Способ повышения пролиферативных свойств диплоидных клеток фибробластов человека



Способ повышения пролиферативных свойств диплоидных клеток фибробластов человека
Способ повышения пролиферативных свойств диплоидных клеток фибробластов человека
Способ повышения пролиферативных свойств диплоидных клеток фибробластов человека

 


Владельцы патента RU 2536992:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова" Российской академии медицинских наук (RU)
Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы Научно-исследовательский институт скорой помощи имени Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано в медицине. Способ включает масштабирование диплоидных клеток линии М-20 из криобанка ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН из ампулы банка посевных клеток 7 пассажа с получением банка рабочих клеток 16 пассажа. При этом клетки 20-33 пассажей, пригодные для использования в лечебных и/или диагностических целях, получают путем культивирования в питательной среде, содержащей 10% фибринолитически активной плазмы (ФАП) человека, содержащей тромбоцитарный фактор роста PDGF в концентрации от 155 до 342 пг/мл. Изобретение позволяет повысить пролиферативную активность диплоидных клеток фибробластов человека. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии, медицине, в частности к способу повышения пролиферативных свойств диплоидных клеток фибробластов человека для использования таких клеток в лечебных и диагностических целях, в том числе для определения антивирусной активности интерферонов человека, для заместительной клеточной терапии.

Линии диплоидных клеток человека (ЛДКЧ) обладают неоспоримыми преимуществами перед всеми известными видами клеточных культур своей способностью сохранять в пассажах стабильные биологические и генетические характеристики. Аттестацию ЛДКЧ, предназначенных для производства вакцин, проводят в соответствии с едиными требованиями, разработанными Всемирной организацией здравоохранения [Requirements for Poliomyelitis Vaccine Oral:WHO Expert Committee on biological Standardization: 33 Report WHO. - Geneva, 1983]. Эти рекомендации взяты за основу национальных критериев аттестации вакцинных ЛДКЧ, разработанных ГНИИСиК МИБП им. Л.А. Тарасевича и МЗ СССР [Методические рекомендации «Аттестация перевиваемых клеточных линий - субстратов производства и контроля медицинских иммунобиологических препаратов» РД-42-28-10-89. МЗ СССР. М., 1989. - С. 16]. Аттестованная линия диплоидных клеток человека имеет ограниченный срок жизни и обладает стабильными биологическими, культуральными и генетическими характеристиками, она свободна от контаминантов (бактерий, грибов, микоплазм, вирусов) и не вызывает образования опухолей у иммуносупрессированных животных. Линия диплоидных клеток должна иметь аттестованный банк посевных клеток на ранних уровнях пассажей (до 10 пассажа), состоящий не менее чем из 200 криопробирок. При пассировании посевных клеток из одной или нескольких криопробирок до уровня 16 пассажа получают рабочий банк клеток, из которого могут быть получены необходимые культуры-продуценты для производства или для исследовательской работы. В России и за рубежом существуют всего несколько линий диплоидных клеток человека (Wi-38, MRC-5, М-22 и др.), аттестованных согласно перечисленным требованиям. Аттестованные ЛДКЧ используют при изгототовлении вакцин против полиомиелита, кори, краснухи, бешенства, респираторной и цитомегаловирусной инфекций, а также интерферона [Т.К. Борисова, Л.Л. Миронова, О.И. Конюшко, В.Д. Попова, В.П. Грачев, Н.Р. Шухмина, В.В. Зверев. Отечественные штаммы диплоидных клеток человека - субстрат для производства вакцин. Медицинская вирусология. Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской вирусологии, посвященной 100-летию М.П. Чумакова». М. 2009. Том XXVI. С. 305-307; Л.Л. Миронова, В.Д. Попова, О.И. Конюшко. Опыт создания банка авторских линий перевиваемых клеток и их применение в вирусологической практике. Биотехнология. 2000, с. 41-47]. ЛДКЧ широко применяются in vitro для диагностики вирусных инфекций, анализа токсичности различных препаратов и изделий, для заместительной терапии [Патент РФ №2373944, 23.06.2008. Способ лечения ожоговой раны. А.С. Ермолов, С.В. Смирнов, В.Б. Хватов, Л.Л. Миронова; С.В. Смирнов, В.Б. Хватов. Инновационные технологии местного лечения ожогов в НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского. В книге: Новая экономика. Инновационный портрет России. М., Центр стратегического партнерства, 2009. С. 388-390].

В ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН в 80-х годах 20 века было установлено несколько линий диплоидных клеток из кожи и мышц 8-10 недельных эмбрионов человека. Настоящая работа посвящена модификации производства диплоидных клеток человека для диагностических целей и заместительной клеточной терапии, а именно получению диплоидных клеток фибробластов человека с повышенными пролиферативными свойствами.

Прототип. Патент РФ №1440029 от 22.03.93 г. [Миронова Л.Л., Преображенская Н.К., Соловьева М.Н., Орлова Т.Г. Стобецкий В.И., Крючкова Г.П., Кармышева В.Я., Кудинова С.И., Попова В.Д., Алпатова Г.А. ИПВЭ и НИИЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи. Штамм диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека, используемый в качестве тест-системы для определения антивирусной активности интерферонов человека и размножения вирусов].

Этот штамм ЛДКЧ обозначен М-21, однако культура фибробластов М-21 обладала недостаточной пролиферативной активностью, что снижало время образования монослоя и повышало расход клеток и материалов, и это, в конечном итоге, привело к полному истощению ее запасов. В результате возникла необходимость в новой клеточной линии, пригодной для определения антивирусной активности интерферонов человека и других медико-биологических целей, более экономически выгодной, отличающейся высокой пролиферативной активностью, имеющей банки посевных и рабочих клеток. Эта линия обозначена М-20. На уровне 7 пассажа изготовлен банк посевных клеток. В 2012 году из ампулы банка 7 пассажа изготовлен банк рабочих клеток на уровне 16 пассажа. Банки посевных и рабочих клеток на уровнях 7 и 16 пассажей хранятся в ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН и позволяют обеспечить как производственные процессы, так и научные исследования.

Отличием настоящего изобретения от ближайшего аналога (прототипа) является повышение пролиферативной активности клеток линии М-20 при использовании 10% фибринолитически активной плазмы (ФАП).

Таким образом, объектом изобретения является способ повышения пролиферативных свойств диплоидных клеток фибробластов человека для медико-биологических целей посредством культивирования клеток из криобанка ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН, в котором используют диплоидные клетки охарактеризованной линии М-20, которые масштабируют из ампулы банка посевных клеток 7 пассажа и получают банк рабочих клеток 16 пассажа, при этом клетки 20-33 пассажей, пригодные для использования в лечебных и/или диагностических целях, получают путем культивирования в питательной среде, содержащей 10% фибринолитически активной плазмы (ФАП) человека. При культивировании клеток используют, предпочтительно, питательную среду ДМЕМ с 10% ФАП.

Диплоидные клетки человека охарактеризованной линии М-20, получаемые вышеуказанным способом, обладают высокой пролиферативной активностью и пригодны для использования в лечебных и/или диагностических целях.

Схема осуществления способа:

1. Используется одна криопробирка из банка посевных клеток 7 пассажа ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН

2. Приготовление банка рабочих клеток на уровне 16 пассажа ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН

3. Восстановление фибробластов линии М-20 из банка рабочих клеток 16 пассажа (ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН).

4. Получение монослойной культуры фибробластов линии М-20, 17 пассаж.

5. Восстановление биологических свойств фибробластов линии М-20 путем трехкратного пассирования (до 20 пассажа включительно) для репарации возможных повреждений ДНК в процессе криоконсервирования.

6. Получение культур клеток для диагностических целей и заместительной клеточной терапии тиражированием фибробластов линии М-20 с 20 по 33 пассаж с использованием питательной среды, содержащей 10% фибринолитически активной плазмы (с содержанием PDGF от 155 до 342 пг/мл).

Предлагаемый способ обеспечивает получение клеток, обладающих высокой пролиферативной активностью и пригодных для использования в диагностических и/или лечебных целях.

Данный технический результат достигается культивированием фибробластов человека линии М-20 в питательной среде с добавлением 10 % фибринолитически активной плазмы (ФАП), обладающей ростстимулирующим действием и обеспечивающей усиление пролиферативной активности культуры клеток.

ФАП - клинически используемая трансфузионная среда, которую получают из крови внезапно умерших от инфаркта миокарда, острой сердечной недостаточности, кровоизлияния в головной мозг, в первые 6 часов после смерти [приказ МЗ СССР №482 от 14.06.1972 года «Об улучшении обеспечения лечебно-профилактических учреждений и клиник трупными тканями, костным мозгом и кровью»]. Посмертная кровь является полноценной трансфузионной средой, имеющей ряд биологических свойств - в первую очередь повышенный фибринолитический потенциал. В этой связи посмертную кровь предложено также называть фибринолизной. Основные показания к переливанию посмертной крови: острая кровопотеря, шок, анемия различного происхождения, ожоговая травма, обменное замещение при экзогенных отравлениях, заполнение АИКа при использовании экстракорпорального кровоообращения в хирургии [Е.Г. Цуринова. Переливание фибринолизной крови. М., 1960, 159 с; С.В. Рыжков. Заготовка и возможности использования фибринолизной крови в зависимости от срока взятия и причины смерти. Автореф. докт. дисс. Л., 1968, 21 с.; Г.А. Пафомов. Биологическая характеристика крови внезапно умерших и ее использование в хирургической практике. Дисс. докт. мед. Наук. М., 1971, 355 с.; К.С. Симонян, К.П. Гутионтова, Е.Г. Цуринова. Посмертная кровь в аспекте трансфузиологии. М., Медицина, 1975, 271 с.]. В настоящее время используются компоненты посмертной крови: фибринолитически активная плазма, эритроцитная масса, лейкоцитная масса, тромбоцитная масса [Г.Я. Левин. Гемокоагуляционные свойства и клиническое применение плазмы и тромбоцитов кадаверной крови. Автореф. докт. дисс. М., 1978, 31 с; В.Б. Хватов. Препараты фибринолитического и антипротеназного действия из плазмы крови внезапно умерших людей. Дисс. докт. мед наук, 1984, 417 с.; V.B. Khvatov Plasmakinase - a new thrombolytic preparation from postmortem plasma In: Thrombosis and Thrombolysis edd. E.I. Chazov, V.V. Smirnov). Consultants Bureau, N.Y., L, 1986, p. 283-310; В.Б. Хватов. Медико-биологические аспекты использования посмертной крови. Вестник АМН СССР, 1991, 9. С. 18-24; В.Б. Хватов. Трупная кровь - история и современное состояние вопроса. Пробл. гематол. и перелив. крови, 1997, 1. С. 51-59]. Компоненты трупной крови, получаемые от доноров органов, также получили клиническое применение [погибший индивидуум с бьющимся сердцем согласно “Инструкции по констатации смерти человека на основании диагноза смерти мозга» от 20.12.2001 г. №460, регистрация Минюста №3170 от 17 января 2002]. Трансплантация органов, тканей и клеток осуществляется согласно Закону РФ «О трансплантации органов и (или) тканей человека» - в ред. Федеральных законов от 20.06.2000 №91-Ф3, от 16.10.2006 №160-Ф3; В.Б. Хватов, С.В. Журавель, В.А. Гуляев, Е.Н. Кобзева, М.С. Макаров. Биологическая полноценность и функциональная активность клеточных компонентов крови доноров органов. Трансплантология, 2011, 4, с. 13-19; Хубутия М.Ш., Хватов В.Б., Гуляев В.А. и др. Способ компенсации глобулярного объема крови и иммуномодулирующего воздействия при трансплантации. Патент РФ на изобретение №2452519, опубл. 10.06.2012, бюл. №16].

Фибринолитически активную плазму получают из крови внезапно умерших людей, заготовленной на консерванте Глюгицир (соотношение кровь: консервант 4:1) для сохранения ее фибринолитически активных свойств. Отделение плазмы от клеточных элементов крови производят в стерильном боксе с соблюдением всех правил асептики и антисептики и аналогично получению донорской плазмы из консервированной донорской крови. Клиническое использование ФАП в хирургии и травматологии выявило эффект стимуляции заживления ран [И.Ю. Клюквин, М.В. Звездина, В.Б. Хватов, Ф.А. Бурдыга. Способ лечения укушенных ран. Патент на изобретение РФ №2372927, опубл., 20.11.2009, бюлл. №32]. Этот эффект мы связывали с присутствием ростстимулирующих факторов в ФАП, выделяемых активированными тромбоцитами. В дальнейшем в ФАП нами идентифицирован тромбоцитарный фактор роста (PDGF). Ростстимулирующее действие ФАП в культуре клеток человека показано в специальных исследованиях. В клеточную суспензию фибробластов человека линии М-20, содержащую известное количество клеток, добавляли исследуемые образцы ФАП в 10% концентрации и по 10 мл полученной смеси помещали в культуральные флаконы с площадью ростовой поверхности 25 см2. Клетки выращивали в течение 3-4 суток при содержании в атмосфере 5% CO2 и при 37°C. После 3-кратного пассирования проводили подсчет выросших клеток в камере Фукс-Розенталя и определяли отношение числа выросших клеток к числу посаженных - индекс пролиферации (в таблице 1).

Из проведенных опытов следует, что ростовые свойства ФАП обеспечивают высокую пролиферативную активность и не отличаются от таковой эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. При этом ФАП содержит ростовые факторы тромбоцитов человека, т.е. аллогенного типа, в отличие от эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота - ксеногенного типа. Этот факт является определяющим при трансплантации клеток при заместительной терапии. Отметим, что ростстимулирующее действие на культуру клеток линии М-20 обусловлено, в частности, наличием в ФАП PDGF в концентрации от 155 до 342 пг/мл. Эти данные получены с помощью набора реагентов «Qantikine, Human PDGF-BB Immunoassay» фирмы «R & D Systems» и системы «Multiskan ascent» фирмы «Thermo». Концентрация PDGF-BB в ФАП сходна с его содержанием в сыворотке крови. Так в сыворотке доноров крови и обследованных пациентов содержание PDGF составило от 110 до 880 пг/л, в среднем 244 пг/мл, тогда как в плазме содержание PDGF варьировало от 0-2 пг/мл.

Для лучшего понимания предлагаемого технического решения «производство диплоидных клеток человека линии М-20 для медико-биологических целей» приводим следующий пример.

Клетки линии М-20 16 пассажа восстанавливают из рабочего банка. Для этого криопробирку с клетками извлекают из жидкого азота и помещают в водяную баню при температуре 38°C и после оттаивания содержимое переносят в культуральный сосуд с питательной средой ДМЕМ, содержащей 10% ФАП (с содержанием PDGF от 155 до 342 пг/мл), добавляют антибиотик гентамицин из расчета 1 мл 4% раствора на 1 л питательной среды. Для формирования монослоя клетки культивируют в течение 4-5 суток при 37°C и содержании CO2 в атмосфере 5%. После формирования монослоя клеток проводят 3 последовательных пассажа, необходимых для репарации ДНК после криоконсервирования. Затем проводят тиражирование клеток с 20 по 33 пассаж. Клетки этих пассажей предназначены для медико-биологических целей. Полученная линия клеток подробно охарактеризована в соответствии с требованиями ВОЗ и ГНИИСиК МИБП им. Л.А. Тарасевича, включая HLA-типирование клеток линии М-20, а также проведено изучение ее цитокинового спектра. Приводим сравнительную характеристику свойств линии М-20 и линии М-22 (таблица 2). Линия М 22 (диплоидные фибробласты человека) лицензирована в качестве вакцинного субстрата и разрешена для производства любых видов медицинских вирусных вакцин, а также применена для лечения ожоговых ран II-IIIA степени [Патент РФ на изобретение №2373944, 23.06.2008. Способ лечения ожоговой раны. А.С. Ермолов, С.В. Смирнов, В.Б. Хватов, Л.Л. Миронова, О.И. Клнюшко, Е.А. Жиркова, B.C. Бочарова].

Линия М-20 установлена в ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН в 1986 году из кожи и мышц 10-недельного эмбриона человека, полученного в результате аборта от здоровой женщины. Онкологических, венерических заболеваний, гепатита, туберкулеза в анамнезе не обнаружено; генетических и врожденных заболеваний в семье не наблюдалось. Среда культивирования клеток ДМЕМ с добавлением 10% ФАП. Коэффициент рассева 1:3-1:4 дважды в неделю при посевной дозе клеток 7×104 кл/мл. Клеточный монослой состоит из ориентированных однородных веретеновидных клеток с овальными ядрами, содержащими 1-3 ядрышка и мелкие глыбки хроматина. В жизненном цикле линии можно выделить 3 фазы развития: становление 1-3 пассажи, активный рост 4-40 и старение 41-52, затем наступала гибель. Клетки линии имеют кариотип человека 2т=46, ХУ. Линия характеризуется высокой генетической стабильностью: 93,3-96,9% клеток имеют диплоидный набор хромосом, клеток с полиплоидным набором не более 1,6%. Пробелов и разрывов, а также кольцевых хромосом не наблюдали. Количество полос изоэнзимов Г-6ФДЕ и ЛДЕ и их электрофоретическая подвижность совпадают с таковыми для эритроцитов человека. Г-6ФДГ медленного типа. При посеве на селективные питательные среды контаминации бактериями, грибами, микоплазмами не обнаружено. Кроме этого контаминации микоплазмами не выявлено при окраске ДНК-флуорохромами Hochst 33258 и оливомицином, а также методом ПЦР. Контаминации вирусами в опытах на сосунках и взрослых белых мышах, морских свинках, кроликах и куриных эмбрионах, а также на гомологичных и гетерологичных культурах клеток не обнаружено. Контроль туморогенности. При введении клеток линии иммунодепрессированным животным опухоли не образовывались. Обратной транскриптазы не обнаружено. HLA-маркеры: Класс I: A*(02.03)/B*(07.40)/CW*(03.07). Класс II: DRB1*(15.16)/DQB1*(05.06). Клетки линии М-20 на уровне 20 пассажа продуцируют мРНК α-интерферона (ИФНα) и интерлейкинов: ИЛ1β, 2, 4, 6, 8, 10, 18.

Таким образом, предлагаемая линия является диплоидной - обладает ограниченным сроком жизни, сохраняет кариотип нормальных клеток человека на протяжении всей жизни, свободна от контаминантов и не обладает онкогенными потенциями. Она охарактеризована на безопасность в соответствии с рекомендациями ВОЗ и требованиями ГНИИСиК МИБП им. Л.А. Тарасевича. В ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН имеются банки посевных и рабочих клеток, способные обеспечить все потребности производства и научных исследований. Клетки линии М-20 чувствительны к заражению различными вирусами. Дополнительно изучен цитокиновый спектр линии М-20. Знание цитокинового спектра клеток позволяет более точно оценивать результаты при определении интерферонового статуса больных и давать обоснованные рекомендации по применению лечебно-профилактических препаратов.

Диплоидные клетки человека - фибробласты штамма М-20 с повышенной пролиферативной активностью, получаемые предлагаемым способом, могут быть использованы для диагностических целей, в частности для определения активности интерферона (ИФН) в сыворотке крови человека, а также в лечебных целях, например для местного лечения пролежней, укушенных ран, длительно не заживающих и ожоговых ран.

1. Способ повышения пролиферативных свойств диплоидных клеток фибробластов человека, отличающийся тем, что диплоидные клетки охарактеризованной линии М-20 из криобанка ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН масштабируют из ампулы банка посевных клеток 7 пассажа и получают банк рабочих клеток 16 пассажа, при этом клетки 20-33 пассажей, пригодные для использования в лечебных и/или диагностических целях, получают путем культивирования в питательной среде, содержащей 10% фибринолитически активной плазмы (ФАП) человека, содержащей тромбоцитарный фактор роста PDGF в концентрации от 155 до 342 пг/мл.

2. Способ по п.1, в котором при культивировании клеток используют питательную среду ДМЕМ с 10% ФАП.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточной продукции рекомбинантных белков, и может быть использовано для получения рекомбинантного фактора VIII.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к применению клеток плацентарного перфузата человека в получении лекарственного средства для подавления пролиферации опухолевых клеток у индивида.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и онкологии. Способ предусматривает: а) выделение постнатальных тканеспецифичных мультипотентных аутологичных стволовых клеток (АСК) и/или аутологичных прогениторных клеток (АПК) для их последующего протеомного и полнотранскриптомного анализов; б) выделение АСК и/или АПК и/или мультипотентных аллогенных HLA-гаплоидентичных стволовых клеток (HLA-CK) для последующего ремоделирования их протеомного профиля; в) выделение РСК из опухоли пациента; г) протеомный анализ АСК и/или АПК и РСК; д) полнотранскриптомный анализ АСК и/или АПК и РСК; е) определение набора белков, каждый из которых содержится в протеомных профилях как АСК и/или АПК, так и РСК; ж) анализ ранее определенного набора белков для идентификации в РСК внутриклеточных сигнальных путей, не подвергшихся неопластической трансформации в результате канцерогенеза, и определения белков-мишеней, являющихся мембранными акцепторами идентифицированных сигнальных путей; з) анализ полнотранскриптомного профиля экспрессии генов РСК и подтверждение сохранности и функциональной значимости структурных компонентов идентифицированных сигнальных путей в РСК; и) определение белков-лигандов, способных активировать белки-мишени; к) сравнительный анализ полнотранскриптомных профилей АСК и/или АПК с транскриптомными профилями, содержащимися в известных базах данных транскриптомов, для определения пертурбогенов, способных модифицировать профиль экспрессии генов АСК и/или АПК и/или HLA-CK, выделенных для ремоделирования их протеомного профиля, в направлении секреции ранее определенных белков-лигандов; л) ремоделирование протеомного профиля АСК и/или АПК и/или HLA-CK пертурбогенами с получением модифицированного транскриптомного профиля различных клеточных систем, способных оказывать регуляторное воздействие на РСК пациента.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано в медицине. Популяцию мононуклеарных клеток или неэмбриональных стволовых клеток, обогащенную клетками моноцитарной линии дифференцировки, содержащей промоноциты, применяют для лечения ишемии у субъекта.

Изобретение относится к области биотехнологии и клеточной технологии. Заявленное изобретение направлено на создание плюрипотентных, мультипотентных и/или самообновляющихся клеток, которые способны начать дифференцироваться в культуре в различные типы клеток и способны к дальнейшей дифференцировке in vivo.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для отбора сперматозоидов в методах вспомогательных репродуктивных технологий. Способ предусматривает размещение в чашке Петри капли спермы и капли культуральной среды на расстоянии друг от друга не более 5 см, соединение капель полосой из вязкой среды с параметрами вязкости 1-4 Па·с, затем инкубируют чашку с содержимым в течение 30-90 мин в условиях, моделирующих естественную среду цервикального канала женского репродуктивного тракта.

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии и клеточных технологий. Способ дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток, представляющих собой линию клеток человека, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, включает обработку плюрипотентных стволовых клеток средой, отличающейся тем, что она не содержит активин А и содержит GDF-8, в течение периода времени, достаточного для того, чтобы плюрипотентные стволовые клетки дифференцировались в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены варианты олигопептида, выделенные из белка RAB6KIFL (KIFL20A), которые способны индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) в составе комплекса с молекулой HLA-A*0201.

Изобретение относится к области пищевой промышленности и представляет собой способ пивоварения, включающий добавление к суслу термостабильной протеазы после фильтрации сусла, но перед варкой сусла, причем термостабильность протеазы означает, что активность этой протеазы составляет по меньшей мере 70% ее активности, измеренной согласно следующему методу: протеазу разводят до концентрации 1 мг/мл в аналитическом буфере, содержащем 100 ммоль сукциновой кислоты, 100 ммоль HEPES, 100 ммоль CHES, 100 ммоль CABS, 1 ммоль СаСl2, 150 ммоль КСl, 0,01% Тритон Х-100, и с рН, доведенным до 5,5 с помощью NaOH; после чего протеазу преинкубируют i) во льду и ii) 10 мин при 70°С; субстрат, к которому протеаза проявляет активность, суспендируют в 0,01% Тритоне Х-100: для начала реакции в пробирку добавляют 20 мкл протеазы и инкубируют в термомиксере Эппендорфа при 70°С, 1400 об/мин в течение 15 минут; реакцию останавливают помещением пробирок в лед; образцы центрифугируют холодными при 14000 g в течение 3 минут и измеряют оптическую плотность OD590 супернатанта; полученное значение OD590 образцов без протеазы вычитают из полученного значения OD590 образцов, обработанных протеазой; определяют термостабильность протеазы посредством расчета процентной активности протеазы в образцах, преинкубированных при 70°С, относительно активности протеазы в образцах, инкубированных во льду, как 100%-ной активности.

Изобретение относится к области клеточной биологии, клеточной трансплантологии и тканевой инженерии. Способ повышения ангиогенной активности стромальных клеток жировой ткани в тканях и органах включает выделение стромальных клеток жировой ткани, культивирование выделенных клеток в присутствии фактора некроза опухолей-альфа в количествах 5 или 100 нг/мл в течение 24-72 часов с последующим трансплантированием в ткани или органы.

Изобретение относится к области клеточной биологии, клеточной трансплантологии и тканевой инженерии. Способ повышения ангиогенной активности стромальных клеток жировой ткани в тканях и органах включает выделение стромальных клеток жировой ткани, культивирование выделенных клеток в присутствии фактора некроза опухолей-альфа в количествах 5 или 100 нг/мл в течение 24-72 часов с последующим трансплантированием в ткани или органы.

Изобретение относится к области биотехнологии, клеточным технологиям и тканевой хирургии. Способ получения культуры гладкомышечных клеток заключается в том, что вырезают фрагмент кровеносного сосуда, измельчают его на кусочки до размеров не более 2 мм в любом измерении и инкубируют кусочки в культуральном флаконе с предварительно нанесенными на дно флакона царапинами, содержащем среду для культивирования, содержащую 10% эмбриональной фетальной сыворотки, в течение по меньшей мере 10 дней, но не более 24 дней, при температуре 37°С в условиях СО2-инкубатора, отличающийся тем, что упомянутым фрагментом кровеносного сосуда является фрагмент восходящего отдела грудной аорты, вырезаемый в ходе процедуры аортокоронарного шунтирования, а упомянутые кусочки фрагмента восходящего отдела грудной аорты перед инкубированием выдерживают в среде для культивирования, содержащей 0,1% коллагеназы, в течение по меньшей мере 30 минут, но не более 60 минут, при температуре 37°С, после чего промывают средой для культивирования клеток.

Настоящее изобретение касается способа размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток. Описанный способ включает стадии: культивирование плюрипотентных клеток и обработку плюрипотентных клеток ингибитором активности фермента GSK-3B, где указанный ингибитор представляет собой 3-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индол-3-ил]-4-(1-пиридин-3-ил-1H-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион.

Изобретение относится к области генетической инженерии, тканевых технологий и медицины. Способ получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных линий стволовых клеток человека включает получение эмбриоидных телец из плюрипотентных стволовых клеток человека, прикрепление эмбриоидных телец к чашке Петри для индукции спонтанной дифференцировки эмбриоидных телец в мезенхимальные стволовые клетки, культивирование с пролиферацией мезенхимальных стволовых клеток при сохранении идентичности мезенхимальных стволовых клеток, и где индукция спонтанной дифференцировки стадии происходит путем формирования петель аутологичного цитокина без добавления внешнего цитокина, также соответствующие клетки, их применение, набор и способ культивирования.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биохимии и медицины. Предложена композиция для индукции миграции стволовых клеток жировой ткани взрослых, которая содержит в качестве активного ингредиента человеческие мезенхимальные стволовые клетки из жировой ткани взрослых в количестве от 1х107 до 1х1010, которые экспрессируют на клеточной поверхности рецептор хемокина или фактора роста, или секреторный продукт из этих стволовых клеток включает рецептор хемокина или фактора роста; где секретируемый продукт стволовых клеток жировой ткани взрослых представляет собой адипонектин; и где человеческие стволовые клетки жировой ткани взрослых подвергаются первичному воздействию смесью, содержащей хемокин или фактор роста.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Предложен способ экспансии мононуклеарных клеток пуповинной крови (пкМНК) ex vivo в присутствии мультипатентных мезенхимальных клеток (ММСК), включающий культивирование ММСК из стромально-васкулярной фракции жировой ткани до достижения монослоя при концентрации O2 в среде 5%, добавление суспензии пкМНК к монослою ММСК, культивирование в течение 72 часов при концентрации O2 в среде 5%, отбор неприкрепленных пкМНК и замену среды, продолжение культивирования ММСК с прикрепившимися к ним пкМНК в течение 7 дней при концентрации O2 в среде 5%.
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложена композиция, содержащая стволовые клетки из амниотической жидкости человека с фенотипом CD73+/CD90+/CD105+/CK19+, питательную среду, эритропоэтин, эпидермальный фактор роста и коллаген, взятые в эффективном количестве.
Изобретение относится к области медицины и клеточных технологий. Предложен клеточный продукт, содержащий популяцию протоковых стволовых клеток подчелюстной слюнной железы, характеризующихся фенотипом CD49f+/EpCAM+ и после обработки вальпроевой кислотой в концентрации 0,1-40 мМ и культивирования в коллагеновом геле меняющих профиль экспрессии на 1AAT+/PEPCK+/G6P+/TDO+/CYP Р4503А13+, а также приобретающих способность синтезировать мочевину и альбумин.

Изобретение относится к области биотехнологии, клеточной и тканевой инженерии. Описан способ получения резидентных стволовых клеток сердца млекопитающего, экспрессирующих поверхностные маркеры c-kit, и/или sca-1, и/или MDR1, в ходе которого выделяют образцы ткани миокарда, измельчают их, обрабатывают коллагеназой и трипсином, проводят культивирование на культуральной чашке с покрытием из фибронектина методом эксплантной культуры измельченных образцов с последующей иммуноселекцией.

Изобретение относится к области биохимии, биотехнологии и медицины. Предложен N-концевой фрагмент растворимого супрессора иммунного ответа длиной в 21 аминокислоту, имеющий последовательность аминокислот по Seq ID NО: 1, позволяющий стимулировать образование регуляторных Т-лимфоцитов, а также способ стимуляции образования регуляторных Т-лимфоцитов N-концевым фрагментом растворимого супрессора иммунного ответа с Seq ID NО: 1, при введении его в концентрации 0,1-50 мкг/мл.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой дерматологический крем, предназначенный для местного лечения бактериальных инфекций кожи и для заживления связанных с ними ран, содержащий фрамицетина сульфат и биополимер, включенные в кремовую основу, которая содержит по крайней мере одно вещество из каждой следующей группы: консервант; первичный и вторичный эмульгатор, выбранные из группы, содержащей кетостеариловый спирт, кетомакрогол 1000, полисорбат-80 и Span-80; парафин в качестве воскообразного продукта; совместный растворитель, выбранный из группы, включающей пропиленгликоль, гексиленгликоль и полиэтиленгликоль-400; азотную кислоту или молочную кислоту и воду, а указанный биополимер предпочтительно является хитозаном.
Наверх