Обнаружение и подсчет микроорганизмов

Группа изобретений относится к области микробиологии. Способ обнаружения и подсчета жизнеспособных микроорганизмов в образце предусматривает: (1) контактирование указанных микроорганизмов указанного образца с соединениями для восстановления и средой для выращивания, (2) инкубацию продукта стадии (1) и (3) обнаружение и подсчет указанных микроорганизмов. При этом микроорганизмы относятся к виду Legionella pneumophila, а соединения для восстановления содержат: (а) серин; (b) треонин, (с) хлорид кальция, (d) хлорид магния (f), глутаминовую кислоту и (g) пировиноградную кислоту. Изобретение также раскрывает набор для обнаружения и подсчета жизнеспособных микроорганизмов видов Legionella pneumophila в образце, предположительно содержащем указанные микроорганизмы. Использование этих изобретений позволяет улучшить скорость роста для множества штаммов Legionella pneumophila. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 пр.

 

Настоящее изобретение касается способа обнаружения и подсчета жизнеспособных микроорганизмов видов Legionella pneumophila в образце. Изобретение также включает набор, который подходит для применения в таком способе. Этот способ и набор позволяют более быстро количественно определять жизнеспособные микроорганизмы.

Бактерии Legionella повсеместно распространены во влажных или сырых средах, таких как почва и неморская водная среда обитания. Они также могут быть обнаружены в установках с теплой и холодной водой, охладительных башнях систем кондиционирования воздуха и увлажнителях воздуха.

Legionella, особенно Legionella pneumophila, являются болезнетворными микроорганизмами, которые могут вызвать острую бактериальную пневмонию, общеизвестную как "болезнь легионеров", которая часто становится смертельной для инфицированных людей.

Традиционно обнаружение и подсчет Legionella pneumophila достигаются культивированием клеток. Этот способ может быть осуществлен посредством измерения бактерий, способных к культивированию, используя количественное определение микроорганизмов путем посева на чашках Петри или измерение микроколоний с использованием метода мембранных фильтров. Эти методики оценивают количество жизнеспособных бактерий по их способности образовывать колонию или микроколонию. К сожалению, такие способы обычно требуют от 3 до 10 дней, чтобы дать возможность колониям или микроколониям сформироваться. Если водные установки находятся все еще в процессе эксплуатации, существует недопустимый риск заражения людей в течение этого времени.

Другие способы обнаружения общего количества микроорганизмов Legionella включают методики ПЦР (полимеразная цепная реакция). ПЦР использует ДНК-полимеразу для амплификации участка ДНК посредством ферментативной репликации in vitro. В ходе проведения методики образующаяся ДНК используется в качестве матрицы для репликации, которая вызывает цепную реакцию, что приводит к цепной реакции, в которой ДНК-матрицы экспоненциально амплифицируется. ПЦР позволяет единственной или нескольким копиям участка ДНК амплифицироваться, генерируя миллионы или более копий участка ДНК. Типичный такой способ описан в Diederen et al., J Med Microbiol. 2007 Jan; 56 (Pt 1):94-101.

Однако недостаток ПЦР состоит в том, что образцы склонны содержать ингибиторы реакции полимеризации и поэтому обеспечивают количественные результаты нестабильно. Кроме того, методика зависит от предшествующей стадии очистки ДНК, которая может привести к потере ДНК с последующей заниженной оценкой количества присутствующей Legionella. В некоторой степени эти неудобства преодолены с помощью ПЦР в режиме реального времени, которая является количественной. Однако данная методика не может различить жизнеспособные клетки и нежизнеспособные клетки.

Другой методикой является флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), в который олигонуклеотидный зонд, меченный флуоресцентным веществом, проникает в бактериальные клетки. Если рибосомальные нуклеиновые кислоты (рРНК) имеют правильную последовательность для зонда, известного как мишень, зонд присоединится к своей мишени и не будет удален никакой последующей стадией промывки. Бактерии, в которых зонд зафиксируется, будут в последующем испускать флуоресцентный сигнал. Этот флуоресцентный сигнал затем может быть количественно определен с помощью методик, таких как проточная цитометрия, твердофазная цитометрия или эпифлуоресцентная микроскопия. Типичная методика FISH описана в Dutil S et al. J Appl Microbiol. 2006 May; 100(5):955-63. Однако используя одну только методику FISH, можно обнаружить общее количество жизнеспособных Legionella pneumophila, но, к сожалению, методика не может идентифицировать исключительно только те бактерии Legionella pneumophila, которые способны делиться и, как следствие, образовывать колонию.

Дополнительный способ для подсчета жизнеспособных Legionella pneumophila включает Chem-Chrome V6 и описан в Delgado-Viscogliosi et al. Appl Environ Microbiol. 2005 Jul;71 (7):4086-96. Этот способ позволяет определять количество Legionella pneumophila, так же как различать жизнеспособные и нежизнеспособные бактерии. Он объединяет специфическое обнаружение клеток Legionella при использовании антител и бактериальный маркер жизнеспособности (Chem-Chrome V6) и применяет эпифлуоресцентную микроскопию для подсчета. Однако, хотя эта методика различает жизнеспособные и нежизнеспособные клетки, она не в состоянии отдельно идентифицировать колониеобразующие бактерии.

Американская заявка на патент US 20070218522 описывает способы и композиции обнаружения и определения количества жизнеспособных Legionella и других гетеротрофных аэробных бактерий, способ включает применение дипслайдов, которые включают абсорбирующую среду, вещества, ускоряющие рост, и вещества для селективного роста для быстрого обнаружения и определения количества микроколоний Legionella. Эта методика не способна подсчитывать поврежденные бактерии.

Европейская заявка на патент ЕР 1329515 касается способа исследования на присутствие микроорганизмов в газообразной окружающей среде, содержащей пероксид водорода, путем приведения газовой среды в контактирование с агаровой средой для выращивания, включающей соль пировиноградной кислоты и способствующей развитию колоний микроорганизмов.

Обычно полагают, что методики, которые включают рост колоний на среде для выращивания, таких как чашка с агаровой средой для выращивания, являются более точными. Следовательно, способ определения количества бактерий посевом остается предпочтительным вариантом способа для определения общего количества жизнеспособных бактерий. Это обычно означает нанесение образца, предположительно содержащего микроорганизм, на чашку, содержащую твердый источник питательных веществ, или среду для выращивания. Такая методика, как правило, именуется «посев». Под общим количеством жизнеспособных бактерий мы имеем в виду общее количество бактерий, способных давать популяцию, различимую наблюдателем. Как правило, это будет означать колонию, видимую на поверхности среды для выращивания, такой как чашка с агаровой средой для выращивания.

Однако микроорганизмы, такие как Legionella pneumophila, в окружающей среде могут подвергаться одному или более стрессам, которые препятствуют тому, чтобы микроорганизмы росли и размножались в его экологической обстановке. Такие микроорганизмы, подвергшиеся стрессу, не способны вообще делиться или формировать видимую колонию при нормальных условиях культивирования. В окружающей среде часть клеток микроорганизмов будет, как правило, находиться под стрессом из-за условий окружающей среды, таких как голодание, присутствие биоцида, тепловой шок и обезвоживание. Кроме того, эти клетки могут быть в уязвимом физиологическом состоянии, в котором методика посева микроорганизмов может привести к усилению стресса уже находящихся в условиях стресса клеток микроорганизмов вследствие присутствия кислорода атмосферы. Вдобавок это может привести к искусственной смерти стрессированных бактерий, что приведет к сниженной оценке общего количества жизнеспособных бактерий.

Кроме того, сниженная оценка жизнеспособных Legionella pneumophila со способом посева могла бы стать опасной в отношении их патогенности.

Начиная с 1970-х годов появляются сообщения, что должны использоваться ловушки активных форм кислорода (АФК), чтобы ограничить эффект окислительного стресса во время процесса посева. Об этом было доложено Speck et al., repair and enumeration of injured coliforms by a plating procedure, Appl Microbiol 29, 549-50 (1975); Martin et al. Catalase: its effect on microbial enumeration. Appl Environ Microbiol 32, 731-4 (1976); Brewer et al. Beneficial effects of catalase or pyruvate in a most-probable-number technique for the detection of Staphylococcus aureus. Appl Environ Microbiol 34, 797-800 (1977); McDonaId et al., Enhanced recovery of injured Escherichia coli by compounds that degrade hydrogen peroxide or block its formation. Appl Environ Microbiol 45, 360-5 (1983); Marthi et al. Resuscitation effects of catalase on airborne bacteria. Appl Environ Microbiol 57, 2775-6 (1991); Busch and Donnelly Development of a repair-enrichment broth for resuscitation of heat-injured Listeria monocytogenes and Listeria innocua. Appl Environ Microbiol 58, 14-20 (1992); и Dukan et al., Oxidative stress defense and deterioration of growth-arrested Escherichia coli cells. J Biol Chem 274, 26027-32 (1999).

Однако во всех вышеупомянутых случаях авторы настоящего изобретения полагают, что количество АФК можно было бы уменьшить прямым путем, в котором соединение реагирует химически с АФК.

Статья Berube et al., "Rapid detection and identification of Legionella pneumophila by membrane immunoassay", Applied and Environmental Microbiology, 1989, 55, 1640-1641 описывает обнаружение и идентификацию Legionella pneumophila посредством иммуноблотингового анализа, используя моноклональное антитело. При этом инструменты для решения проблемы поврежденных бактерий не предлагаются.

Статья Pine et al. (Role of keto acids and reduced-oxygen-scavenging enzymes in the growth of Legionella species. J Clin Microbiol 23, 33-42 (1986)) описывает необходимость добавления кетокислот и ферментов антиоксидантной защиты для оптимизации роста Legionella pneumophila и предлагает использовать эти материалы в среде, используемой для стандартного подсчета этих микроорганизмов.

Однако применение только кетокислот и фермента антиоксидантной защиты недостаточно для восстановления стрессированных клеток Legionella pneumophila, которые следует восстановить, и для точного подсчета. Это особенно актуально при применении специфической среды для роста Legionella pneumophila, такой как забуференный угольно-дрожжевой агар (BCYE). Фактически, нет никаких доступных данных относительно оптимизации стандартной среды, полезной для точного подсчета Legionella pneumophila.

Международная заявка на патент WO 2009 121726 описывает способ обнаружения и подсчета жизнеспособных микроорганизмов Legionella pneumophila в образце посредством приведения в контакт микроорганизмов по меньшей мере с одним соединением для восстановления и питательной средой и последующих стадий инкубации и обнаружения и подсчета количества жизнеспособных микроорганизмов. Соединение для восстановления прямо или косвенно оказывает действие на метаболизм, уменьшая окислительный стресс микроорганизма. Существуют соединения для восстановления, которые включают пировиноградную и гликолевую кислоты. Способ обеспечивает превосходный инструмент для более точного подсчета жизнеспособных Legionella pneumophila в пределах более короткого промежутка времени, чем предшествующие способы.

Однако было бы желательно обеспечить улучшенный способ для еще более точного и более быстрого подсчета жизнеспособных Legionella pneumophila. Дополнительно, также было бы желательно достигнуть этого для более широкого спектра штаммов Legionella pneumophila.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением мы обеспечиваем способ обнаружения и подсчета жизнеспособных микроорганизмов в образце, предположительно содержащем указанные микроорганизмы, при этом способ включает

(1) контактирование указанных микроорганизмов указанного образца с соединениями для восстановления и средой для выращивания, и

(2) инкубацию продукта стадий (1), и

(3) обнаружение и количественное определение указанных жизнеспособных микроорганизмов,

в котором микроорганизмы представляют собой вид Legionella pneumophila,

и в котором соединения для восстановления содержат

(a) серин;

(b) треонин;

(c) соединение, содержащее ионы кальция в дозе от 10^-6 до 10^-2 мМ;

(а) соединение, содержащее ионы магния в дозе от 10^-6 до 10^-2 мМ;

(e) соединение, содержащее ионы калия.

(f) глутаминовую кислоту или ее соль,

и

(g) пировиноградную кислоту или ее соль.

Мы обнаружили, что при совокупном применении в настоящем способе этих соединений в качестве соединений для восстановления латентный период микроорганизмов Legionella pneumophila значительно сокращается.

Фактически мы обнаружили, что это достигается для более широкого спектра штаммов Legionella pneumophila.

Не имея желания ограничиваться какой-либо конкретной теорией тем не менее можно предположить, что комбинация пирувата, глутамата и специфических концентраций ионов кальция и магния оказывает благоприятное воздействие на прямое или косвенное снятие или снижение окислительного стресса, а также предполагается, что ионы калия уменьшают осмотический шок, в то время как серин и треонин усиливают метаболизм. Считается, что эта конкретная комбинация соединений для восстановления позволяет синергетически улучшить снятие или снижение окислительного стресса, уменьшение осмотического шока и усиление метаболизма, в результате чего достигаются цели настоящего изобретения.

В настоящем изобретении желаемая доза серина или треонина может быть между 0,01 и 5% в расчете на массу соединения для восстановления в объеме образца. Желательно, обычно доза будет находиться в диапазоне между 0,05 и 2,5%, например между 0,1 и 2%, часто между 0,5 и 1%. Глутаминовая кислота (или ее соль) и/или пировиноградная кислота (или ее соль) используются в желаемой дозе между 0,01 и 5% в расчете на массу соединения для восстановления в объеме образца. Желательно, часто эта доза будет находиться между 0,05 и 2,5%, например между 0,1 и 2%, часто в диапазоне между 0,5 и 1%.

Каждое из соединений, содержащих ионы кальция, ионы магния или ионы калия, может быть любой подходящей солью. Желательно, чтобы они были растворимыми в воде, по меньшей мере, достаточно для того, чтобы получить необходимую дозу. У солей могут быть любые подходящие противоионы. Специалист в данной области техники в любом случае понимает, что противоионы не должны быть известными токсинами для микроорганизмов, таких как Legionella pneumophila. Как правило, примеры противоионов будут включать, но не ограничиваются только ими: хлорид, сульфат, нитрат и т.д.

Как указано выше, если соединение содержит ионы кальция, они должны быть использованы в дозе от 10^-6 до 10^-2 мМ, предпочтительно это будет в пределах диапазона от 10^-5 до 10^-3 мМ, более предпочтительно от 5×10^-4 до 5×10^-3, особенно около 10^-4. Что касается соединения, содержащего ионы магния, как указано выше, доза должна быть от 10^-6 до 10^-2 мМ, предпочтительно она будет в диапазоне от 10^-5 до 10^-3 мМ, более предпочтительно от 5×10^-4 до 5×10^-3 мМ, особенно около 10^-4 мМ.

Соединение для восстановления, содержащее ионы калия, желательно применять в дозе, которая может быть от 1 до 10^-4 мМ, например между 10^-1 и 10^-3 мМ, более предпочтительно между 5×10^-1 и 5×10^-2 мМ, особенно около 10^-2 мМ.

Соединения для восстановления применяются в сочетании, что означает, что они могут использоваться одновременно или последовательно. Под «последовательно» мы подразумеваем добавление каждого соединения по существу одно за другим. Под «одновременно» подразумевается добавление к образцу двух или более соединений для восстановления в одно и то же время. Также может быть желательным объединить два или больше соединений для восстановления в состав, тем самым избавляясь от необходимости отдельных добавлений соединений для восстановления.

Мы полагаем, что соединения для восстановления пируват, глутамат, содержащие кальций, и содержащие магний соединения воздействуют непосредственно или косвенно на метаболизм микроорганизма таким образом, что окислительный стресс микроорганизма снижается. Таким образом, мы полагаем, что пируват, глутамат, содержащие кальций, и содержащие магний соединения для восстановления действуют эндогенно на микроорганизмы.

Под окислительным стрессом мы имеем в виду нарушение баланса между концентрацией АФК (эндогенной продукцией или экзогенной аддукцией) и способностью микроорганизмов легко нейтрализовать реакционно-способные интермедиаты или эффективно восстанавливать образующиеся повреждения. Такое нарушение нормальных метаболических процессов микроорганизма может вызвать токсические эффекты из-за образования свободных радикалов и окисляющих агентов, таких как пероксиды, которые могут приводить к повреждению компонентов клеток микроорганизмов, например ДНК, белков или липидов.

Оказание эффекта на метаболизм микроорганизма означает вызывание изменений естественных внутренних химических процессов в клетке микроорганизма.

Ссылка на эндогенность означает изменения, которые приводят к снижению окислительного стресса в клетке микроорганизма. Это, например, могут быть изменения метаболических процессов внутри микроорганизма. Это также может включать удаление АФК внутри клетки микроорганизма.

Кроме того, считается, что пируват, глутамат, ионы кальция и ионы магния могут непосредственно или косвенно ингибировать образование и/или разрушать АФК. Такое соединение, которое оказывает косвенное воздействие на АФК, может сделать это, вмешиваясь в метаболизм микроорганизма. Такую комбинацию соединений для восстановления можно рассматривать как опосредованно уменьшающее АФК эндогенно, например во время аэробного дыхания.

Соединения калия помогают уменьшить осмотический шок. Под осмотическим шоком мы имеем в виду нарушение баланса концентрации растворенных веществ между окружающей клетку средой и средой внутри клетки. Это нарушение баланса вызывает быстрое изменение движения воды через клеточную мембрану и может привести к повреждению клетки. Поврежденные клетки или измененные клетки являются намного более чувствительными к осмотическому стрессу и могут в результате этого типа стресса потерять жизнеспособность.

Полагают, что серин и треонин модифицируют метаболизм микроорганизма. Под этим мы подразумеваем, что серин и треонин вовлечены в метаболический путь, который, как полагают, непосредственно или косвенно вызывает повышенную интенсивность метаболизма в клетках, имеющих ограниченный или сниженный метаболизм. Используя эти две молекулы, клетки были способны демонстрировать улучшенный рост.

Желательно, чтобы вышеупомянутая комбинация соединений для восстановления в соответствии с настоящим изобретением синергетически улучшала сочетание уменьшения или удаления АФК, снижения осмотического шока и улучшения метаболизма. Это особенно справедливо для более широкого спектра штаммов Legionella pneumophila по сравнению с возможным ранее.

Мы обнаружили, что настоящий способ вызывает восстановление стрессированных клеток Legionella pneumophila у более широкого спектра штаммов Legionella pneumophila и таким образом обеспечивает более точный подсчет полного количества жизнеспособных микроорганизмов. Неожиданно мы также обнаружили, что этот способ дополнительно уменьшает количество требуемого времени инкубации. Вообще мы находим, что этот способ может сократить время инкубации на многие часы и в некоторых случаях по меньшей мере на один или два дня.

Неожиданно мы также обнаружили, что предлагаемый способ может привести к сокращению интерферирующих микроорганизмов, то есть микроорганизмов, отличных от Legionella pneumophila.

Способ в соответствии с настоящим изобретением, который подходящим образом включает приведение в контакт стрессированных клеток микроорганизма Legionella pneumophila с комбинацией соединений для восстановления согласно настоящему изобретению, желательно ингибирует образование и/или уменьшает и/или удаляет АФК, снижает осмотический шок и улучшает метаболизм, и все это помогает индуцировать восстановление стрессированных клеток.

Микроорганизмы Legionella pneumophila могут быть напрямую приведены в контакт с соединением для восстановления при отборе образца. Таким образом, контейнер, в который отбирают образец воды, предположительно содержащий микроорганизм, может уже содержать соединения для восстановления. В альтернативном случае, как только был отобран образец воды, содержащий Legionella pneumophila, он может быть разбавлен водой для разбавления, содержащей соединения для восстановления для аналитических целей. В другом альтернативном варианте образец, который необязательно был разбавлен, может быть приведен в контакт со средой для выращивания, содержащей соединения для восстановления, или соединения для восстановления могут быть применены после контактирования микроорганизма со средой для выращивания. Как только образец был отобран, может быть желательным поместить его на хранение до тех пор, пока не станет удобным осуществить способ в соответствии с настоящим изобретением. Может быть желательным введение всех соединений для восстановления во время хранения.

Предпочтительно все соединения для восстановления, используемые в сочетании согласно настоящему изобретению, должны быть приведены в контакт с микроорганизмами во время стадии разбавления или во время хранения образца.

Один вариант осуществления настоящего изобретения желательно включает контактирование указанного образца со средой для восстановления, предпочтительно неселективной средой для восстановления, содержащей указанное соединение для восстановления, и затем приведение его в контакт со средой для выращивания, предпочтительно селективной средой для выращивания. Предпочтительно среда для восстановления является жидкостью и более предпочтительно бульоном. Если среда для восстановления является жидкостью, такой способ, соответственно, называется жидким способом восстановления. Как правило, в жидком способе восстановления образец сначала вводится в жидкую среду, содержащую комбинацию в соответствии с настоящим изобретением. Идеально, жидкий способ восстановления позволяет стрессированным бактериям восстанавливаться в неселективной жидкой среде. Предпочтительно при жидком способе восстановления в качестве жидкой среды будет использоваться бульон. Обычно жидкая среда, содержащая микроорганизмы Legionella pneumophila, будет затем переноситься в среду для выращивания. Стрессированные микроорганизмы должны быть восстановлены либо до переноса в среду для выращивания, либо должны быть восстановлены при контактировании со средой для выращивания. Более предпочтительно, чтобы среда для выращивания являлась селективной средой для выращивания. Как правило, жидкая среда, содержащая микроорганизмы, наносится на чашку с селективной средой для выращивания, такую как чашка с агаровой средой для выращивания.

В альтернативном предпочтительном варианте осуществления стадия (1) включает контактирование указанного образца со средой для выращивания, предпочтительно неселективной средой для выращивания, содержащей указанную комбинацию соединений для восстановления, и затем приведение его в контакт со средой для восстановления, также содержащей указанное соединение для восстановления. Предпочтительно среда для восстановления является неселективной средой для восстановления, более предпочтительно твердой и особенно предпочтительно селективной агаровой средой для выращивания. Если среда для восстановления является твердой, то это следует называть твердым способом восстановления. Как правило, твердый способ восстановления будет включать контактирование образца с неселективной средой для выращивания, содержащей комбинацию соединений для восстановления в соответствии с настоящим изобретением. Впоследствии он может быть приведен в контакт с селективной средой для выращивания, содержащей соединение для восстановления или комбинацию соединений для восстановления. В этом варианте осуществления компоненты, обеспечивающие селективность, и соединение или соединения, которые предотвращают образование, уменьшают или удаляют АФК, будут диффундировать через неселективную среду. Желательно, неселективной средой для выращивания может быть неселективная агаровая среда для выращивания. Соответственно в этом варианте осуществления образец может быть нанесен на любой неселективный агар, и затем селективную агаровую среду для выращивания, содержащую соединение или соединения, которые предотвращают образование, уменьшают или удаляют АФК, наносят сверху на неселективную агаровую среду для выращивания.

В другом альтернативном варианте осуществления образец может быть нанесен на селективную среду для выращивания, которая уже содержит комбинацию соединений для восстановления. Такой селективной средой для выращивания может быть селективная агаровая среда для выращивания. Нанесение образца может быть осуществлено, как описано ранее.

В другом альтернативном варианте осуществления образец может быть отобран из воды в форме аэрозоля. Как правило, аэрозоль может находиться в охладительной башне или воздушном кондиционере. Желательно, чтобы вода конденсировалась из аэрозоля перед исследованием в соответствии со способом настоящего изобретения. В качестве альтернативного предпочтительного варианта осуществления, стадия (1) включает контактирование указанного образца из аэрозоля с водой для разбавления, которая содержит среду для восстановления, предпочтительно неселективную среду для восстановления, содержащую указанную комбинацию соединений для восстановления, и затем приведение его в контакт со средой для выращивания, также содержащей указанную комбинацию соединений для восстановления.

Во всех вышеупомянутых вариантах осуществления изобретения среда для выращивания должна быть подходящей для роста Legionella pneumophila. Подходящие виды среды для выращивания описаны в литературе и известны специалисту в данной области техники. Обычно среда для выращивания должна содержать активированный уголь и цистеин.

Предпочтительно, чтобы селективной средой для выращивания являлась селективная агаровая среда для выращивания, и более предпочтительно агаровая среда для выращивания, забуференный угольно-дрожжевой агар (BCYE). Питательная среда BCYE могла бы стать селективной посредством добавления антибиотической добавки. Весьма желательная питательная среда BCYE с антибиотиком известна как GVPC (Глицин, Ванкомицин, Полимиксин В, Циклогексимид).

Способ засева описан в литературе и известен специалисту в данной области техники. Как правило, способ включает нанесение некоторого количества этих образцов воды на агаровый гель, который был залит в чашку Петри. Это можно назвать методом посева на чашку Петри или методом посева на поверхность агара. Цель посева на поверхность агара состоит в том, чтобы на твердую среду в чашке Петри распределить аликвоту, как правило 100 мкл воды, предположительно содержащей микроорганизм, называемой бактериальной суспензией. Для распределения бактериальной суспензии на чашке с агаровой средой могут использоваться стеклянные шарики или клеточный скребок. После распределения большая часть жидкости абсорбируется агаром и тонкий слой с бактериями остается на поверхности агара. При помощи инкубации на поверхности агара развивается рост бактерий в форме колоний. Инкубация будет происходить при температуре, которая лучше всего подходит для микроорганизма, которая хорошо описана в литературе и известна специалисту в данной области техники. Как правило, температура будет между 30°С и 50°С, например около 37°С.

Комбинация соединений для восстановления должна добавляться в количестве, эффективном для снижения окислительного стресса микроорганизма. Предпочтительно это будет количеством, эффективным для уменьшения или удаления по существу АФК в клетке микроорганизма.

Фактически мы обнаружили, что применение комбинации соединений для восстановления вызывает значительное сокращение лаг-фазы во время роста Legionella pneumophila, в особенности в жидкой среде. Такое сокращение лаг-фазы в жидкой среде приводит к сокращению времени, требуемого для получения видимой колонии на чашке с агаровой средой.

Также может быть желательно включать кетокислоту и/или ферменты антиоксидантной защиты в среду для восстановления и/или питательную среду. Кетокислоту и/или фермент антиоксидантной защиты не считают соединением для восстановления в соответствии с настоящим изобретением. Тем не менее, может быть полезным включение одного или обоих этих соединений в любую из вышеупомянутых комбинаций соединений для восстановления.

Обнаружение и количественное определение жизнеспособных микроорганизмов может быть выполнено любой известной методикой, которая описана в литературе. Как правило, это будет означать подсчет видимых колоний на поверхности среды для выращивания, такой как чашка с агаровой средой для выращивания.

Способ в соответствии с настоящим изобретением облегчает точное количественное определение наличия Legionella pneumophila. Кроме того, время инкубации может быть значительно уменьшено. Способ подходит для обнаружения Legionella pneumophila в образцах, полученных из любой группы, выбранной из промышленных охлаждающих вод, питьевых вод и природных вод.

Настоящее изобретение также включает набор для более точного обнаружения и подсчета жизнеспособных микроорганизмов вида Legionella pneumophila в образце, предположительно содержащем указанные микроорганизмы, включающий:

(1) соединения для восстановления,

(2) среду для выращивания,

(3) средство для инкубации,

(4) средство для обнаружения и определения количества микроорганизмов,

в котором микроорганизмы являются вида Legionella pneumophila, и в котором соединения для восстановления содержат

(a) серин;

(b) треонин;

(c) соединение, содержащее ионы кальция;

(d) соединение, содержащее ионы магния;

(e) соединение, содержащее ионы калия.

(f) глутаминовую кислоту или ее соль и

(g) пировиноградную кислоту или ее соль.

Набор также может содержать любой из вариантов осуществления, описанных в отношении первого объекта изобретения.

Набор подходит для применения со способом настоящего изобретения и позволяет осуществить более точный подсчет Legionella pneumophila, особенно в отношении более широкого спектра штаммов Legionella pneumophila.

Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение.

Примеры

Выбор соединений и определение их оптимальных концентраций

Чтобы оценить эффекты различных соединений, сравнивали 2 параметра:

фиксировали инкубационный период и скорость роста с культуральной средой и средой с добавками и без добавок. Для простоты инкубационный период оценивали как время, необходимое, чтобы получить оптическую плотность 0,1 при 600 нм. Для всех тестируемых соединений увеличение инкубационного периода (обозначаемого как GT) получали как разницу между инкубационными периодами, полученными на среде сравнения (YEC) и среде с добавками. В одних и тех же условиях относительную скорость роста (обозначаемую как RVC) определяли как отношение между скоростью роста, полученной на среде сравнения и полученной на среде с добавками (YEC+X). На среде сравнения (YEC) штаммы L. pneumophila имеют лаг-период между 5 ч и 15 ч и требуется около 10 часов, чтобы достигнуть оптической плотности (обозначаемой как OD) между 0,1 и 0,3.

При использовании серина или треонина в качестве соединений для восстановления в каждом случае наблюдают улучшение в отношении латентного периода и/или скорости роста для множества штаммов Legionella pneumophila. Улучшения отмечены в диапазоне доз, например между 0,01 и 5% в расчете на массу соединения на объем образца с оптимальной дозой около 1 г на литр.

Улучшения латентного периода и/или скорости роста наблюдаются для многочисленных штаммов Legionella pneumophila, когда используют хлористый кальций или хлористый магний в дозах между 10^-6 и 10^-2 мМ, особенно 10^-4 мМ.

Улучшения латентного периода и/или скорости роста наблюдаются для ряда штаммов Legionella pneumophila, когда используют хлористый калий в дозах между 1 и 10^-4 мМ, особенно около 10^-2 мМ.

Особенно эффективные комбинации соединений для восстановления включают:

Комбинация А

1 г на литр пирувата, 1 г на литр серина, 1 г на литр треонина, 1 г на литр глутаминовой кислоты, 10^-4 мМ хлористого кальция, 10^-4 мМ хлористого магния.

Комбинация В

1,5 г на литр пирувата, 1,5 г на литр серина, 1,5 г на литр треонина, 1 г на литр глутаминовой кислоты, 10^-4 мМ хлористого кальция и 10^-4 мМ хлористого магния.

Комбинация С

2 г на литр пирувата, 2,5 г на литр серина, 1 г на литр треонина, 1 г на литр глутаминовой кислоты, 10^-4 мМ хлористого кальция, 10^-4 мМ хлористого магния и 1,16×10^-2 мМ хлористого калия.

Результаты покажут, что несколько комбинаций благотворно влияют на рост особенно в жидкой среде, содержащей различные штаммы.

1. Способ обнаружения и подсчета жизнеспособных микроорганизмов в образце, предположительно содержащем указанные микроорганизмы, включающий
(1) контактирование указанных микроорганизмов указанного образца с соединениями для восстановления и средой для выращивания, и
(2) инкубацию продукта стадии (1), и
(3) обнаружение и количественное определение указанных жизнеспособных микроорганизмов,
в котором микроорганизмы относятся к виду Legionella pneumophila и в котором соединения для восстановления представляют собой
(a) серин в дозе от 0,01 до 5% мас./об.;
(b) треонин в дозе от 0,01 до 5% мас./об.;
(c) хлорид кальция в дозе от 10^-6 до 10^-2 мМ;
(d) хлорид магния в дозе от 10^-6 до 10^-2 мМ;
(f) глутаминовую кислоту в дозе от 0,01 до 5% мас./об.; и
(g) пировиноградную кислоту в дозе от 0,01 до 5% мас./об.

2. Способ по п. 1, в котором соединения для восстановления дополнительно включают (е) хлорид калия.

3. Способ по п. 1, в котором стадия (1) включает контактирование указанного образца со средой для восстановления, предпочтительно неселективной средой для восстановления, содержащей указанное соединение для восстановления, и затем приведение его в контакт со средой для выращивания, предпочтительно селективной средой для выращивания.

4. Способ по п. 3, в котором среда для восстановления является жидкостью, предпочтительно бульоном.

5. Способ по п. 1, в котором стадия (1) включает контактирование указанного образца со средой для выращивания, предпочтительно неселективной средой для выращивания, и затем приведение его в контакт со средой для восстановления, содержащей указанное соединение для восстановления.

6. Способ по п. 1, в котором стадия (1) включает контактирование указанного образца со средой для восстановления, которая является селективной средой для восстановления, предпочтительно твердой, и более предпочтительно селективной агаровой средой для восстановления.

7. Способ по п. 1, в котором стадия (1) включает контактирование указанного образца со средой для выращивания, содержащей указанное соединение для восстановления.

8. Способ по п. 1, в котором среда для выращивания является забуференным угольно-дрожжевым агаром (BCYE) или GVPC агаровой средой для выращивания.

9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором среда для восстановления и/или среда для выращивания включает кетокислоту и/или фермент антиоксидантной защиты.

10. Набор для обнаружения и подсчета жизнеспособных микроорганизмов вида Legionella pneumophila в образце, предположительно содержащем указанные микроорганизмы, содержащий:
(1) соединения для восстановления,
(2) среду для выращивания,
(3) средство для инкубации,
(4) средство для обнаружения и количественного определения микроорганизмов,
в котором микроорганизмы относятся к виду Legionella pneumophila и в котором соединения для восстановления представляют собой
(a) серин в дозе от 0,01 до 5% мас./об.;
(b) треонин в дозе от 0,01 до 5% мас./об.;
(c) хлорид кальция в дозе от 10^-6 до 10^-2 мМ;
(d) хлорид магния в дозе от 10^-6 до 10^-2 мМ;
(f) глутаминовую кислоту в дозе от 0,01 до 5% мас./об.; и
(g) пировиноградную кислоту в дозе от 0,01 до 5% мас./об.

11. Набор по п. 10, дополнительно включающий хлорид калия в качестве соединения для восстановления (е).