Штамм бактерий lactobacillus jensenii, обладающий широким спектром антагонистической активности и пробиотический консорциум лактобактерий для изготовления бактериальных препаратов



Штамм бактерий lactobacillus jensenii, обладающий широким спектром антагонистической активности и пробиотический консорциум лактобактерий для изготовления бактериальных препаратов
Штамм бактерий lactobacillus jensenii, обладающий широким спектром антагонистической активности и пробиотический консорциум лактобактерий для изготовления бактериальных препаратов
Штамм бактерий lactobacillus jensenii, обладающий широким спектром антагонистической активности и пробиотический консорциум лактобактерий для изготовления бактериальных препаратов
Штамм бактерий lactobacillus jensenii, обладающий широким спектром антагонистической активности и пробиотический консорциум лактобактерий для изготовления бактериальных препаратов
Штамм бактерий lactobacillus jensenii, обладающий широким спектром антагонистической активности и пробиотический консорциум лактобактерий для изготовления бактериальных препаратов
Штамм бактерий lactobacillus jensenii, обладающий широким спектром антагонистической активности и пробиотический консорциум лактобактерий для изготовления бактериальных препаратов

 


Владельцы патента RU 2572351:

Пчелинцев Сергей Юрьевич (RU)
Мельников Вячеслав Геннадьевич (RU)
Хлебников Валентин Сергеевич (RU)
Сакулин Вадим Константинович (RU)
Косарев Игорь Васильевич (RU)
Абрамов Вячеслав Михайлович (RU)
Василенко Раиса Николаевна (RU)

Заявленная группа изобретений относится к биотехнологии. Штамм Lactobacillus jensenii депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им Г.К. Скрябина РАН под регистрационным номером BKM В-2834D. Данный штамм обладает широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Биомассу штамма Lactobacillus jensenii BKM В-2834D смешивают с биомассами штаммов Lactobacillus crispatus BKM B-2727D, Lactobacillus gasseri BKM B-2728D, Lactobacillus plantarum BKM B-2731D с получением консорциума. Полученный консорциум обладает пробиотическим действием и может быть использован для изготовления бактериальных препаратов. Группа изобретений позволяет расширить ассортимент пробиотических штаммов для профилактики и лечения инфекций, передаваемых половым путем. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 5 табл., 6 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве бактериальных препаратов, предназначенных для профилактики и комплексного лечения урогенитальных инфекционных заболеваний и инфекций, передаваемых половым путем (ИППП). Согласно статистическим данным один миллиард женщин в мире ежегодно обращаются в клиники по поводу лечения различных урогенитальных инфекций. Урогенитальные инфекционные заболевания представляют собой одну из важных социальных проблем [1]. К числу таких заболеваний относится бактериальный вагиноз (БВ) - инфекционный невоспалительный синдром, характеризующийся резким снижением или отсутствием лактобацилл и их заменой на полимикробные ассоциации условно-патогенных бактерий G. vaginalis со строгими анаэробами Atopobium vaginae, Prevotella, Mobilincus и др., концентрация которых возрастает в несколько раз и достигает 109-1011 КОЕ/мл [2]. Вторым наиболее распространенным инфекционным заболеванием женской половой сферы является вульвовагинальный кандидоз (ВВК). Он относится к оппортунистическим инфекциям, развивающимся на фоне иммунологической недостаточности. В связи с этим ВВК весьма актуален во время беременности, отличается рецидивирующим и резистентным к терапии течением [2]. К факторам риска кандидозной инфекции относятся также гипофункция яичников, частое лечение антибиотиками, особенно пенициллинового ряда. В последние годы у человека все чаще ВВК вызывается не Candida albicans, а другими разновидностями грибков рода Candida (С. tropicalis, С. glabrata, С. krusei). Если раньше такие случаи были редки, то сейчас на долю этих грибков приходится 30-50% всех кандидозных инфекций. В настоящее время довольно часто встречаются БВ и КВВ одновременно в качестве смешанной инфекции, составляя от 10 до 39% всех случаев инфекционных заболеваний влагалища [4].

Второй важной социальной проблемой являются инфекции, передаваемые половым путем (ИППП), в связи с их широким распространением во многих странах мира, включая Российскую Федерацию [5-8]. Среди ИППП особое место занимает гонорея, что обусловлено высокой частотой осложнений, возникающих при этом заболевании. У женщин наиболее неблагоприятным отдаленным последствием острой гонококковой инфекции являются воспалительные заболевания органов малого таза, приводящие к бесплодию. Возбудителем гонококковой инфекции является гонококк, относящийся к семейству Neisseriaceae, роду Neisseria, виду Neisseria gonorrhoeae [9]. Уровень заболеваемости гонорей в Российской Федерации по данным официальной государственной статистики 2010 года составлял 42,7 случаев на 100000 населения [10], что существенно превышает показатели заболеваемости в странах Европы (10 случаев на 100000 населения) [7, 8]. В США гонококковая инфекция занимает второе место среди всех ИППП, уступая лишь урогенитальному хламидиозу [6, 11]. В 75-80% случаев у женщин гонорея протекает бессимптомно [12]. К настоящему времени гонококки приобрели устойчивость к многим классам антибиотиков. Антибиотикоустойчивые штаммы N. gonorrhoeae играют огромную роль в распространении гонококковой инфекции. Повышение устойчивости N. eisseria gonorrhoeae к антимикробным препаратам снижает эффективность стандартных схем лечения, что ведет к росту заболеваемости и увеличению экономических затрат на лечение [13]. N. gonorrhoeae - строго антропонозный патоген, единственным резервуаром этой инфекции является человек. Риск передачи гонококковой инфекции после однократного полового контакта составляет 70-80% от мужчины к женщине и 20-30% от женщины к мужчине [14]. Адгезия гонококков на эпителиоцитах влагалища и дистальных отделов уретры является первым и наиболее важным этапом в развитии гонореи и рассматривается в качестве мишени для создания эффективных профилактических и лекарственных средств, повышающих резистентность организма к данному заболеванию. Лактобациллы - один из наиболее перспективных источников конструирования антиадгезивных в отношении гонококков препаратов. Они выполняют ключевую роль в защите человека от патогенов, передаваемых половым путем. Бактериальный вагиноз, характеризующийся снижением уровня лактобацилл в репродуктивном тракте женщины вплоть до их полного исчезновения, создает предрасположенность к инфекциям, передаваемым половым путем [15]. В связи с вышеизложенным актуальной является разработка новых пробиотических препаратов для профилактики и комплексного лечения урогенитальных инфекционных заболеваний и ИППП, в частности гонореи.

Известна композиция, состоящая из Lactobacillus crispatus (DSM 22566), Lactobacillus rhamnosus (DSM 22560), Lactobacillus jensenii (DSM 22567), Lactobacillus gasseri (DSM 22583), предназначенная для лечения бактериального вагиноза и вульвовагинального кандидоза [16]. Однако спектр антагонистической активности этой композиции штаммов не включает N. honorrhoeae, что является актуальным в настоящее время.

Задачей настоящего изобретения является расширение ассортимента пробиотических штаммов, в частности, обладающих выраженными антагонистическими свойствами по отношению к N. honorrhoeae и пробиотических консорциумов, которые могут быть использованы при получении бактериальных препаратов, предназначенных для профилактики и лечения инфекций, передаваемых половым путем, в частности гонореи.

Поставленная задача решена тем, что получен пробиотический штамм Lactobacillus jensenii MD LIE-70(2) - BKM В-2834D, а также включающий его консорциум штаммов Lactobacillus jensenii BKM В-2834D, Lactobacillus crispatus BKM B-2727D, Lactobacillus gasseri BKM B-2728D, Lactobacillus plantarum BKM B-2731D, который обладает пробиотической активностью и может быть использован для изготовления бактериальных препаратов, направленных на профилактику и лечение инфекций, передаваемых половым путем, в частности гонореи.

Штамм Lactobacillus jensenii MD ПЕ-70(2) выделен из вагинального отделяемого здоровой женщины репродуктивного возраста.

Штамм Lactobacillus jensenii MD ПЕ-70(2) идентифицирован методом секвенирования гена 16S rRNA, депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, (Московская обл., г. Пущино) и имеет регистрационный номер BKM B-2834D.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

При выращивании на поверхности агаризованной среды МРС рН-6,5 (Himedia, Индия) методом истощающего штриха в СО2 инкубаторе при 37°С в течение 24-48 часов образует средние, круглые, бледные колонии плоские с ровным краем.

При выращивании на жидкой среде МРС рН-6,5 (Himedia, Индия) при 37°С в течение 24-48 часов клетки штамма представляют средние палочки размером ~ 4 мкм, образуют короткие цепочки.

Физиолого-биологические признаки.

Штамм является факультативным анаэробом, температурный оптимум 37±2°С, растет при 42°С, слабый рост при 30°С. Оптимальное значение рН среды 5,0-6,0.

Биохимические свойства.

Способность штамма ферментировать углеводы оценивают в API-тесте в соответствии с инструкцией фирмы производителя (BioMerieux, Франция).

Штамм усваивает D-Рибозу, D-Галактозу, D-Глюкозу, D-Фруктозу, D-Мальтозу, D-Лактозу, D-Мелибиозу, D-Сахарозу.

Молекулярная идентификация.

Видовую принадлежность штамма Lactobacillus jensenii BKM B-2834D определяли с помощью анализа rRNA.

Для нахождения близкородственных организмов нуклеотидную последовательность гена16S rRNA сравнивают с последовательностями типовых штаммов по рибосомальной базе данных (RDBII - http://rdp.cme.msu.edu) и Генбанка национального центра биологической информации (NCBI - http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Чувствительность к антибиотикам.

Штамм Lactobacillus jensenii BKM B-2834D устойчив к антибиотикам пенициллинового и фторхинолонового ряда.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма.

Штамм Lactobacillus jensenii BKM B-2834D выращивают при 37±2°С на жидкой среде МРС или в обезжиренном молоке (0,01-0,03% жира).

Коммерчески приобретенное обезжиренное молоко (0,01 - 0,03% жира) стерилизуют 20 минут автоклавированием при давлении 0,5 атм и температуре 110°С.

Для выращивания индивидуальных колоний штамма используют агаризованную среду МРС, содержащую 1,4% агара (Difco, США).

Способ, условия и состав сред для хранения штамма.

Штамм Lactobacillus jensenii BKM B-2834D может храниться:

- в стерильном обезжиренном молоке при 4°С с периодическим пересевом 1 раз в 15-20 дней;

- в лиофилизированном состоянии в запаянных ампулах (защитная среда при высушивании - сахароза 10%, рН 7,0 или стерильное обезжиренное молоко) в течение 2-х лет при температуре 4°С;

- в замороженном виде при -70°С. Длительность хранения 6 месяцев.

Консорциум штаммов Lactobacillus crispatus BKM В-2727D, Lactobacillus gasseri BKM B-2728D, Lactobacillus plantarum BKM B-2731D (далее консорциум 1), входящих в заявленный консорциум наряду со штаммом Lactobacillus jensenii BKM В-2834D, подробно описан в [17].

Заявленный консорциум штаммов Lactobacillus jensenii BKM В-2834D, Lactobacillus crispatus BKM B-2727D, Lactobacillus gasseri BKM В-2728D, Lactobacillus plantarum BKM B-2731D (далее консорциум 2) может храниться:

- в лиофилизированном состоянии в запаянных ампулах (защитная среда при высушивании - сахароза 10%, рН 7,0 или стерильное обезжиренное молоко) в течение 2-х лет при температуре 4°С;

- в замороженном виде при -70°С. Длительность хранения 6 месяцев.

Заявленное решение иллюстрируется чертежом, на котором показано влияние Lactobacillus jensenii BKM В-2834D, консорциума 1 и консорциума 2 на показатели инфицированности влагалища мышей патогеном N. gonorrhoeae.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Культивирование штамма Lactobacillus jensenii BKM В-2834D в лабораторных условиях.

Для получения посевного материала в ампулу, содержащую 10 мг лиофилизированной культуры Lactobacillus jensenii BKM В-2834D, добавляют 0,5 мл стерильного раствора натрия хлорида 0,9% и выращивают культуру на поверхности агаризованной среды МРС методом истощающего штриха в термостате при 37°С в течение 18 часов. Затем изолированную колонию помещают в бактериологическую пробирку, содержащую 7 мл жидкой среды МРС и выращивают в термостате при 37°С в течение 15 часов.

Полученный посевной материал в количестве 1% вносят во флаконы, содержащие 500 мл жидкой среды МРС, и выращивают при 37°С в течение 18 часов. Титр полученной культуры 4,0×109 КОЕ/мл. Путем доведения концентрации клеток до 6,0×108 КОЕ/мл получают стандартизованную стартовую биомассу штамма Lactobacillus jensenii BKM В-2834D. Для длительного хранения клетки освобождают от компонентов среды выращивания путем центрифугирования, переводят в среду высушивания (защитная среда при высушивании - стерильное обезжиренное молоко), расфасовывают по 1 мл в пенициллиновые флаконы и лиофилизируют. В лиофильно высушенном состоянии стартовая биомасса может храниться в течение двух лет при температуре 4°С.

Пример 2. Получение бактериального препарата консорциума штаммов Lactobacillus jensenii BKM В-2834D, Lactobacillus crispatus BKM B-2727D, Lactobacillus sasseri BKM B-2728D. Lactobacillus plantarum BKM B-2731D.

Консорциум 1, содержащий штаммы Lactobacillus crispatus BKM B-2727D, Lactobacillus gasseri BKM B-2728D, Lactobacillus plantarum BKM B-2731D получают, как описано в работе [17]. Штаммы, составляющие консорциум 1, раздельно культивируют в жидкой среде МРС при 37°С в течение 18 часов, затем, доводя концентрацию клеток до 6,0×108 КОЕ/мл, получают стандартизованную стартовую биомассу каждого штамма. Культуры смешивают в равных объемах и получают стартовую биомассу консорциума 1. Стандартная концентрация клеток каждого штамма в полученной биомассе составляет 2×108 КОЕ/мл.

Стартовую биомассу штамма Lactobacillus jensenii BKM В-2834D, полученную по примеру 1, смешивают со стартовой биомассой консорциума 1 в соотношении 1:3 по объему, что позволяет получить консорциум 2, в котором штаммы Lactobacillus jensenii BKM В-2834D, Lactobacillus crispatus BKM B-2727D, Lactobacillus gasseri BKM B-2728D, Lactobacillus plantarum BKM B-2731D находятся в равных концентрациях, т.е. в соотношении 1:1:1:1.

Стандартная концентрация клеток каждого штамма в полученной биомассе (стандартизованная стартовая биомасса) составляет 1,5×108 КОЕ/мл. Общий титр - 6,0×108 КОЕ/мл.

Консорциум штаммов Lactobacillus jensenii BKM В-2834D, Lactobacillus crispatus BKM B-2727D, Lactobacillus gasseri BKM В-2728D, Lactobacillus plantarum BKM B-2731D может быть также получен непосредственным смешением стандартизованных биомасс всех штаммов. При этом для получения консорциума могут быть использованы и другие соотношения исходных штаммов (от 1:100 до 100:1), но соотношение 1:1:1:1 является предпочтительным.

Полученный консорциум лиофилизируют по примеру 1. В лиофильно высушенном состоянии бактериальный препарат может храниться в течение двух лет при температуре 4°С. Общий титр клеток в одном флаконе - 6,0×108 КОЕ.

Пример 3. Оценка активности кислотообразования.

Активность кислотообразования определяют титриметрическим методом [18].

В качестве закваски используют стандартизованную стартовую биомассу штамма Lactobacillus jensenii BKM В-2834D, полученную по примеру 1, и стартовые биомассы консорциума 1 и консорциума 2, полученные по примеру 2.

Закваски (штамм и каждый консорциум в отдельности) в количестве 1% вносят во флаконы, содержащие молоко 1,5% жирности, и культивируют в течение 24-48 ч при 37°С. Измерения проводят в течение 48 часов. Результат представляют в градусах Тернера (Т° - величина, выражающая количество 0,1 N щелочи, пошедшей на титрование 100 мл исследуемого образца).

Результаты, приведенные в табл. 1, показывают, что штамм Lactobacillus jensenii BKM В-2834D сквашивает молоко за 48 часов, кислотность продукта составляет 75,3±2,4°T.

При инокуляции консорциума 2 образование сгустка происходит за 20 часов, и к 48 часам кислотность продукта достигает 110,4±2,3°Т, что соответствует нормативам кисломолочных напитков и йогуртов 70-140°Т. Полученный продукт обладает хорошими вкусовыми свойствами и имеет легкий кисломолочный запах. Проведенные исследования показали, что свойства заявляемого консорциума при использовании его в качестве закваски прямого внесения, соответствуют технологическим требованиям производства кисломолочных продуктов.

Пример 4. Исследование устойчивости штамма Lactobacillus jensenii BKM В-2834D к желудочному и кишечному стрессам (способность расти в среде с низким значением рН или в среде, содержащей желчь).

При пероральном применении пробиотических препаратов чрезвычайно важно, чтобы штаммы лактобацилл, входящие в консорциум, были устойчивы к желудочному и кишечному стрессам.

При исследовании используют следующие методики.

Имитация желудочного стресса in vitro

Композиция искусственного желудочного сока:

NaCl (SigmaS9625) 2,2 г/л

L-молочная кислота (SigmaL1750) 9,9 г/л (0,11 М)

Pepsin (SigmaP7125) 3,5 г/л

рН: 2,7±0,02 (доводят 35% NaOH)

рН после разведения 1/11: 3,10±0,10 (контролируют для каждой культуры).

1 мл искусственного желудочного сока добавляют к 100 мкл культуры в стационарной фазе (1/11 разведение). Культуры инкубируют в течение 10 минут, 30 минут и 60 минут при 37°С, 10% СО2. В качестве контроля вместо искусственного желудочного сока используют 1 мл МРС. Измерения выполняют в двух повторах для каждой культуры.

После инкубаций культуру (каждую повторность и контроли) разводят от 102 до 109 или 1010 в МРС, разведения высевают на чашках с МРС-агаром и инкубируют в течение 24-48 часов при 37°С, 10% СО2). Определяют титр культуры в условиях стресса и без стресса путем подсчета количества колоний для разведений.

Имитация кишечного стресса in vitro

Композиция искусственного кишечного сока:

Желчные соли (желчь свиньи SigmaB8631) 3,3 г/л (конечная концентрация: 0,3%)

Карбонатный буфер NaHCO3 (Sigma S8875) 16,5 г/л (конечная концентрация: 1,5%)

рН: 6,3

1 мл искусственного кишечного сока добавляют к 100 мкл культуры в стационарной фазе (1/11 разведение). Культуры инкубируют в течение 5 часов при 37°С, 10% СО2. В качестве контроля используют 1 мл МРС. Измерения выполняют в двух повторах для каждой культуры.

Культуры и контроли разводят от 102 до 109 или 1010 в МРС, разведения высевают на чашках с МРС-агаром и инкубируют в течение 24-48 часов при 37°С, 10% СО2. Определяют титр в условиях стресса и без стресса путем подсчета количества колоний для разведений.

Подсчет микроорганизмов в миллилитре культуры КОЕ осуществляют по формуле:

ΣC/(n1+0.1n2)d,

где: ΣC - сумма всех характерных колоний, подсчитанных на всех чашках, содержащих от 15 до 300 колоний;

n1 - количество чашек, в самом низком разведении (2 чашки на разведение);

n2 - количество чашек, в самом высоком разведении (2 чашки на разведение);

d - величина первого разведения (низкое разведение), взятого для подсчета.

Для определения устойчивости лактобацилл к желудочному и кишечному стрессам используют культуры в стационарной фазе роста, выращенные на жидкой среде МРС, рН-6,5 в течение 18 часов при 37°С, 10% CO2.

Результаты, приведенные в табл.2, показывают, что штамм Lactobacillus jensenii MD IIE-70(2) обладает высокой устойчивостью к желудочному и кишечному стрессам.

В работе [17] приведены данные, свидетельствующие об по устойчивости штаммов Lactobacillus crispatus BKM B-2727D, Lactobacillus gasseri BKM B-2728D, Lactobacillus plantarum BKM B-2731D к желудочному и кишечному стрессам. Таким образом, все штаммы, входящие в консорциум 2, являются устойчивыми к воздействию экстремальных факторов, таких как низкая кислотность и содержание желчи, и, следовательно, консорциум 2 является перспективным для использования в медицинской промышленности для получения лекарственных препаратов, применяемых не только интравагинально, но и per os.

Пример 5. Способность продуцировать Н2О2.

Эффективная продукция перекиси водорода (Н2О2) пробиотическими лактобациллами является одним из основных факторов, обеспечивающих колонизационную резистентность микробиоценозов организма [19]. Количественное определение перекиси водорода (Н2О2), продуцируемое культурами лактобацилл, осуществляют колориметрическим методом, используя хромофор 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (ТМВ) (Sigma) в присутствии пероксидазы хрена (Sigma) [20].

Результаты, приведенные в табл.3, показывают, что наиболее эффективная продукция Н2О2 отмечалась при культивировании консорциума 2.

Пример 6. Исследование антагонистической активности штамма Lactobacillus jensenii BKM В-2834D, консорциума 1 и консорциума 2.

Исследование антагонистической активности культур лактобацилл проводят методом двухслойного агара [21]. Результаты исследований приведены в табл.4. Антагонистическую активность лактобацилл в отношении грибов рода Candida выражают минимальной ингибирующей концентрацией антагониста (МИКА, lg КОЕ/мл) - это минимальное количество антагониста, ингибирующего размножение индикаторной культуры.

Результаты исследований приведены в табл.5. Штамм Lactobacillus jensenii BKM В-2834D обладает широким спектром антагонистической активности. Различия в антагонистической активности штамма Lactobacillus jensenii BKM В-2834D и консорциума 1, содержащего штаммы Lactobacillus crispatus BKM B-2727D, Lactobacillus gasseri BKM B-2728D, Lactobacillus plantarum BKM B-2731D по отношению к Neisseria gonorrhoeae штамм 283 являются статистически недостоверными. Добавление штамма Lactobacillus jensenii BKM В-2834D к консорциуму 1 приводит к достоверному увеличению антагонистической активности нового пробиотического препарата - консорциума 2 - по сравнению с консорциумом 1 и отдельно используемым штаммом Lactobacillus jensenii BKM В-2834D (р<0,05). Антагонистическая активность консорциума 1 по отношению к G.vaginalis (этиологический агент бактериального вагиноза) достоверно выше по сравнению со шаммом Lactobacillus jensenii BKM В-2834D (р<0,05). При совместном применении шамма Lactobacillus jensenii BKM В-2834D со штаммами консорциума1 Lactobacillus crispatus BKM B-2727D, Lactobacillus gasseri BKM B-2728D, Lactobacillus plantarum BKM B-2731D (консорциум 2) отмечается синергизм их действия. Антагонистическая активность консорциума 2 достоверно выше по сравнению с консорциумом 1 (р<0,05).

Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о том, что консорциум 2 проявляет более выраженную антагонистическую активность по сравнению с консорциумом 1 и штаммом Lactobacillus jensenii BKM В-2834D.

Штамм Lactobacillus jensenii BKM В-2834D проявляет в равной степени антагонистическую активность по отношению ко всем разновидностям грибков рода Candida (С. albicans, С. tropicalis, С. glabrata, С. krusei).

Пример 7. Снижение восприимчивости мышей Balb/c к экспериментальной гонококковой инфекции.

Эффективность применения Lactobacillus jensenii BKM В-2834D и консорциума 2 с целью снижения восприимчивости к гонококковой инфекции оценивают в опытах in vivo на мышах Balb/c по методу, предложенному в работе [22]. Мышей заражают интравагинально N. gonorrhoeae в дозе 106 КОЕ/мл. В данной работе использовали N. gonorrhoeae штамм 283.

Для интравагинального заражения животных культуру N. gonorrhoeae штамм 283 выращивают в течение 18 часов на GC - агаре (Becton Dickinson, США). Образцы вагинального отделяемого мышей получают с помощью ватных тампонов, которые после взятия исследуемого материала помещают в 1 мл физиологического раствора. Забор вагинального отделяемого проводят ежедневно в течение 10 дней и анализируют с помощью культуральных методов. Для выявления N. gonorrhoeae образцы вагинального отделяемого в физиологическом растворе высевают на GC-VCNTS агар (Becton Dickinson, США) и подсчитывают число выросших колоний. Восприимчивость мышей к экспериментальной гонококковой инфекции оценивают по изменению инфицированности влагалища животных под влиянием интравагинального введения лактобацилл. Инфицированность влагалища мышей определяют по количеству выросших колоний N. gonorrhoeae, выраженному в десятичном логарифме колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 мл. Для выявления лактобацилл образцы вагинального отделяемого в физиологическом растворе высевают на агаризованную среду МРС (Himedia, Индия).

Идентификацию штаммов Lactobacillus jensenii BKM В-2834D, Lactobacillus crispatus BKM B-2727D, Lactobacillus gasseri BKM B-2728D, Lactobacillus plantarum BKM B-2731D проводят методом геномного фингерпринтинга с применением ERIC-праймеров и ВОХА-1, BOXS1 - праймеров [23]. В опытах используют 24 мыши Balb/c (возраст 6 недель). Животных разделяют на 4 группы по 6 животных в каждой.

Животным группы 1 вводят интравагинально однократно 106 КОЕ/мл N. gonorrhoeae (контроль).

Животным группы 2 вводят интравагинально однократно 106 КОЕ/мл N. gonorrhoeae. Через 2 часа вводят дополнительно интравагинально 6×107 КОЕ/мл Lactobacillus jensenii BKM В-2834D.

Животным группы 3 вводят интравагинально однократно 106 КОЕ/мл N. gonorrhoeae. Через 2 часа вводят дополнительно интравагинально 6×107 КОЕ/мл консорциум 1, содержащий 2×107 КОЕ/мл Lactobacillus crispatus BKM B-2727D, Lactobacillus gasseri BKM B-2728D, Lactobacillus plantarum BKM B-2731D.

Животным группы 4 вводят интравагинально однократно 106 КОЕ/мл N. gonorrhoeae. Через 2 часа вводят дополнительно интравагинально 6×107 КОЕ/мл консорциум 2, содержащий 1,5×107 КОЕ/мл Lactobacillus jensenii BKM В-2834D), 1,5×107 КОЕ/мл Lactobacillus crispatus BKM B-2727D, 1,5×107 КОЕ/мл Lactobacillus gasseri BKM B-2728D, 1,5×107 КОЕ/мл Lactobacillus plantarum BKM B-2731D.

Результаты исследований, приведенные на чертеже, показывают, что консорциум 2, содержащий штаммы Lactobacillus jensenii BKM В-2834D, Lactobacillus crispatus BKM B-2727D, Lactobacillus gasseri BKM B-2728D, Lactobacillus plantarum BKM B-273 ID, наиболее эффективно снижает восприимчивость мышей Balb/c к гонококковой инфекции. У животных в группе 2 на протяжении всего периода наблюдения в вагинальном отделяемом обнаруживается штамм Lactobacillus jensenii BKM В-2834D. У животных в группе 3 обнаруживаются все штаммы лактобацилл, входящие в консорциум 1, а в группе 4 обнаруживаются все штаммы лактобацилл, входящие в состав консорциума 2.

Таким образом, проведенные исследования позволяют предложить штамм Lactobacillus jensenii BKM В-2834D и консорциум, содержащий штаммы Lactobacillus jensenii BKM В-2834D, Lactobacillus crispatus BKM B-2727D, Lactobacillus gasseri BKM B-2728D, Lactobacillus plantarum BKM B-2731D, для использования в производстве пробиотических бактериальных препаратов для профилактики и лечения урогенитальных инфекционных заболеваний и инфекций, передаваемых половым путем.

Литература

1. Кочеровец В.И., Бунятян Н.Д. Нормальная микрофлора женских мочеполовых путей и препараты для ее коррекции. Учебное пособие. - М.: Издательский дом «АКТЕОН», 2011, 72 с.

2. Анкирская А.С. Акушерство и гинекология, 2005, №3.

4. Redondo-Lopez V., Veriwether С, Schmitt С, et al., Vullvovaginal candidiasis complicating recruitment bacterial vaginosis. Sex. Transm. Dis. 1990.17, 51-53.

3. Sobel JD (2007) Vulvovaginal candidiasis. Lancet 369: 1961-1971. doi: 10.1016/S0140-314 6736(07)60917-9.

5. Кубанова А.А. Анализ эпидемиологической ситуации по заболеваемости инфекциями, передаваемыми половым путем, болезнями кожи и подкожной клетчатки населения Российской Федерации по данным официальной государственной статистики // Вестн. дерматол. и венерол. - 2008. - №5. - С. 8-18.

6. Centers for Disease Control and PreventionSexually Transmitted Diseases in the United States, 2008.

National Surveillance Data for Chlamydia, Gonorrhea, and Syphilis. Avaluated at: http://www.cdc.gov/std/stats08/trends.htm.

7. Bignell C. 2009 European (IUSTI/WHO) guideline on the diagnosis and treatment of gonorrhoea in adults // Int. J. STD & AIDS. - 2009. - V. 20, n. 7. - P. 453-457.

8. European health for all database (HFA-DB) World Health Organization Regional Office // Avaluated at: http://data.euro.who. int/hfadb/

9. Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology", 241, - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1980.

10. Резистентность возбудителей ИППП к антибактериальным препаратам. Информационный бюллетень, 2010 год. - М.: ООО «ДЭКС-ПРЕСС», 2010.

11. Workowski К.А. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2010 / K.A. Workowski, S. Berman // MMWR Recomm. Rep. - 2010. - V. 59 (RR-12). - P. 1-110.

12. Chandeying V. The prevalence of urethral infections amongst asymptomatic young men in Hat Yai, southern Thailand /V.Chandeying, S. Skov, P. Duramad et al // Int. J. STD AIDS. - 2000. - V. 11, n. 6. - P. 402-405.

13. Simonsen G.C. The antimicrobial resistance containment and surveillance approach - a public health tool / G.C. Simonsen, J.W. Tapsall, B. Allegranzi et al // Bull WHO - 2004. - V. 82. - P. 928-934.

14. Fischer S.H. Gonococci possessing only certain P.II outer membrane proteins interact with human neutrophils / S.H. Fischer, R.F. Rest // Infect. Immun. - 1988. - V. 56, n. 6. - P. 1574-1579.

15. Wiesenfeld, H.C., S.L. Hillier, M.A. Krohn, D.V. Landers, and R. Sweet. 2003. Bacterial vaginosis is a strong predictor of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis infection. Clin. Infect. Dis. 36:663-668.

16. Патент EP 2509610 B1.

17. Патент РФ RU 2504580 C1.

18. ГОСТ 3624-92. Молоко и молочные продукты. Титриметрические методы определения кислотности.

19. ReidG. robiotic agents to protect the urogenital tract against infections. Am. J. Clin. Nutr., 2001, 73 (Suppl.): 437-443.

20. Martin R., Suárez J. Biosynthesis and Degradation of H2O2 by Vaginal http://Lactobacilli.2010.Appl. Environ. Microbiol. vol. 76 no. 2 p. 400-405.

21. Ермоленко Е.И., Исаков B.A., Ждан-Пушкина С.Х., Тец В.В. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл. // Журн. микробиол., эпидем., иммунобиол. - 2004. - 5. - С. 94-98.

22. Jerse А. Е. Experimental Gonococcal Genital Tract Infection and Opacity Protein Expression in Estradiol-Treated Mice. INFECTION AND IMMUNITY, 1999, 67, 5699-5708.

23. Цыганкова С, Булыгина E., Кузнецов Б. и др. Получение внутрипопуляционных диссоциантов некоторых бацилл и применение метода DIR-ПЦР для их идентификации. Микробиология. 2004. Т. 73. №3. 398-405.

1. Штамм бактерий Lactobacillus jensenii ВКМ В-2834D, обладающий широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.

2. Консорциум штаммов Lactobacillus jensenii ВКМ В-2834D, Lactobacillus crispatus ВКМ B-2727D, Lactobacillus gasseri ВКМ B-2728D, Lactobacillus plantarum ВКМ B-2731D, обладающий пробиотическими свойствами и используемый для изготовления бактериальных препаратов.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области биохимии, в частности к биологически активным соединениям, проявляющим антибактериальную активность. Заявлен природный гликопептидный антибиотик ИНА 5812, который может быть применен в качестве лекарственного препарата в медицинской практике.

Изобретение относится к области экологии. Предложен способ очистки водной среды от нефти и нефтепродуктов.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для культивирования дифтерийных микробов на искусственных двухфазных питательных средах.
Группа изобретений относится к вариантам штамма Saccharomyces cerevisiae, подходящего для выработки пекарских дрожжей, и их применению. Предложены штамм Saccharomyces cerevisiae CNCM I-4312, штамм Saccharomyces cerevisiae CNCM I-4313, штамм Saccharomyces cerevisiae CNCM I-4409 или штамм Saccharomyces cerevisiae CNCM под №I-4410, используемые в качестве пекарских дрожжей и являющиеся осмоустойчивыми, имеющими наследуемую сопротивляемость к слабым органическим кислотам.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Enterococcus faecium Ef79OSAU, обладающий антагонистической активностью в отношении бактерий рода Listeria и вида Enterococcus faecalis, депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры человека (ГКНМ) ФБУН «МНИИЭМ им Г.Н.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения фукозы и фукозосодержащих гидролизатов из бурых водорослей. Способ получения фукозы и фукозосодержащих гидролизатов из бурых водорослей заключается в том, что измельченную бурую водоросль рода Fucus заливают этанолом, экстрагируют, экстракт отделяют, затем обработанную водоросль экстрагируют раствором соляной кислоты, экстракт концентрируют, нейтрализуют, упаривают и получают концентрат, содержащий полисахарид-1, из которого этанолом осаждают фукоидан (F1), после выделения F1 обработанную водоросль дважды экстрагируют горячей водой, экстракты объединяют и концентрируют, полученный концентрат упаривают и получают полисахарид-2, доводят pH концентрата до значения 2,0-2,5, выпавший осадок полиманнуроновой кислоты отделяют центрифугированием, супернатант нейтрализуют и осаждают этанолом фукоидан (F2), осадок промывают этанолом и высушивают, обе фракции фукоидана F1 и F2 соединяют и растворяют в дистиллированной воде, раствор фукоидана подвергают диализу, далее фукоидан осаждают двумя объемами этанола, осадок дважды промывают этанолом, высушивают, высушенный фукоидан растворяют в дистиллированной воде и проводят ферментативный гидролиз, полученную фукозу сушат, для получения фукозосодержащих гидролизатов высушенный фукоидан растворяют в дистиллированной воде и проводят ферментативный гидролиз, полученные фукозосодержащие гидролизаты сушат при определенных условиях.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и представляет собой бактериальную клетку, способную реплицироваться в среде, содержащей по меньшей мере один тяжелый металл, выбранный из ртути, кадмия, цинка и свинца.

Предложены препарат для биодеградации нефтепродуктов и способ его получения. Препарат включает ассоциацию бактерий Bacillus megaterium ВКМ В-396, Bacillus subtilis ВКПМ В-5328, Pseudomonas putida BKM В-1301, Pseudomonas putida ВКПМ В-5624, Rhodococcus erythropolis ВКПМ AC-1269, иммобилизованную на глауконитсодержащем носителе в количестве 108-1010 клеток/г.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве симбиотических препаратов. Защитная среда высушивания для получения симбиотического препарата содержит желатин, сахарозу, пищевой хитозан и калий фосфатный буфер в заданных соотношениях.

Изобретение относится к области биохимии. Способ определения токсичности среды включает определение показателей роста тест-культур в контроле и опыте.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к биологически активным соединениям, проявляющим антибактериальную активность. Заявлен природный гликопептидный антибиотик ИНА 5812, который может быть применен в качестве лекарственного препарата в медицинской практике.

Изобретение относится к биотехнологии. Питательная среда для глубинного культивирования бактерий Bacillus subtilis BN-135 содержит муку ржаную гидролизованную или муку ячменную гидролизованную, кукурузный экстракт, аммоний фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций хлористый, натрий углекислый и водопроводную воду при заданном соотношении компонентов.

Изобретение относится к области экологии. Предложен способ очистки водной среды от нефти и нефтепродуктов.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для культивирования дифтерийных микробов на искусственных двухфазных питательных средах.

Предложен штамм микромицета Clonostachys candelabrum, обладающий антибактериальной активностью в отношении возбудителя туляремии Francisella tularensis 15/10. Штамм микромицета выделен из почвы и депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов (ГКПМ-Оболенск) под регистрационным номером F-1466.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ получения терминального алкена, в конкретном варианте - изобутелена, применение мевалонатдифосфат декарбоксилазы и микроорганизма, продуцирующего мевалонатдифосфат декарбоксилазу, для получения терминального алкена, а также композиция для получения терминального алкена.

Группа изобретений относится вариантам добавок к питательной среде для формирования бактериальных биопленок. Предложена добавка, состоящая из биополимера фибрина в количестве от 0,05 г до 10 г на 1 кг питательной среды и ингибитора протеиназ.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Enterococcus faecium Ef79OSAU, обладающий антагонистической активностью в отношении бактерий рода Listeria и вида Enterococcus faecalis, депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры человека (ГКНМ) ФБУН «МНИИЭМ им Г.Н.

Предложен способ определения антиоксидантной активности вещества, предусматривающий приготовление контрольных проб, содержащих буферный раствор и биолюминесцентный сенсор, определения исходной интенсивности биолюминесценции.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к пероральной композиции для снижения холестерина в сыворотке у субъекта. Данная композиция содержит пробиотические бактерии Lactobacillus reuteri NCIMB 701359 с высокой активностью гидролазы солей желчных кислот bsh, их изолят или супернатант и носитель.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой средство для лечения и профилактики дисбактериоза кишечника, характеризующееся тем, что оно представлено в виде таблетки и содержит Bifidobacterium bifidum штамм №1, лиофилизированный в среде культивирования с активностью 1×104-1×1010 КОЕ /г, кальция стеарат, тальк, топинамбур и лактозу, причем компоненты в средстве находятся в определенном соотношении в мас.
Наверх