолипидного флуоресцентного зонда для использования в тест-системе, позволяющей определять активность секФЛА2(IIA) в сыворотке крови человека в клинических условиях.

Другой задачей изобретения была разработка тест-системы, позволяющей определять активность секФЛА2(IIA) в сыворотке крови человека в клинических условиях.

Для решения поставленных задач, во-первых, синтезирован фосфолипидный флуоресцентный зонд следующего названия: 1-[13-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-3а,4а-диаза-s-индацен-8-ил)тридеканоил]-2-(10-{[(2-гидроксинафтил-1)азофенил-4]азофенил-4}деканоил)-sn-глицеро-3-фосфохолин (далее BODIPY-ФХ),

во-вторых, предложена тест-система для определения активности секФЛА2(IIA) в сыворотке крови человека, включающая вышеописанный зонд, везикулярную матрицу, состоящую из фосфатидилхолина, лизофосфатидилхолина и фосфатидилглицерина, буферный раствор и фосфолипазу A2 пчелиного яда в качестве стандарта.

Предложенный зонд BODIPY-ФХ обладает хорошей стабильностью. Предлагаемый в настоящем изобретении зонд имеет большое расстояние между хромофором-тушителем (а также флуорофором) и местом расщепления молекулы зонда ферментом, что обеспечивает повышенное сродство секФЛА2(IIA) к зонду и оптимальную работу фермента: это расстояние более чем в два раза превышает таковое у зонда фирмы Invitrogen (девять метиленовых звеньев против четырех). Среди известных производных BODIPY для 1,3,5,7-тетраметил BODIPY (Me4-BODIPY-8) образование эксимеров достоверно показано не было [J. Lipid Res. 2007, 48, 1518-1532]. Поэтому с флуорофором Me4-BODIPY-8 позволяет получить еще более высокую, чем аналог фирмы Invitrogen, чувствительность детектирования фосфолипазы А2 пчелиного яда - 0.01 Ед/мл и менее.

Предлагаемая в настоящем изобретении тест-система базируется на разгорании флуоресценции продукта ферментативной реакции, продолжающего быть связанным с везикулярной матрицей. Поэтому влияние флуктуации содержания альбумина (и других, менее массовых компонентов сыворотки) на процесс разгорания флуоресценции становится минимальным.

Ниже приведена принципиальная схема синтеза зонда BODIPY-ФХ:

Синтез зонда включает Схемы 1-3:

Схема 1. Получение несущей остаток тушителя ω-(судан-III)-декановой кислоты (IV). 1. HNO3/H2SO4, петролейный эфир; 2. H2/Pd-C, метанол; 3. NaNO2, анилин ацетонитрил/вода; 4. NaNO2, 2-нафтол ацетонитрил/вода.

Схема 2. Получение флуоресцентной BODIPY-меченой кислоты (VIII) (m=9). 1. SOCl2 в сухом хлороформе, ДМФА; 2. 2,4-диметилпиррол, хлороформ; 3. триэтиламин, эфират BF3.

Схема 3. Получение флуоресцентного зонда (XI) (n=7, m=9). 1. Дибутилоксид олова, хлорангидрид кислоты VIII, изопропанол 2. диметиламинопиридин, диизопропилкарбодиимид, сухой хлороформ.

Тест-система с использованием вышеописанного зонда включает везикулярную фосфолипидную матрицу, буферный раствор и фосфолипаза А2 пчелиного яда в качестве стандарта.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими Фиг.1 - Фиг.5.

На Фиг.1 представлены контрольные показатели флуоресценции субстрата без добавления сыворотки (синие квадраты): к 170 мкл суспензии субстрата добавлено 30 мкл буфера (8 лунок); интенсивность фоновой флуоресценции субстрата с добавлением сыворотки (красные ромбы): к 170 мкл суспензии субстрата добавлено 10 мкл буфера и 20 мкл сыворотки крови непосредственно перед измерением. Представлены средние значения (n=8) для одного репрезентативного эксперимента.

На Фиг.2 приведены результаты изучения кинетики ферментативной реакции в зависимости от активности добавленной к сыворотке фосфолипазы А2 пчелиного яда. Средние значения (n=3) изменения интенсивности флуоресценции зонда во время ферментативной реакции в сыворотке крови (10%) в зависимости от активности добавленной фосфолипазы А2 пчелиного яда. Светло-зеленые восьмерки соответствуют активности фермента - 0,8 ед/мл, черные бантики соответствуют активности - 0,6 ед/мл, голубые треугольники соответствуют активности - 0,4 ед/мл, коричневые треугольники соответствуют активности - 0,2 ед/мл, зеленые треугольники соответствуют активности - 0,12 ед/мл, желтые треугольники соответствуют активности - 0,08 ед/мл, красные ромбы соответствуют активности - 0,04 ед/мл, синие квадраты соответствуют активности - 0,02 ед/мл. Значения фоновой флуоресценции F0, полученные из контрольного опыта в сыворотке (см. Фиг.1), были вычтены из каждого значения для соответствующего времени.

На Фиг.3 показана зависимость интенсивности флуоресценции зонда BODIPY-ФХ в 10%-ной сыворотке от активности добавленной фосфолипазы А2 пчелиного яда: через 13 мин (a, R2=0,99) и 33 мин (б, R2=0,98) после начала измерений. Приведены средние значения ± SD (n=3) репрезентативного эксперимента.

На Фиг.4 приведены средние значения (n=2) изменения интенсивности флуоресценции в системе с зондом BODIPY-ФХ в растворе альбумина (синие квадраты) (конечная концентрация 5 мг/мл; исходный раствор 50 мг/мл разведен в 10 раз остальными компонентами тест-системы) в ходе ферментативной реакции в зависимости от активности фосфолипазы А2 пчелиного яда (зеленые треугольники соответствуют активности фермента - 0,1 ед/мл, желтые треугольники соответствуют активности - 0,06 ед/мл, красные ромбы соответствуют активности - 0,02 ед/мл). По оси ординат приведены показания ридера, по оси абсцисс - время инкубации.

На Фиг.5 приведены средние значения (n=2) изменения интенсивности флуоресценции в системе с зондом BODIPY-ФХ в различных образцах 10%-ной сыворотки (красные ромбы - сыворотка 1, желтые треугольники - сыворотка 2, зеленые треугольники - сыворотка 3, коричневые треугольники - сыворотка 4), и в растворе альбумина (конечная концентрация 5 мг/мл) (синие квадраты). По оси ординат приведены показания ридера, по оси абсцисс - время инкубации.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами: Пример 1. Синтез фосфолипидного флуоресцентного зонда BODIPY-ФХ:

а)ω-(судан III)-декановая кислота

К раствору четырех граммов ω-фенилдекановой кислоты (I) (получена ацилированием бензола избытком себациновой кислоты по Фриделю-Крафтсу в присутствии SiCl4 с последующим восстановлением кето-группы по Хуангу-Минлону) в петролейном эфире добавляли нитрующую смесь (азотная кислота - серная кислота, 1:1). Через час реакционную смесь выливали в стакан со льдом. После таяния льда органический слой отделяли и промывали водой. Растворитель удалили на роторном испарителе. Остаток хроматографировали на силикагеле 60 (Merck) в хлороформе. Получали 4.2 г воскоподобной желтой массы - смеси ω-орто- и ω-паранитрофенилдекановых кислот (ТСХ-контроль), которые использовали дальше без дополнительной очистки.

Смесь ω-орто- и ω-паранитрофенилдекановых кислот растворяли в метаноле и добавляли катализатор (5% палладий на угле). Через полученную суспензию пропускали ток водорода. Уголь отфильтровывали. Остаток упаривали и хроматографировали на силикагеле 60 (Merck) в градиенте метанола (1 → 5%) в хлороформе. Выделяли 1.6 г желтых кристаллов ω-(4-амино)фенилдекановой кислоты (II).

85 мг ω-(4-амино)-фенилдекановой кислоты (II) и 166 мг пара-толуолсульфокислоты суспендировали в 5 мл ацетонитрила и охлаждали в ледяной бане до 0°С. Водный раствор нитрита натрия (24 мг) добавляли к суспензии амина при интенсивном перемешивании и охлаждении. Затем добавляли 90 мкл анилина и перемешивали. Смесь выдерживали в бане, при комнатной температуре разбавляли эфиром (20 мл), промывали 0.1 N НСl и водой. Органический слой сушили над сульфатом натрия, растворитель удалили на роторном испарителе. Остаток сушили под вакуумом, хроматографировали на силикагеле 60 (Merck) в хлороформе. Получали 66 мг (55%) желтых кристаллов ω-(4-(4- аминофенил)-азо-фенил))декановой кислоты (III) 1Н-ЯМР (СНСl3) δ, м. д.: 7.80 (дд, J = 21.1, 8.4 Hz, 4Н), 7.30 (д, J = 8.1 Hz, 2Н), 6.76 (д, J = 8.6 Hz, 2Н), 2.40 - 2.32 (м, 2Н), 1.66 (м, J = 7.4 Hz, 4Н), 1.41 - 1.23 (м, 12Н).

66 мг ω-(4-(4-амино-фенил)-азо-фенил))декановой кислоты (III) и 92 мг пара-толуолсульфокислоты суспендировали в 5 мл ацетонитрила и охлаждали в ледяной бане до 0°С. При перемешивании добавляли водный раствор нитрита натрия (13 мг), затем 78 мг 2-нафтола. Смесь оставляли в бане, затем при комнатной температуре разбавляли 20 мл бензола и промывали 0.1 N НСl и водой. Органический слой сушили над сульфатом натрия, растворитель удаляли на роторном испарителе. Остаток очищали хроматографией в хлороформе на силикагеле 60 (Merck). Получали 40 мг ω-(судан-III)-декановой кислоты (IV). 1Н-ЯМР (CD3OD) δ, м. д.: 8.53 (дд, J = 11.2, 8.0 Hz, 1Н), 8.03 (дд, J = 25.5, 8.7 Hz, 2H), 7.85 (дд, J = 8.3, 4.1 Hz, 2H), 7.83 (дд, J = 25.9, 8.2 Hz, 2H), 7.78 (м, III), 7.61 (м, 1Н), 7.41 (m, 1H), 7.34 (дд, J = 8.0, 5.3 Hz, 2H), 6.78 (дд, J = 12.6, 9.5 Hz, 1H), 2.40 - 2.32 (м, 2H), 1.66 (м, 4H), 1.41-1.23 (м, 12H).

Жирная кислота с флуоресцентной меткой BODIPY

1.4 г монометилового эфира тетрадекановой кислоты V растворяли в 10 мл тионилхлорида и добавляли 10 мкл диметилформамида. Через 5 ч реакционную смесь упаривали на роторном испарителе. Полученный хлорангидрид (VI) растворяли в 20 мл сухого хлороформа и охлаждали до 0°С, при перемешивании прибавляли 1.1 г 2,4-диметилпиррола. К полученному раствору добавляли 2 мл триэтиламина и затем 1.5 мл эфирата трехфтористого бора. Смесь перемешивали еще 4 ч, упаривали на роторном испарителе и хроматографировали на силикагеле 60 (Merck) в градиенте петролейный эфир-хлористый метилен (0 → 20%). Выделяли 500-600 мг метил-13-(4,4-дифтор-1,3-5,7-тетраметил-4-бора-3а,4а-диаза-8-индацин-8-ил)-тридеканоата VII (метиловый эфир o-BODIPY-тридекановой кислоты) в виде красных кристаллов. 1Н-ЯМР (CDCl3) δ, м. д.: 1.25 (14Н, м), 1.48 (м, 2Н), 1.62 (м, 4Н), 2.30 (м, 2Н), 2.41 (с, 6Н), 2.51 (с, 6Н), 2.93 (т, 2Н), 3.67 (с, 3Н), 6.05 (с, 2Н, аром.) Эфир VII омыляли в системе изопропанол-0.1 N КОН, 5:2. Раствор нейтрализовали 0.1 N НСl, упаривали на роторном испарителе и экстрагировали этилацетатом. ω-BODIPY-тридекановую кислоту (VIII) 1-[13-(4,4-дифтор-13,5,7-тетраметил-4-бора-3а,4а-диаза-8-индацен-8-ил)тридеканоил]-2-(10-{[(2-гидроксинафтил-1)азофенил-4]азофенил-4}деканоил)-sn-глицеро-3-фосфохолин (1-ω-ВODIPY-тридеканоил-sn-2-ω-судан-III-деканоил-глицерофосфохолин, BODIPY-ФХ) (XI) 210 мг ω-BODIPY тридекановой кислоты (VIII) растворяли в 2 мл SOCl2 и перемешивали 5 ч при комнатной температуре. Избыток SOCl2 удаляли на роторном испарителе. ~400 мг кадмиевого аддукта глицерофосфохолина (Avanti, США) растворяли в воде и перемешивали со смолой Хелекс-100 (BioRad). Смолу отфильтровывали, раствор упаривали, остаток подвергали лиофильному высушиванию. К полученному глицерофосфохолину (IX) добавляли 250 мг растертого дибутилоксида олова и 10 мл изопропанола. Кипятили 1 ч. После охлаждения добавляли триэтиламин и хлорангидрид ω-BODIPY-тридекановой кислоты. Через несколько часов реакционную смесь разбавили водой и экстрагировали хлороформом. Экстракт упаривали на роторном испарителе и хроматографировали сначала на окиси алюминия в градиенте метанола (0 → 30%) в хлороформе, а затем на обращенной фазе (RP-18, Merck) в системе хлороформ-метанол-вода (1:8:1). Получали 60 мг аморфного оранжево-красного sn-1-ω-BODIPY тридеканоил глицерофосфохолина (X). 1H-ЯМР (CDCl3/CD3OD) δ, м. д.: 1.21 (14H, м), 1.37 (м, 2H), 1.52 (м, 4H), 2.33 (м, 2H), 2.45 (с, 6H), 2.51 (с, 6H), 2.93 (т, 2H), 3.17 (с, 9H), 3.59 (м, 2H), 4.01 (уш. м, 2H), 4.11 (м, 1H), 4.26 (уш. м 2H), 4.35 (м 1H), 5.19 (м, 1H) 6.18 (с, 2H, аром.)

10 мг sn-1-ω-BODIPY тридеканоил глицрофосфохолина (X), 15 мг ω-(судан-III)-декановой кислоты (IV) и 30 мг диметиламинопиридина растворили в 3 мл сухого хлороформа, добавили 50 мкл N,N′-диизопропилкарбодиимида. Перемешивали несколько часов. Смесь профильтровали и выпарили на роторном испарителе. Остаток хроматографировали на силикагеле 60 (Merck) в системе хлороформ-метанол 8:2, получили 12 мг амофного фосфатидилхолина (XI). 1H-ЯМР (CDCl3/CD3OD) δ, м. д.: 1.33 (26H, м), 1.41 (м, 2H), 1.60 (м, 8H), 2.34 (м, 2H), 2.40 (с, 6H), 2.40-2.32 (м, 2H), 2.52 (с, 6H), 2.97 (т, 2H), 3.21 (с, 09H), 3.59 (м, 2H), 4.02 (уш. м, 2H), 4.17 (м, 1H), 4.28 (уш. м 2H), 4.37 (м 1H), 5.19 (м, 1H) 6.15 (с, 2H, аром.), 6.78 (дд, J=12.6, 9.5 Hz, 1H), 7.34 (дд, J=8.0, 5.3 Hz, 2H), 7.41 (м, 1H), 7.59 (м, 1H), 7.76 (м, 1H), 7.83 (дд, J=25.7, 8.3 Hz, 2H), 7.87 (дд, J=8.3,4.1 Hz, 2H), 7.99 (дд, J=25.6, 8.9 Hz, 2H), 8.57 (дд, J=11.3, 8.0 Hz, 1H).

Пример 2. Матрица для получения субстрата фосфолипазы A2 на основе зонда BODIPY-ФХ

Везикулярную фосфолипидную матрицу для включения зонда BODIPY-ФХ, обеспечивающую высокую степень тушения флуоресценции субстрата, с одной стороны, и эффективную работу фосфолипазы - с другой, готовили из смеси фосфатидилхолин - лизофосфатидилхолин - фосфатидилглицерин, 45:45:10 (мольн.). Соотношение зонд - матрица равнялось 1/300 (мольн.). Для приготовления субстрата смешивали соответствующие аликвоты растворов фосфолипидов и зонда BODIPY-ФХ в органических растворителях (смеси хлороформ-метанол), удаляли растворители на роторном испарителе, высушивали при 5 Па не менее 30 мин. К полученной липидной пленке добавляли соответствующее количество буфера (например, 0.1 М Трис-HCl, pH 8.0, 5 мМ CaCl2, 0.1М NaCl). Суспензию обрабатывали на ультразвуковой бане в течение 20-30 мин.

Пример 3. Измерение активности фосфолипазы A2 из пчелиного яда в присутствии сыворотки крови человека

Измерения проведены в 96-луночном планшете на флуоресцентном ридере (Perkin Elmer Fusion Alpha-FP HT Multimode Microplate Reader), настройки ридера соответствуют настройкам для флуоресцеина (ex=485 нм, em=535 нм). Конечный объем образца в лунке 200 мкл, 24 измерения каждые 5 мин.

Общая схема: к 170 мкл субстрата (начальная концентрация зонда 1,069 мкМ) непосредственно перед измерением добавляли 20 мкл сыворотки крови и 10 мкл раствора фосфолипазы A2 пчелиного яда заданной активности. Итого: 200 мкл раствора, 10% (по объему) сыворотки, конечная концентрация зонда 0.909 мкМ (9.09×10-7 М), активность фосфолипазы A2 пчелиного яда от 0.02 до 0.8 ед/мл (всего 8 различных активностей ФЛА2, в трех повторах).

При взаимодействии субстрата с сывороткой крови без добавления фермента наблюдалось увеличение флуоресценции, возможно, из-за реорганизации липидной матрицы и изменений в упаковке молекулы флуоресцентного зонда, либо из-за наличия собственной фосфолипазы A2 (Фиг.1). Для построении калибровочного графика при определении активности ФЛА2 пчелиного яда в присутствии сыворотки учитывали эти изменения. Проводили контрольные измерения фоновой флуоресценции образца и затем вычитали их для каждого времени из полученных значений для добавленной активности фермента. Средние значения (n=3) изменения интенсивности флуоресценции зонда во время ферментативной реакции в сыворотке крови (10%) в зависимости активности добавленной к сыворотке фосфолипазы A2 пчелиного яда приведены на Фиг.2. Значения фоновой флуоресценции F0, полученные из контрольного опыта в сыворотке (Фиг.1), были вычтены из каждого значения для соответствующего времени.

Примечание. Кривые изменения сигнала (Фиг.2) не выходят из нуля, т.к. начало измерения не совпадало с моментом смешения реагентов. На процесс добавления к субстрату плазмы и раствора фермента уходило ~ 1-2 мин после чего планшет помещали в ридер и начинали измерения, в то же время именно в начале ферментативная реакция шла с наибольшей скоростью.

Построение калибровочных графиков для двух временных точек (13 и 33 мин, Фиг.3) подтверждало линейную зависимость интенсивности флуоресценции (после вычитания фона) от активности фермента (f(x) = 5517.99х+441.34 - для 13 минут и (f(x) = 6926.44х+950.16 - для 33 минут).

Пример 4

Применение фосфолипазы А2 пчелиного яда в качестве стандарта.

Общая схема: к 180 мкл субстрата непосредственно перед измерением добавляли 20 мкл сыворотки крови, в несколько лунок вместо сыворотки добавляли по 20 мкл раствора фосфолипазы А2 пчелиного яда заданных концентраций в стандартном растворе альбумина (50 мг/мл - концентрация, моделирующая усредненную сывороточную).

Для оценки активности секФЛА2(IIА) в образцах сыворотки сопоставляли наклоны полученных кривых возрастания флуоресценции с таковыми для различных активностей фосфолипазы А2 пчелиного яда.

Пример 5. Пример измерения активности секФЛА2(IIА) в сыворотке крови человека

Общая схема. Для получения кривых возрастания флуоресценции для разных активностей стандартного раствора фосфолипазы А2 пчелиного яда к 165 мкл субстрата (начальная концентрация зонда 1,1 мкМ) в буфере с 1 мМ ЭДТА непосредственно перед измерением добавляли 20 мкл раствора альбумина (50 мг/мл) и 10 мкл буфера с активностью фермента в интересующем интервале активностей (не менее 3 различных активностей, в 2 повторах), а затем 5 мкл 80 мМ раствора СаСl2 (до конечной концентрации 2 мМ). В данном эксперименте вводили 0.02, 0.06 и 0.1 ед/мл фермента. Итого: 200 мкл раствора, конечная концентрация зонда 0.909 мкМ (9.09 х 10-7 М). Проводили 15 измерений через каждые 5 мин.

Как показано на Фиг.4, сигнал от системы в альбумине со временем практически не изменяется (ок. 2000 RFU, relative fluorescence units); в присутствии фермента сигнал резко возрастает, пропорционально активности ФЛА2 пчелиного яда По оси ординат приведены показания ридера.

Для измерений в образцах сыворотки к 165 мкл субстрата (начальная концентрация зонда 1,1 мкМ) в буфере с 1 мМ ЭДТА непосредственно перед измерением добавляли 20 мкл сыворотки крови и 10 мкл буфера, а затем 5 мкл 80 мМ раствора СаСl2. Итого: 200 мкл раствора, 10% (по объему) сыворотки, конечная концентрация зонда 0.909 мкМ (9.09 х 10-7 М). В данном эксперименте тестировали 4 образца сыворотки. Проводили 15 измерений через каждые 5 мин.

Как видно на Фиг.5, во всех образцах сыворотки система показывает некоторое возрастание флуоресценции. Это свидетельствует о наличии в сыворотках активности секФЛА2(ПА), однако существенно меньшей, чем 0.02 ед/мл.

Важным с точки зрения клинической может быть интервал активностей от 0.001 до 0.01 ед/мл. Судя по Фиг.4, предлагаемая тест-система позволяет надежно детектировать активности секФЛА2(IIА) в несколько раз меньшие, чем 0.02 ед/мл, что необходимо для определения активности секФЛА2(IIА) в клинических условиях.

Таким образом, предложенный зонд и тест-система на его основе позволяют определять активность секФЛА2(IIА) в сыворотке крови человека в клинических условиях

1. Фосфолипидный флуоресцентный зонд следующего названия: 1-[13-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-3а,4а-диаза-s-индацен-8-ил)тридеканоил]-2-(10-{[(2-гидроксинафтил-1)азофенил-4]азофенил-4}деканоил)-sn-глицеро-3-фосфохолин.

2. Тест-система для определения активности фосфолипазы A2 группы IIA (секФЛА2(IIA)) в сыворотке крови, включающая зонд по пункту 1, везикулярную фосфолипидную матрицу для включения зонда, состоящую из фосфатидилхолина, лизофосфатидилхолина и фосфатидилглицерина, буферный раствор и фосфолипазу A2 пчелиного яда в качестве стандарта.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области воздухотехнического оборудования помещений здравоохранения и предназначено для контроля качества воздуха в операционном помещении.

Использование: для применения в мониторинге множества параметров, таких как время, температура, время-температура, оттаивание, замораживание, микроволновое излучение, влажность, ионизирующее излучение, стерилизация и химикаты.

Изобретение относится к созданию структур на основе полупроводниковых нанокристаллов и органических молекул, которые могут быть использованы в качестве микрофлюидных элементов в оптоэлектронных устройствах.

Использование: для испытаний образцов многослойных материалов на прочность к действию рентгеновского излучения (РИ) ядерного взрыва (ЯВ). Сущность: испытываемый образец материала устанавливают на мишень импульсомера, облучают образец потоком электронов по критерию равенства импульса давления, сообщаемого преграде из конструкционного материала действием потока электронов и рентгеновского излучения, и замеряют импульс давления.

Использование: для испытаний образцов многослойных материалов на прочность к действию ударных нагрузок ядерного взрыва, в частности рентгеновского излучения. Сущность: заключается в том, что выполняют предварительное определение толщины сублимированного слоя материала и его удаление, закрепление взрываемой фольги на испытываемый образец, а также неравномерный контактный нагрев материала электронагревателем, разряд через электропроводящую фольгу импульса электрического тока, приводящий к взрыву фольги и нагружению образца механическим импульсом давления от взрывной ударной волны, при этом дополнительно определяют и проводят удаление слоя материала, равного толщине лицевых отколов, а также производят объемный нагрев материала образца КВЧ-излучением и поверхностный - электронагревателем.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования успешности профилактики инфекционных осложнений у недоношенных новорожденных детей в период выхаживания в условиях стационара.
Изобретение относится к медицине и касается способа выделения фракций аутоантител класса IgG к иммунорегуляторному цитокину TNF из сыворотки крови человека с использованием комплекса процедур аффинной хроматографии и процедуры магнитной сепарации, проводимой с использованием магнитных частиц, покрытых стрептавидином, и поликлональных антител к TNF, меченых биотином.

Настоящее изобретение относится к химическому маркеру для скрытой маркировки веществ, материалов и изделий, включающему механическую смесь фталеинов, силикагеля, карбоновой кислоты и низкоокисленного атактического полипропилена, отличающемуся тем, что он дополнительно содержит 3-(3'-метил-4'-гидроксифенил)-3-(4"-гидроксифенил) фталид структурной формулы при следующем соотношении компонентов, мас.%: фенолфталеин - 0,5-28,0; о-крезолфталеин - 14,1-56,5; силикагель - 15,0-25,0; лимонная или щавелевая кислота - 2,0-4,0; низкоокисленный атактический полипропилен - 10,0-16,0; 3-(3'-метил-4'-гидроксифенил)-3-(4"-гидроксифенил) фталид - 8,0-39,3.

Изобретение относится к тестовому датчику аналита, содержащему, по меньшей мере, две подложки, образующие емкость, причем емкость имеет основную область и, по меньшей мере, две, по существу, химически изолированные вторичные зоны анализа, причем основная область, по существу, разделяет эти, по меньшей мере, две, по существу, химически изолированные вторичные зоны анализа; по меньшей мере, один первый рабочий электрод, включающий в себя первый проводник и композицию реагента, размещенный в основной области; по меньшей мере, один первый противоэлектрод, включающий в себя второй проводник и, по меньшей мере, одно первое окислительно-восстановительное вещество, размещенный в первой вторичной зоне анализа; и, по меньшей мере, один второй противоэлектрод, включающий в себя третий проводник и, по меньшей мере, одно второе окислительно-восстановительное вещество, размещенный во второй вторичной зоне анализа, при этом рабочий электрод, первый противоэлектрод и второй противоэлектрод являются независимо адресуемыми.

Изобретение относится к лесном экосистемам, экологии и охране природы. .

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Иммуноферментная тест-система для определения вероятных сроков заражения вирусом иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1), в том числе ВИЧ-1 группы О, в сыворотке (плазме) крови человека.

Изобретение относится к компьютерному способу, использующему биохимические базы данных при разработке новых белковых соединений. Проектирование осуществляется оператором с помощью специально написанной программы PROTCOM на основе использования базы данных пентафрагментов белков.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа выявления O-гликозилированных белков в составе клеточных гомогенатов, подготавливаемых к протеомному и фосфопротеомному анализу.

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Предложено моноклональное антитело и его антиген-связывающие части, которые специфически связывают C-концевую или центральную область фактора ингибирования миграции макрофагов (MIF).

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицинской диагностики. Предложен способ детекции белков в амилоидном состоянии, в котором получают образец лизата культуры дрожжей или ткани млекопитающего, добавляют к образцу ионный детергент, концентрируют белки в амилоидной форме на ацетатцеллюлозной мембране и детектируют их с использованием аптамеров, их конъюгатов или антител, специфичных к амилоидной форме белков.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к иммуноферментным анализам, и представляет собой способ получения инкорпорированных контрольных образцов для иммуноферментных тест-систем для определения инфекций группы TORCH.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для индивидуального подбора препаратов, содержащих пробиотические штаммы лактобактерий, для эффективной интравагинальной терапии.

Группа изобретений относится к составу реагента датчика-анализатора, адаптированного для содействия определению концентрации анализируемого вещества в жидкой пробе, к способам определения концентрации анализируемого вещества в жидкой пробе и к способу нанесения состава реагента датчика анализатора на подложку способом трафаретной печати.
Изобретение относится к микробиологии. Способ культивирования микроводорослей биотопливного назначения включает две стадии альголизации.

Изобретение относится к области элементоорганической химии и касается способа получения В-триаллилборазола (БТАБ). .
Наверх