Способ получения фикоэритрина из красной микроводоросли



Способ получения фикоэритрина из красной микроводоросли

 


Владельцы патента RU 2548111:

Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского (RU)

Способ получения фикоэритрина из красной микроводоросли относится к биотехнологии и предназначен для получения натурального пигмента из микроводоросли в лабораторных и промышленных условиях. Практическое значение изобретения связано с возрастающими потребностями медицинской, пищевой й косметической отраслей в натуральных нетоксичных красителях и биомаркерах

В способе, включающем в себя отделение биомассы микроводоросли от культуральной среды, промывание биомассы, разрушение клеточных стенок, водную экстракцию пигмента, консервацию конечного продукта, отбор биомассы проводят на линейной стадии роста или в режиме квазинепрерывной культуры. Способ включает отделение биомассы от культуральной среды, промывание биомассы, разрушение клеточных биомембран, водную экстракцию. Изобретение позволяет упростить и снизить себестоимость готового продукта и получить препарат, пригодный для использования в пищевой и косметической промышленности.

 

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для получения натурального пигмента фикоэритрина из микроводорослей в лабораторных и промышленных условиях.

В последнее время возрос интерес к использованию нетрадиционных источников сырья для получения натуральных красителей, так как многие синтетические красители токсичны. К таким перспективным пищевым красителям можно отнести и фикоэритрин, содержащийся в красных морских водорослях. Этот красный пигмент абсолютно нетоксичен, имеет белковую природу и ярко выраженную оранжевую флуоресценцию, что открывает широкие перспективы для его использования в пищевой, косметической и медицинской промышленности.

Морские красные водоросли, такие как филлофора, грацилярия, лауренция, гелидиум и др., возможно использовать для получения фикоэритрина., однако, в Чёрном море запасы их ограничены и неуклонно сокращаются. Выращивание в промышленной культуре ограничивается невысокими скоростями роста макрофитов. а также сезонностью в динамике биохимического состава и накопления биомассы.

Все известные способы выделения фикоэритрина из биомассы водорослей, как правило, включают в себя комбинацию различных методов очистки, таких как: осаждение сульфатом аммония, диализ, ионообменную хроматографию и на гидроксиапатите, электрофорез на сульфополиакриламидном геле и др. Данные методы позволяют получить препарат очень высокой чистоты (которая не требуется для целей пищевого использования фикоэритрина), но они малопроизводительны, требуют сложного специального дорогостоящего оборудования (промышленные колонки, насосы, детекторы, градиентные смесители), что в итоге приводит к значительному удорожанию продукта.

Известен Способ получения фикоэритрина с высокой оптической плотностью (см. Пат. №2315094, РФ, МПК C12N 1/12). В способе пигмент фикоэритрин получают экстрагированием из водорослей, выбранных из группы Galaxaura oblongata, Halymenia ceulanica, Helminthocladia australis. Водоросли выращивают до стадии образования колоний, затем собирают и фильтруют. Профильтрованные водоросли сушат, измельчают в порошок, добавляют в раствор с уровнем рН в пределах 5-10. После центрифугирования получают раствор пигмента, а затем, путем добавления 20-30% насыщенного раствора (NH4)2S04 неочищенный фикоэритрин. Для получения неочищенного фикоэритрина с высокой оптической плотностью добавляют 60-65% насыщенный раствор (NH4)2S04. Осажденный неочищенный фикоэритрин дополнительно очищают методом гель-хроматографии или ультрафильтрации. К недостаткам способа следует отнести трудоемкость и дороговизну.

В основу изобретения Способ получения фикоэритрина из красной микроводоросли поставлена задача путем максимального упрощения технологического процесса обеспечить снижение себестоимости готового продукта, получить водный экстракт препарата как пищевой краситель.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения фикоэритрина из микроводорослей красную микроводоросль Porphyridium purpurewn культивируют в условиях естественного или искусственного освещения, барботирования газовоздушной смесью с 3% СО2, с применением питательной среды по Тренкеншу и квазинепрерывного режима культивирования. Отбор биомассы осуществляют при ежедневном обмене. Для разрушения биомембран 6-5-9 раз проводят процедуру «замораживание-оттаивание». Затем экстрагируют водным буферным раствором с рН 7-7,5 в соотношении 1:3 в течение 24 часов при 3-5°С в отсутствии света. К полученному водному раствору пигмента добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 20% для последующего хранения.

Предполагаемое изобретение поясняется иллюстрациями. На фиг.1 - Спектр поглощения В-фикоэритрина, выделенного из красной микроводоросли Porphyridium purpureum.

Красная микроводоросль Porphyridium purpureum вызывает большой интерес у исследователей как источник разнообразных биологически ценных веществ. Биомасса Porphyridium purpureum, выращенная в интенсивных условиях, является источником широкого спектра биологически активных веществ, таких как: фотосинтетические пигменты (хлорофилл-a, каротиноиды, В-фикоэритрин), внеклеточные сульфополисахариды и ненасыщенные жирные кислоты, в том числе арахидоновая и эйкозапентаеновая кислоты. Фикоэритрин - белоксодержащий комплекс, входящий в состав фотосинтезирующих пигментных комплексов красных водорослей. Из красной одноклеточной водоросли Porphyridium purpureum выделены два ФЭ: В-ФЭ и b-ФЭ, последний отличается от предыдущего меньшей долей коротковолнового поглощения. Количество фикоэритрина в водоросли Porphyridium purpureum может достигать 50% от общей суммы ФБП. Соотношение ФБП в Porphyridium purpureum (В-ФЭ - 84%, R-ФЦ - 11%, АФЦ - 25%). Изобретение реализуется следующим образом:

1. Интенсивное культивирование микроводоросли Porphyridium purpureum в условиях роста, оптимальных для накопления фикоэритрина

Культивирование микроводоросли может проводиться в квазинепрерывном и накопительном режимах, однако, в условиях, исключающих лимитирование по азоту и углероду. В случае накопительного культивирования отбор биомассы осуществляется на линейной стадии роста, а при квазинепрерывном - ежедневно при осуществлении обмена среды. В таком случае количество внеклеточных полисахаридов, препятствующих разрушению клеточных стенок, минимально. Наиболее благоприятные условия для накопления фикоэритрина при лабораторном культивировании: температура - 26°С, освещенность - 40 Вт/м2 -сек, барботаж газовоздушной смесью с 3% СО2, питательная среда Тренкеншу, при промышленном: температура - 18-28°С, освещенность - естественная, барботаж газо-воздушной смесью с 3% СО2, питательная среда по Тренкеншу.

2. Отделение биомассы водоросли от культуральной среды

Отделение биомассы микроводоросли от культуральной среды осуществляется несколькими способами: сепарированием, центрифугированием или с использованием естественных гравитационных сил (отстаивание культуры микроводоросли в течение 2-х часов). Первые два метода достаточно энергоёмки, но дают возможность эффективно отделить биомассу от культуральной среды. Учитывая, что клетки микроводоросли Porphyridium purpureum объединены в конгломераты и легко осаждаются при отстаивании, возможно использовать третий способ для снижения себестоимости конечного продукта.

3. Промывание биомассы Porphyridium purpureum

Для удаления солей биомасса заливается водой в количестве эквивалентном объему слитой культуральной жидкости. Для удаления жидкости используются методы, описанные в п. 2.

4. Разрушение клеточных стенок Porphyridium purpureum

Полнота экстракции В-фикоэритрина водным буфером зависит от степени деструкции клеточных оболочек. На сегодняшний день существует большое количество методов разрушения клеточных оболочек. Одним из наиболее простых является чередование циклов замораживания-оттаивания. Однако, однократного цикла не достаточно для полного разрушения клеточных оболочек красной микроводоросли Porphyridium purpureum. При этом длительность нахождения в замороженном состоянии и объем растворителя не являются определяющими. С другой стороны, большое количество заморозок является нецелесообразным с точки зрения трудо- и энергозатрат. При отборе биомассы на линейной стадии роста (или квазинепрерывная культура) достаточно шести циклов для разрушения основного количества биомембран и последующего извлечения большей части фикоэритрина. Девяти циклов достаточно для разрушения всех биомембран и для количественного определения фикоэритрина.

5. Экстрагирование пигментов из биомассы клеток

Экстракция проводится водным буферным раствором с рН 7-7,5 (в соотношении 1:3) в течение 24 часов на холоде в темноте; данные условия способствуют стабилизации химической структуры фикоэритрина. 6. Отделение экстракта от балластных веществ. Отделение экстракта пигмента от примесей проводится при помощи' центрифугирования (1600g, 5 мин.).

7. Контроль качества полученного продукта Качественный и количественный анализ раствора В-фикоэритрина проводится с помощью спектрофотометрического метода, измеряя спектр поглощения раствора в диапазоне длин волн 400-800 нм.

Концентрацию пигмента в водном экстракте определяется согласно уравнению, используя значения оптической плотности при длинах волн: 650, 615, 545 нм:

В-РЕ=0.023D650 - 0.063D615+0.100D45

Чистота пигмента определяется отсутствием в растворе примесей других пигментов или других белков. Для вычислений используются значения оптической плотности при длинах волн: 620, 545, 495, 280 нм.

Отношение D545/D280 показывает чистоту препарата относительно большинства форм загрязняющих белков. Величина поглощения на длине волны 280 нм в экстракте фикоэритрина, главным образом, обусловлена ароматическими аминокислотами и она примерно пропорциональна общей концентрации белков в растворе, включая В-фикоэритрин. Величина поглощения на 545 нм отражает только концентрацию В-фикоэритрина.

Отношение D620/D545 примерно показывает уровень загрязнения. R-фикоцианином, не смотря на то, что В-фикоэритрин имеет незначительное поглощение на 620 нм.

8. Хранение раствора пигмента.

К полученному водному раствору пигмента добавляется этиловый спирт до конечной концентрации 20% для последующего хранения (в темноте при t=3-5°С). Пример

Культивирование микроводоросли Porphyridium purpureum проводили в 5 л плоскопараллельных стеклянных культиваторах в квазинепрерывном режиме. При условиях: питательная среда Тренкеншу, температура - 26°С, круглосуточное освещение с освещенностью - 40 Вт/м2-с, круглосуточный барботаж газовоздушной смесью с 3% СО2. Отделение биомассы микроводоросли от культуральной среды осуществляли с помощью центрифуги ОС-6М при 2500 об/мин и факторе разделения 1600g. Полученный осадок ресуспендировали в воде и повторно центрифугировали при тех же условиях. Для разрушения клеточных стенок Porphyridium purpureum к 100 г сырой биомассы, помещенной в стеклянный кристаллизатор, добавили 100 мл дистиллированной воды и поместили в бытовую морозильную камеру с температурой -18°С. После полного замерзания увлажненной биомассы вынимали кристаллизатор из морозильной камеры и проводили оттаивание при комнатной температуре. Таких циклов было проведено шесть.

Экстракцию фикоэритрина проводили 460 мл водного буферного раствора с рН 7,5 в течение 24 часов на холоде в темноте. Водный экстракт пигмента очищали от балластных веществ с помощью центрифуги ОС-6М при 2500 об/мин и факторе разделения 1600g в течение 5 минут.

К полученному водному экстракту фикоэритрина добавляли этиловый спирт до. конечной концентрации 20%. Таким образом, получили водно-спиртвого раствор фикоэритрина с конечной концентрацией пигмента 0,4 мг/мл, и консерванта (этанола) 20% (срок хранения на холоде в темноте - 1-1.5 месяца).

Состав водно-спиртового раствора экстракта фикоэритрина из красной микроводоросли Porphyridium purpureum

Вода дистиллированная 560 мл
Спирт этиловый 140 мл
Фикоэритрин 0,4 мг/мл
Общий объем 700 мл

Конечный продукт - раствор пигмента розового цвета с оранжевой флюоресценцией.

Основное преимущество заявляемого Способа получения фикоэритрина из красной микроводоросли заключается в простоте и надёжности. Способ не требует дорогостоящего оборудования, значительных затрат материальных и временных ресурсов и при этом позволяет получать препарат, содержащий фикоэритрин, пригодный для пищевых целей.

Способ получения фикоэритрина из красной микроводоросли, включающий культивирование водорослей, отбор и промывку биомассы, разрушение биомембран, экстрагирование пигмента, отличающийся тем, что для получения β-фикоэритрина красную микроводоросль Porphyridium purpureum культивируют в условиях естественного или искусственного освещения при барботировании газовоздушной смесью с 3% СО2 с применением питательной среды Тренкеншу и квазинепрерывного режима культивирования; отбор биомассы осуществляют при ежедневном обмене, а для разрушения биомембран 6-9 раз проводят процедуру «замораживание-оттаивание», после чего пигмент экстрагируют водным буферным раствором с рН 7-7,5 в соотношении 1:3 в течение 24 ч при 3-5°С в отсутствии света, с последующим центрифугированием и добавлением этилового спирта до конечной концентрации 20%.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам выделения бактериологически чистых культур морских микроводорослей. Способ получения бактериологически чистых культур морских сине-зеленых микроводорослей предусматривает химическую стерилизацию культур микроводорослей путем обработки их в растворе стерильной морской воды, содержащей 0,1% фенола и 1,0% этилового спирта.

Группа изобретений относится к микробиологии. Способ химической модификации липидов микроводорослей включает культивирование микроводорослей рода Prototheca с получением биомассы, содержащей по меньшей мере 10 % липидов микроводорослей в расчете на сухой вес клеток и не более 500 мкг/г красящих включений и осуществление химической реакции, в результате которой происходит ковалентная модификация липидов.

Изобретение относится к способу культивирования одноклеточной зеленой водоросли Haematococcus pluvialis для получения астаксантина, предусматривающему индукцию биосинтеза астаксантина в монадных вегетативных клетках причем культуру, выращенную на питательной среде МОНМ-1, в состоянии субстратного насыщения клеток по биогенным элементам (инокулят) вносят в количестве 0,3-0,35107кл.л-1 в питательную среду МОНМ-2, отличающуюся от среды МОНМ-1 30-кратно сниженным содержанием азота (0,2 мМл-1) и фосфора (0,12 ммл-1), однократно вносят 15 мМ ацетата натрия и дальнейшее выращивание на протяжении 20 суток осуществляют в полу проточном режиме (0,1-0,3 сут-1), поддерживая в среде МОНМ-2 заданный уровень азота и фосфора, при круглосуточном освещении люминесцентными лампами дневного света с интенсивностью светового потока 120 µЕг-2·с-1 непрерывной продувке воздухом (0,3 л мин-1) и температуре 22-26°С.

Изобретение «Применение глубинной морской воды из сероводородной зоны Черного моря в качестве среды культивирования морских водорослей» относится к марикультуре и предназначено для культивирования морских водорослей в лабораторных и промышленных условиях. Техническая сущность изобретения заключаются в применении глубинной воды Черного моря как содержащей сероводород, так и окисленной в качестве среды культивирования морских водорослей. Исследования биогенных свойств водной среды из восстановительной зоны Черного моря, выполненные авторами изобретения показали, что глубинная вода не оказывает губительного действия на черноморские планктонные водоросли в присутствии высоких исходных концентраций сероводорода.

Способ культивирования одноклеточной зеленой микроводоросли Dunaliella salina для получения биомассы с использованием квазинепрерывного режима культивирования. Культуру, выращенную на модифицированной питательной среде Тренкеншу методом накопительных культур до плотности 1,5-3 г ОР·л-1 переводят в квазинепрерывный режим культивирования.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Arthrospira platensis (Nordst.) Geitl.

Изобретение относится к технологии получения биосилифицированных наноматериалов. Предложен способ получения биосилифицированных нанотрубок.

Группа изобретений, включающая штамм одноклеточных зеленых водорослей Parachlorella nurekis и его применение для уничтожения цианобактерий, относится к биотехнологии. Штамм Parachlorella nurekis 1904 KIEG депонирован в Коллекции Культур Водорослей и Протозоа (Culture Collection of Algae and Protozoa, CCAP), Морской институт Шотландии, Данбег, ОБАН, Аргайл, РАЗУ 1QA, Шотландия, Соединенное Королевство (Scottish Marine Institute, Dunbeg, OBAN, Argyll, PA37 1QA, Scotland, UK) под регистрационным номером CCAP №259/1 и может быть применен для уничтожения цианобактерий.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен штамм микроводоросли Chlorella vulgaris IPPAS C-616 для получения липидов в качестве сырья для производства моторного топлива.

Изобретение относится к области биотехнологии, фармацевтической промышленности, в частности к оборудованию для культивиротвания фотосинтезирующих микроорганизмов, преимущественно микроводорослей.
Изобретение относится к области выращивания одноклеточных фотосинтезирующих микроорганизмов. Предложен способ культивирования фотосинтезирующих микроорганизмов в фотобиореакторе закрытого типа с рабочим объемом, содержащим культуральную жидкость. Способ включает подачу газовой смеси, содержащей углекислый газ, в рабочий объем фотобиореактора, осуществление освещения культуральной жидкости от источника искусственного света и ее перемешивание. Перед началом процесса культивирования в рабочий объем фотобиореактора в культуральную жидкость вносят гранулы люминофора с длительным послесвечением в количестве 10-30% от объема культуральной жидкости. Гранулы люминофора снабжены прозрачной наружной оболочкой из химически и биологически инертного материала. При непрерывном или периодическом отборе культуральной жидкости из рабочего объема фотобиореактора отделяют гранулы люминофора с помощью сетчатого фильтра. Изобретение обеспечивает снижение энергетических затрат на процесс культивирования фотосинтезирующих микроорганизмов и увеличение производительности процесса. 1 табл., 2 пр.

Группа изобретений относится к области получения искусственной нефти из парниковых газов. Предложен способ получения искусственной нефти из газа, содержащего CO2, искусственная нефть, полученная вышеуказанным способом, применение искусственной нефти, а также применение газа, содержащего CO2 в предложенном способе. Способ включает стадии: подачи газа в реактор, содержащий культуру, по меньшей мере, одного вида микроводорослей, способных к фотосинтезу; фотосинтеза с использованием CO2; анаэробной ферментации полученной биомассы; термохимического разложения ферментированной биомассы для получения искусственной нефти, смешанной с водой и газами, и отделения полученной искусственной нефти. После стадии фотосинтеза от 5 до 100% культуры извлекают из реактора, разделяют её на твердую фракцию и жидкую фракцию. Твердую фракцию подвергают стадии анаэробной ферментации. Из жидкой фракции отделяют карбонаты и/или бикарбонаты. Далее жидкую фракцию, по существу лишенную карбонатов и бикарбонатов, возвращают, по меньшей мере частично, в реактор. Изобретения обеспечивают больший захват СО2. 4 н. и 25 з.п. ф-лы, 5 ил.,11 табл., 3 пр.

Изобретение относится к фотобиотехнологии. Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris 711-54 обладает высокими показателями степени очистки сточных вод сельскохозяйственных и спиртовых производств, значительной продуктивностью и высоким содержанием ценных соединений в биомассе. Штамм депонирован в Российской Коллекции Микроводорослей при учреждении Российской Академии Наук Институте Физиологии Растений им. К.А. Тимирязева (IPPAS) с присвоенным идентификатором Chlorella vulgaris IPPAS C-2015 и может быть использован для очистки сточных вод сельскохозяйственных и спиртовых производств. Изобретение позволяет повысить качество очистки указанных сточных вод. 1 табл., 4 ил.

Изобретение относится к фотобиотехнологии. Штамм микроводоросли Desmodesmus sp. 3Dp86E-1 обладает высокими показателями фиксации CO2 и толерантностью к высоким концентрациям CO2 в среде культивирования, а также высокой способностью к накоплению липидов, обогащенных полиненасыщенными жирными кислотами. Штамм депонирован в Коллекции культур микроводорослей Института физиологии растений им К.А. Тимирязева РАН (IPPAS) под регистрационным номером Desmodesmus sp. IPPAS S-2014 и может быть использован для конверсии углекислоты из промышленных сбросных газов в сырье для производства биотоплива и кормовых добавок. Изобретение позволяет повысить скорость фиксации CO2 в газовоздушной смеси. 4 ил., 1 табл.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ переработки послеспиртовой барды. Способ включает разделение барды в декантере на дисперсную фазу и жидкую среду, сушку дисперсной фазы с последующим получением кормового продукта и дополнительную обработку жидкой среды в седикантере, на выходе которого получают пастообразный кормовой продукт и светлый фильтрат. Светлый фильтрат из седикантера подают для дополнительной переработки в фотобиореактор с микроводорослью Chlorella vulgaris BIN, где осуществляют наращивание биомассы микроводоросли и получение готового кормового продукта в виде суспензии микроводоросли Chlorella vulgaris BIN. Изобретение обеспечивает получение богатого биологически активными компонентами, белком и другими макро- и микроэлементами кормового продукта, упрощение технологического процесса переработки барды. 1 ил.
Изобретение относится к биотехнологии. Питательная среда для культивирования микроводорослей содержит минеральный ионит «Ionsorb™», стабилизированный куриный помет и водопроводную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить выход биомассы микроводорослей и упросить способ приготовления питательной среды. 4 табл.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм зеленой микроводоросли Acutodesmus obliquus Syko-A Ch-055-12, обладающий способностью снижать содержание загрязняющих веществ в сточной воде, депонирован в Коллекции Микроводорослей ИФР РАН (IPPAS) под регистрационным номером IPPAS S-2016. Штамм зеленой микроводоросли Acutodesmus obliquus IPPAS S-2016 может быть использован для очистки сточных очистных сооружений коммунального хозяйства и целлюлозно-бумажного предприятия от загрязняющих веществ (аммонийного азота, взвешенных веществ, железа) при высоких температурах. 1 ил., 2 пр. . .

Изобретение относится к области выращивания хлореллы. Предложен способ выращивания хлореллы. Способ включает помещение суспензии хлореллы в две стеклянные емкости, в которых находятся нагреватели с терморегуляторами для поддержания оптимальной температуры 28±2°C. Между емкостями расположен источник искусственного света, в качестве источника искусственного освещения используют фитолюминесцентную лампу. В емкость помещают систему из двух медных параллельно расположенных покрытых изоляционным материалом электродов, на которые подают постоянный ток высокого напряжения 10-60 кВ, для создания электростатического поля. Изобретение обеспечивает повышение эффективности процесса выращивания хлореллы. 2 ил.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает последовательное осуществление стадий культивирования биомассы микроводорослей на питательной среде в течение 8 суток и создания стрессовых условий в течение 3 суток. Причем внесение нитрата калия в заданном количестве в питательную среду осуществляется на 1-ый и 4-й день культивирования биомассы микроводорослей. Изобретение позволяет получать биомассу микроводорослей с повышенным содержанием липидов. 3 ил., 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии непрерывного выращивания планктонных водорослей, преимущественно хлореллы. Установка содержит расположенные на каркасе два аквариума для суспензии, светильники, емкости для приготовления питательного раствора и для сбора и хранения готовой суспензии, соединенные с аквариумами трубопроводами. Два аквариума для суспензии микроводорослей установлены на каркасе с возможностью изменения расстояния между ними и соединены между собой в нижней части вертикальных стенок трубопроводом для уравновешивания объема суспензии в обоих аквариумах. Каждый аквариум для суспензии имеет два сливных отверстия, одно из них выполнено в нижней части боковой стенки для слива готовой суспензии хлореллы и ее отвода по трубопроводу в емкость для сбора и хранения суспензии, а второе отверстие выполнено в нижней плоскости. Один из аквариумов для суспензии выполнен с возможностью выращивания маточной культуры и обеспечением единого биотехнологического процесса. Светильники в каждом аквариуме расположены эксцентрично по отношению к продольной оси его. Светильник, размещенный между аквариумами, крепится на отдельной раме независимо от каркаса и аквариумов с возможностью свободного перемещения и съема при переходе на солнечное освещение. Емкость для питательного раствора размещена по уровню выше аквариумов и имеет выполненные в вертикальной боковой стенке два отверстия, первое из которых расположено на уровне 0,5 объема, а второе - в придонном слое с возможностью присоединения к ним трубопроводов для слива питательного раствора в аквариумы. Изобретение обеспечивает повышение производительности культивирования хлореллы, удобство эксплуатации и безопасность работы. 2 ил.
Наверх