Способ получения биомассы активированных автохтонных микроорганизмов-биодеструкторов n-фосфонометилглицина (глифосата)

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения биомассы активированных автохтонных микроорганизмов-деструкторов N-фосфонометилглицина (глифосата). Перед началом культивирования в состав жидкой среды вносят 0,05-0,4 мкг·см-3 глифосата и стабилизированную с использованием эмульгатора сорбитана моностеарата эмульсию перфтордекалина. Конечное содержание перфтордекалина в жидкой питательной среде - 1,0% по массе, сорбитана моностеарата - 0,0005% по массе. На протяжении всего цикла культивирования дробно, с интервалом 2-4 часа, вводят повышающиеся при каждом введении в 1,25-2,5 раза количества глифосата, начиная с количеств глифосата, равных исходному содержанию его в культуральной среде. Преимуществом изобретения является возможность за один цикл глубинного культивирования получать культуры бактерий и микромицетов, обладающих повышенной в 150-200 раз устойчивостью к глифосату и способностью к деструкции глифосата, в 7-11 раз превышающей биодеструктивную активность исходных автохтонных изолятов. 3 табл., 2 пр.

 

I. Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии, экологии, а также к сельскому хозяйству и может быть использовано для получения активированной биомассы почвенных автохтонных микроорганизмов-биодеструкторов N-фосфонометилглицина (глифосата), самого используемого в мировой практике гербицида системного действия, зарегистрированного более чем в 120 странах под различными торговыми марками (Раундап, Граунд Био, Ураган, Глисол и др.), предназначенного для обработки посевов широкого спектра сельскохозяйственных культур, в садах и парках, в водном и лесном хозяйстве, способного накапливаться в почве, водной среде и растениях, в результате чего создаются предпосылки для интенсивного загрязнения окружающей среды и негативного влияния на людей и животных.

II. Уровень техники

Известны способы получения биомассы микроорганизмов-биодеструкторов ксенобиотиков фосфонатов за счет выделения накопительных и чистых культур из почв, загрязненных ими, в том числе глифосатом, с последующим отбором штаммов, обладающих повышенной биодеструктивной активностью в отношении глифосата на лимитированных по фосфору «голодных» средах с использованием в качестве источника фосфора глифосата или АМФК, селекцией и выращиванием на средах, содержащих определенные концентрации этих ксенобиотиков (Харечко А.Т. и др. Применение микроорганизмов для деструкции опасных веществ, загрязняющих окружающую среду / Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. 1993, т. XXXVII, №3. - С. 40-43; Кононова С.В., Несмеянова М.А. Фосфонаты и их деградация микроорганизмами / Биохимия, 2002. - т. 67. - №2. - С. 220-233; Кузнецова Е.М., Чмипъ В.Д. Глифосат: поведение в окружающей среде и уровни остатков /Современные проблемы токсикологии, 2010. - №1. - С. 87-95; Кравцов К.С. и др. Выделение из окружающей среды микроорганизмов, способных разлагать фосфонаты / Химическая и биологическая безопасность, 2006, №6. - С. 3-9; Шушкова Т.В. Биодеструкция глифосата почвенными бактериями / Дис. канд. биол. наук / Пущино. - 2010. - 132 с.).

Недостатком применяемых способов является то, что ни один из них не позволяет получить биомассу автохтонных активированных микроорганизмов-биодеструкторов глифосата в процессе одного цикла культивирования. Для ее получения требуется длительная предварительная работа по подготовке микробных культур биодеструкторов и оптимизации сред, культивирование в «голодных» по фосфору и другим компонентам средах, а также полноценных по питанию средах, что приводит к снижению биодеструктивной активности и/или выходу биомассы, пригодной для интродукции в почву, загрязненную ксенобиотиком, утрате природной адаптивности получаемых культур с низкой устойчивостью к стрессорным химическим, физическим и биологическим факторам внешней среды.

Наиболее близким к заявляемому способу аналогом является способ, основанный на использовании почвенных глифосатустойчивых изолятов бактерий, отбираемых последовательно на средах с возрастающими концентрациями ксенобиотика, и их глубинном культивировании в жидкой среде с определенной концентрацией ксенобиотика для получения биомассы биодеструктора, обладающего повышенной устойчивостью к глифосату (см. статью Бакулин В.М. Использование почвенных глифосатустойчивых изолятов бактерий рода Pseudomonas в биотехнологии деградации фосфонометилглицина / В.М. Бакулин и др. // Ветеринарная медицина. - 2012, №3-4. - С. 17-19).

Общим существенным признаком у заявляемого способа с аналогом является использование выделенных из почв загрязненных глифосатом и продуктами его разложения микроорганизмов и их использование для получения биомассы биодеструкторов путем глубинного культивирования в жидких питательных средах с глифосатом (см. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов / СМ. Семенов // Москва. - 1990. - 240 с.; Равилов, A.З. Микробиологические среды / A.З. Равилов и др. // Казань. - 1999. - 398 с.).

К недостаткам указанного аналога относятся:

- необходимость проведения длительной селекционной работы для получения высокого уровня устойчивости к глифосату;

- использование при получении биомассы только одной концентрации глифосата в жидкой среде, при этом если она будет велика, то рост культуры будет подавляться избытком глифосата, если мала - то биодеструктивная активность культуры будет низкая;

- отсутствие корреляции между достигаемым уровнем устойчивости выделенного штамма и биодеструктивной активностью получаемой на его основе при глубинном культивировании биомассы (высокий уровень устойчивости не гарантирует активность биодеструкции глифосата);

- полученная указанным способом биомасса биодеструктора утрачивает быстроту адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды и не способна занять экологическую нишу в сравнении с аборигенной для данной местности (почвы) однотипной (тех же видов) микрофлоры, имеющей специфические механизмы природного антагонизма (конкурентное вытеснение, бактериоцины и др.).

III. Сущность изобретения заключается в следующем.

Была поставлена задача - разработать способ получения биомассы активированных микроорганизмов-биодеструкторов глифосата в процессе одного цикла культивирования.

Поставленная задача решается путем использования разработанного способа глубинного выращивания культур в ходе одного цикла культивирования аборигенных микроорганизмов-биодеструкторов в жидких средах на обычной питательной основе, в которые перед началом культивирования вносятся субмикробостатические концентрации глифосата и эмульгированный с сорбитаном моностеаратом перфтордекалин с последующим дробным с интервалом 2-4 часа введением субмикробостатических, постепенно повышающихся в 1,25-2,5 раза количеств глифосата.

Предлагаемый способ получения биомассы активированных автохтонных микроорганизмов-биодеструкторов глифосата позволяет за один цикл глубинного культивирования получать культуры бактерий и микромицетов, обладающих повышенной в 150-200 раз устойчивостью к глифосату в культуральной среде и способностью к деструкции глифосата полученной биомассой, в 7-11 раз превышающей биодеструктивную активность исходных автохтонных изолятов. При этом по выходу биомассы данный способ не уступает принятому способу культивирования биодеструкторов глифосата.

Сущность технического решения - способ получения биомассы активированных микроорганизмов-биодеструкторов глифосата поясняется следующим. Внесение в питательную среду субмикробостатических концентраций глифосата приводит к селективному давлению в культуральной среде и отбору микроорганизмов-биодеструкторов, сочетающих способность к интенсивному росту и разложению ксенобиотика в процессе роста. При этом последующее дробное введение повышающихся субмикробостатических концентраций глифосата под контролем роста культур биодеструкторов приводит к постоянному повышению селективного давления и отбору наиболее устойчивой и активной в плане биодеструкции популяции клеток и одновременному возрастанию биомассы биодеструкторов за счет полноценности натуральной среды и присутствия в среде эмульгированного перфтордекалина.

Наличие в культуральной среде глифосата является стрессовым химическим фактором для микроорганизмов, поэтому в культуральную среду вводится в качестве мощного антистрессового компонента эмульгированный перфтордекалин, обеспечивающий улучшение питания и интенсификацию роста микроорганизмов-биодеструкторов в условиях негативного влияния глифосата (Перфторорганические соединения, стрессы и выживаемость микроорганизмов / С.В. Дармова, М.К. Бакулин и др. Сборник «Наука-Производство-Технологии-Экология. - 2009. - С. 137-139).

Перфтордекалин (ПФД, химическая формула - C10F18), ТУ 95-1233 - бесцветная прозрачная негорючая жидкость без запаха, с вязкостью 2,74 мм2×сСт-1 при 25°С, плотностью 1,945 г/см3 и температурой кипения 155°С. ПФД не служит питательным веществом, не утилизируется микроорганизмами и является лучшим из перфторорганических соединений для использования в биотехнологических процессах в качестве мощного антистрессового фактора и одновременно активатора роста микробной культуры биодеструкторов (Иваницкий Г.Р. Биофизика на пороге нового тысячелетия: перфторуглеродные среды и газотранспортные кровезаменители / Г.Р. Иваницкий // Биофизика. - 2001. - №1. - С. 5-33; Иваницкий Г.Р. Наноконтейнеры на основе перфторуглеродов с функцией переноса оксида азота / Г.Р. Иваницкий // Биофизика. - 2008. - №2. - С. 367-377; Бакулин М.К. Теория и практика использования перфторуглеродов «голубой крови» при глубинном культивировании биодеструкторов / М.К. Бакулин и др. Теоретическая и прикладная экология. 2010, №4, стр. 4-8).

В качестве биодеструкторов использовали микробные изоляты, выделенные из почвы, подвергавшейся в течение четырех лет восьмикратной обработке глифосатом: грамотрицательную аэробную бактерию Pseudomonas fluorescens 047, способную к росту в жидкой среде, содержащей 0,4 мкг·см-3 глифосата, грамположительную факультативно-анаэробную бактерию Bacillus cereus 41 и митоспоровый микромицет Aspergillus niger 17, способные к росту в жидкой среде содержащей 0,05 мкг·см-3 глифосата (см. статью Бакулин В.М. Выделение бактерий рода Pseudomonas из почвы, загрязненной ксенобиотиком фосфонометилглицином / В.М. Бакулин и др. // Ветеринарная медицина. - 2012. - №1. - С. 9-11).

Культивирование осуществляли при температуре 30°C в биологических реакторах БИОР (Йошкар-Ола) или BIOSTAT В Plus (Sartorius) в режиме постоянного перемешивания и принудительной аэрации (расход воздуха: 0,5 объема воздуха на объем среды в минуту) при прочих равных условиях.

Общим с заявляемым способом является то, что для культивирования использовали среды, обычно применяемые для выращивания указанных микроорганизмов.

Для выращивания микроорганизмов-биодеструкторов на основе культур бактерий P. fluorescens 047 к Bacillus cereus 41 использовали жидкую питательную среду на основе ферментативного гидролизата казеина, имеющую в своем составе следующее соотношение компонентов, г/л:

KH2PO4 2,2
K2HPO4 1,7
MgSO4 0,6
Na2S2O3 0,6
аминный азот 130 мг %
водородные ионы 7,1 ед. pH

Для выращивания биодеструкторов на основе культуры митоспорового микромицета Aspergillus niger 17 использовали жидкую синтетическую среду Стейнберга с добавлением соевой муки, имеющую в своем составе следующее соотношение компонентов, г/л:

соевая мука 20,0
сахароза 50,0
NH4NO3 1,9
KH2PO4 0,35
MgSO4×7H2O 0,25
FeCl2 0,0004
ZnCl2 0,0004
CuCl2 0,0001
MnCl2 0,0001
MoCl2 0,00002
CaCl2 0,00002;
водородные ионы 6,3 ед. pH

Готовая стабилизированная с использованием сорбитана моностеарата эмульсия перфтордекалина асептически вносится в стерильные жидкие питательные среды (конечное содержание перфтордекалина в жидких питательный средах равно 1,0% по массе; конечное содержание сорбитана моностеарата в жидких питательный средах равно 0,0005% по массе от общего количества использованных питательных сред), которые затем используется для выращивания биодеструкторов.

В среды перед культивированием вносится глифосат в количествах, обеспечивающих начальную концентрацию ксенобиотика, к которой устойчивы микроорганизмы.

Посевные культуры вносились в среду в количествах, достаточных для создания концентрации бактерий в среде при посеве 1,0·108 бактерий в см, культуры аспергилл - 1,0·107 конидий в см3. Для культуры P. fluorescens 047 начальная концентрация глифосата в жидкой среде 0,4 мкг·см-3; для Bacillus cereus 41 и As- pergillus niger 17-0,05 мкг·см-3. Через 4 часа после начала культивирования в среды дополнительно вносится глифосат для культуры P. fluorescens 047 глифосат из расчета 0,4 мкг·см-3 и затем по схеме (схема 1) каждые два часа в возрастающих концентрациях: 0,8-1,5-4,0-8,0-10,0-20,0-50,0-80,0 мкг·см-3; для культуры Bacillus cereus 41 через 4 часа после начала культивирования дополнительно вносится 0,05 мкг·см-3 глифосата и затем каждые два часа по схеме (схема 2): 0,1-0,2-0,5-1,0-2,5-6,0-15,0-20,0 мкг·см-3; для культуры Aspergillus niger 17 через 4 часа после начала культивирования дополнительно вносится 0,05 мкг·см-3 глифосата и затем через каждые 4 часа по схеме (схема 3): 0,1-0,5-1,0-2,0-5,0-10,0-15,0-15,0 мкг·см-3. Культивирование бактерий продолжается 28 часов, аспергилл - 56 часов.

Пример 1. Получение биомассы микроорганизмов-биодеструкторов глифосата на основе культуры бактерий P. fluorescens 047 и В. cereus 41 (таблицы 1 и 2) осуществляют в жидкой питательной среде на основе ферментативного гидролизата казеина следующего состава, г/л:

KH2PO4 2,2
K2HPO4 1,7
MgSO4 0,6
Na2S2O3 0,6
аминный азот 130 мг %
водородные ионы 7,1 ед. pH
исходная концентрация водородных ионов 7,2 ед. pH

Перед культивированием в стерильных условиях в среду добавляют готовую стабилизированную с использованием эмульгатора сорбитана моностеарата эмульсию перфтордекалина (конечное содержание перфтордекалина в жидкой питательной среде составляет 1,0% по массе; конечное содержание сорбитана моностеарата в жидкой питательной среде равно 0,0005% по массе от общего количества использованной питательной среды).

Исходная посевная концентрация бактерий в среде 1,0·108 живых микробных клеток / см3. Глифосат в культуральную среду с P. fluorescens 047 вносится по схеме 1. Его начальная концентрация в жидкой среде 0,4 мкг·см-3. Через 4 часа после начала культивирования в среду дополнительно вносится 0,4 мкг·см-3 глифосата и затем каждые два часа в возрастающих концентрациях: 0,5-1,5-4,0-8,0-10,0-20,0-50,0-80,0 мкг глифосата/см-3 культуральной среды.

Культивирование бактерий продолжается 28 часов (таблица 1).

Для культуры Bacillus cereus 41 начальная концентрация глифосата в жидкой среде 0,05 мкг·см-3, через 4 часа после начала культивирования дополнительно вносится 0,05 мкг·см-3 глифосата и затем каждые два часа по схеме (схема 2): 0,1-0,2-0,5-1,0-2,5-6,0-15,0-20,0 мкг·см-3.

Культивирование бактерий продолжается 28 часов (таблица 2).

Пример 2. Получение биомассы микроорганизмов-биодеструкторов глифосата на основе культуры микромицетов Aspergillus niger 17 осуществляют в питательной среде на основе жидкой синтетической среды Стейнберга с добавлением соевой муки, имеющую в своем составе следующее соотношение компонентов, г/л:

соевая мука 20,0
сахароза 50,0
NH4NO3 1,9
KH2PO4 0,35
MgSO4×7H2O 0,25
FeCl2 0,0004
ZnCl2 0,0004
CuCl2 0,0001
MnCl2 0,0001
MoCl2 0,00002
CaCl2 0,00002
водородные ионы 6,3 ед. pH

Перед культивированием в стерильных условиях в среду добавляют готовую стабилизированную с использованием эмульгатора сорбитана моностеарата эмульсию перфтордекалина (конечное содержание перфтордекалина в жидкой питательной среде составляет 1,0% по массе; конечное содержание сорбитана моностеарата в жидкой питательной среде равно 0,0005% по массе от общего количества использованной питательной среды).

Глифосат в культуральную среду с Aspergillus niger 17 вносится перед культивированием в концентрации 0,05 мкг·см-3, через 4 часа после начала культивирования дополнительно вносится 0,05 мкг·см-3 глифосата и затем через каждые 4 часа по схеме (схема 3): 0,1-0,5-1,0-2,0-5,0-10,0-15,0-15,0 мкг·см-3 Культивирование аспергилл продолжают - 56 часов (таблица 3).

Способ получения биомассы активированных автохтонных микроорганизмов-биодеструкторов N-фосфонометилглицина (глифосата) в результате одного цикла глубинного культивирования культур аборигенных микроорганизмов-биодеструкторов в жидких средах на обычных, используемых для их выращивания, питательных основах, отличающийся тем, что перед началом культивирования в состав жидкой среды вносят субмикробостатические концентрации глифосата - 0,05-0,4 мкг·см-3 и стабилизированную с использованием эмульгатора сорбитана моностеарата эмульсию перфтордекалина, причем конечное содержание перфтордекалина в жидкой питательной среде составляет 1,0% по массе, конечное содержание сорбитана моностеарата равно 0,0005% по массе от общего количества использованной жидкой питательной среды, затем дробно на протяжении всего цикла культивирования многократно, с интервалом 2-4 часа, вводят субмикробостатические, повышающиеся при каждом введении в 1,25-2,5 раза количества глифосата, начиная с количеств глифосата, равных исходному содержанию его в культуральной среде.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен биопрепарат для биоремедиации нефтезагрязненных почв для климатических условий Крайнего Севера.

Предложены штамм Lactobacillus plantarum DSM 23755, штамм Lactobacillus plantarum DSM 23756, штамм Lactobacillus fermentum DSM 23757 и штамм Lactobacillus fermentum DSM 23758, используемые для приготовления продукта на основе ферментированной сои, включающего изофлавон-агликоны, эквол и луназин.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает культивирование штамма бактерий Gluconacetobacter sucrofermentans ВКПМ В-11267 в статических условиях на послеспиртовой зерновой барде с последующим получением гель-пленки бактериальной целлюлозы.

Способ получения по существу чистого гепаросана из E.coli K5 предусматривает культивирование клеток E.coli K5 в среде, содержащей глюкозу в качестве основного источника углерода, осуществление связывания гепаросана с твердофазным носителем с последующим элюированием и осаждение гепаросана из элюата.

Группа изобретений относится к способу скрининга и выделения клеток Bacillus subtilis, к композиции кормовой добавки к кормовому продукту для животного, содержащей указанные клетки, и способу кормления животного.

Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Exiguobacterium sp.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены штаммы Lactobacillus plantarum CECT 7484, Lactobacillus plantarum CECT 7485 и Pediococcus acidilactici CECT 7483, проявляющие противовоспалительную активность, иммуномодулирующую активность, активность в отношении IBS или активность в отношении вздутия живота.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способы продуцирования изопрена культивированием рекомбинантных клеток грибов или микроогранизмов.

Изобретение относится к области биотехнологии и трансмутации химических элементов. Радиоактивное сырье, содержащее радиоактивные химические элементы или их изотопы, обрабатывают водной суспензией бактерий рода Thiobacillus в присутствии элементов с переменной валентностью.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в производстве физиологически активных соединений. Способ получения бактериородопсина предусматривает выращивание в ферментере в течение шести суток штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-11953 с последующим отделением биомассы центрифугированием и разрушением ее при инкубации в дистиллированной воде в течение ночи при постоянном перемешивании.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен биопрепарат для биоремедиации нефтезагрязненных почв для климатических условий Крайнего Севера.
Изобретение относится к области экологии. Для биопреобразования нефтяных и буровых шламов заселяют загрязненную почву природными черноземообразующими организмами.

Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Exiguobacterium sp.

Изобретение относится к биотехнологии и экологии. Для очистки почв, загрязненных хлорароматическими токсикантами, вводят в почву гуматы и бактерии штамма Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7 в дозах 106-107 кл/г почвы.

Изобретение относится к области биохимии. Предложено средство, в качестве которого используют штамм Rhodococcus wratislaviensis ВКМ Ac-2623D, для очистки почв, загрязненных гексахлорбензолом, линданом, дихлордифенилтрихлорэтаном, дихлордифенилдихлорэтаном, триаллатом и эфирами фталиевой кислоты (дибутилфталатом, диоктилфталатом).

Изобретение относится к области микробиологии. Штамм бактерий Kocuria sp., обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), депонирован в ВКМ под регистрационным номером Kocuria sp.

Изобретение относится к области микробиологии. Штамм бактерий Serratia plymuthica ELA-9, обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), депонирован в ВКМ под регистрационным номером Serratia plymuthica VKM B-2819D и может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от +4 до +30°C.

Изобретение относится к области микробиологии. Штамм бактерий Rhodococcus sp.

Способ включает безотвальную вспашку грунта при создании пористой механоактивированной почвенной структуры, мульчирующее боронование. Осуществляют обработку почвы распылением водного раствора смеси биологического и органоминерального препаратов, выбранных в соотношении (0,5÷1):3.

Изобретение относится к способам воспроизводства нефтезагрязненных земель. Осуществляют внесение биопрепаратов и посев семян растений с высокой сорбционной способностью.

Изобретение относится к охране окружающей среды, в частности к экологической биотехнологии, микробиологии. Предложен консорциум микроорганизмов Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, взятых в соотношении 1:1, для очистки различных типов мерзлотных почв от нефтезагрязнений. Консорциум обладает способностью утилизировать нефть и нефтепродукты в относительно короткие сроки в широком диапазоне температур от +8 до +37°C. 3 табл., 8 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения биомассы активированных автохтонных микроорганизмов-деструкторов N-фосфонометилглицина. Перед началом культивирования в состав жидкой среды вносят 0,05-0,4 мкг·см-3 глифосата и стабилизированную с использованием эмульгатора сорбитана моностеарата эмульсию перфтордекалина. Конечное содержание перфтордекалина в жидкой питательной среде - 1,0 по массе, сорбитана моностеарата - 0,0005 по массе. На протяжении всего цикла культивирования дробно, с интервалом 2-4 часа, вводят повышающиеся при каждом введении в 1,25-2,5 раза количества глифосата, начиная с количеств глифосата, равных исходному содержанию его в культуральной среде. Преимуществом изобретения является возможность за один цикл глубинного культивирования получать культуры бактерий и микромицетов, обладающих повышенной в 150-200 раз устойчивостью к глифосату и способностью к деструкции глифосата, в 7-11 раз превышающей биодеструктивную активность исходных автохтонных изолятов. 3 табл., 2 пр.

Наверх