Штамм бактерий pseudomonas denitrificans, обладающий свойством утилизировать фенантрен



Штамм бактерий pseudomonas denitrificans, обладающий свойством утилизировать фенантрен
Штамм бактерий pseudomonas denitrificans, обладающий свойством утилизировать фенантрен
Штамм бактерий pseudomonas denitrificans, обладающий свойством утилизировать фенантрен

 


Владельцы патента RU 2575064:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Новосибирский национальный исследовательский государственный университет" (Новосибирский государственный университет, НГУ) (RU)

Изобретение относится к области микробиологии. Предложен бактериальный штамм Pseudomonas denitrificans ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» В-1299. Штамм утилизирует фенантрен за 14 суток на 83,2%, а в присутствии детергента ТВИН-20 - за 1 сутки на 100%. Штамм может быть использован для получения препарата для очистки почвы, грунтовых и поверхностных вод от фенантрена. 3 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к области микробиологии и представляет собой новый бактериальный штамм, который может быть использован для очистки почвы, грунтовых и поверхностных вод при попадании в окружающую среду фенантрена.

Известны штаммы микроорганизмов: Pseudomonas alcaligenes Е7 [1], Trichoderma lignorum Л-1 ГКМ ВИЗР N 103 [2], Pseudomonas alcaligenes B-l [3], Mycobacterium flavescens EX-91 [4], Rhodococcus species 56Д [5], Pseudomonas putida 9 [6], Rhodococcus species MFN [7], которые могут разлагать углеводороды нефти, в том числе и ПАУ в почве и воде.

Недостатком вышеперечисленных штаммов является то, что они осуществляют деструкцию полициклических ароматических углеводородов, в том числе фенантрена, в течение длительного времени (от 5 до 20 суток).

Наиболее близким из указанных штаммов является Alteromonas sp. SN2. Его основным недостатком является то, что начало разрушения фенантрена фиксируется только на 2 сутки, на 5 сутки фиксируется разрушение 17% фенантрена, на 15 сутки фиксируется разрушение 50% фенантрена, а 100% разрушение достигается к 20 суткам.

Загрязнение окружающей среды ПАУ представляет серьезную угрозу здоровью населения и природе. Ароматические углеводороды - наиболее токсичные компоненты нефти [12]. Они являются хроническими токсикантами [13]. Наиболее опасна группа полиароматических углеводородов (ПАУ) [14, 15]. Источники ПАУ разнообразны. Они встречаются в нефти, отложениях смолы и каменного угля, а также выступают в роли побочных продуктов при сгорании топлива. В нефтях идентифицированы фенантрены, хризены, пирены, бензпирены, тетрафены [16]. Фенантрен - трициклический ароматический углеводород, класс опасности 2, обнаружена канцерогенность на мышах, вызывает тенденцию к лейкоцитозу, нарушению функции печени [17]. Предельно допустимая концентрация фенантрена в воздухе - 0,8 мг/м3. В исследовании 2010 года Стивена С. Хехта и его коллег [18] было показано, что фенантрен, содержащийся в сигаретном дыме, может разрушать ДНК после попадания в кровь.

Задача изобретения состоит в получении нового штамма микроорганизмов, быстро и эффективно утилизирующего in situ в почвах, грунтовых и поверхностных водах фенантрен при кислых и нейтральных условиях среды (рН 5-7)

Технический результат - получен штамм бактерий Pseudomonas denitrificans Fdl, эффективно утилизирующих in situ в почвах, грунтовых и поверхностных водах фенантрен при кислых и нейтральных условиях среды (рН 5-7) в течение 2 суток на 96,6-100%.

Штамм может быть использован для получения препарата для очистки почвы, грунтовых и поверхностных вод при попадании в окружающую среду фенантрена. Штамм может быть использован в качестве компонента при конструировании препаратов для биоремедиации загрязненных нефтью территорий, а также как источник ферментов для получения производных ароматических соединений в химической промышленности.

Источник выделения штамма

Предлагаемый штамм Pseudomonas denitrificans Fdl выделен из подзолистой нефтезагрязненной почвы, отобранной на юге ЯНАО (Пуровский район), путем культивирования навески почвы в жидкой минеральной среде, содержащей в 1 дм3: 1,0 г (NH4)2SO4; 5,0 г КН2РО4; 0,1 г MgSO4·7H2O; 5 мг Fe(NH4)2(SO4)2; 1 мл раствора микроэлементов, содержащего в 1 дм3: 23 мг MnCL2·2H2O; 31 мг Н3ВO3; 36 мг СоСl2·6Н2O; 10 мг СuСl2·2Н2O; 20 мг NiСl2·6Н2О; 50 мг ZnCl2; 30 мг NaMoO4·2H2O. Вода дистиллированная - до 1 дм3; рН=7,0 в присутствии фенантрена в количестве 100 мг на 1 дм3 питательной среды.

Индивидуальный штамм был выделен из полученной культуральной среды путем пересевов индивидуальных колоний на чашках с минимальным агаром А [8], который содержит в 1 дм3: 1,0 г (NH4)2SO4; 5,0 г KН2РO4; 0,1 г MgSO4·7H2O; 5 мг Fe(NH4)2(SO4)2; 1 мл раствора микроэлементов, содержащего в 1 дм3: 23 мг МnСL2·2Н2O; 31 мг Н3ВО3; 36 мг СоСl2·6Н2O; 10 мг СuСl2·2Н2O; 20 мг NiCl2·6H2O; 50 мг ZnCl2; 30 мг NaMoO4·2H2O; 25 г Агар-агар; Вода дистиллированная - до 1 дм3; рН=7,0 в присутствии фенантрена в количестве 100 мг на 1 дм3 питательной среды.

Штамм Pseudomonas denitrificans Fdl идентифицирован в соответствии с данными секвенирования участка 16s rRNA и с определителем Берга [9] и депонирован в «Коллекции бактерий, грибов и бактериофагов» ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», п. Кольцово, Новосибирская область под номером В-1299.

Предлагаемый штамм характеризуется следующими морфологическими и физиолого-биохимическими признаками. Клетки представляют собой грамотрицательные подвижные палочки, расположенные по 1-2, чаще одиночные, с размером 0,4-0,5×1,5-2,5 мкм, неспороносные, не формирующие эндоспор, оксидазо- и каталазо-положительные. На мясо-пептонном агаре (МПА) образует серовато-белые мелкоморщинистые колонии с волнистыми краями, слегка врастающими в агар, вязкой консистенции. Рост в жидкой среде сопровождается помутнением среды, образованием пленки серовато-белого цвета и осадка.

Культура ферментирует глюкозу, мальтозу, ксилозу. Не продуцирует амилазу, лецитиназу, желатиназу, уреазу. Не гидролизует казеин, не образует индол и сероводород. Утилизирует цитрат, восстанавливает нитрат. Реакция Фегес-Проскауэра отрицательная. При росте не происходит гемолиза, отсутствует плазмокоагулаза, фенилаланиндезаминаза. Отсутствует фибринолитическая активность.

Культура использует в качестве единственного источника углерода фенантрен, фенантрен с детергентом ТВИН-20.

Штамм хорошо растет на богатых питательных средах на основе мясопептонного бульона и ферментативного гидролизата рыбной муки.

Условия хранения: в лиофилизированном состоянии при 4°С - 3 года; на мясо-пептонном агаре при 4°С две недели, в пробирках на скошенном агаре под стерильным вазелиновым маслом при 4°С до года.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1

Штамм бактерий Pseudomonas denitrificans Fdl выращивают аэробно в жидкой среде на мясо-пептонном бульоне (рН=7.0) с 100 мг/дм3 фенантрена на качалке при 150 об/мин и температуре 35±2°С в течение 18 часов. Титр выросшей культуры составляет 5×109 колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 см3 питательной среды.

Пример 2

Штамм Pseudomonas denitrificans Fdl выращивают на жидкой минеральной среде, содержащей в 1 дм3: 1,0 г (NH4)2SO4; 5,0 г KН2РO4; 0,1 г MgSO4·7H2O; 5 мг Fe(NH4)2(SO4)2; 1 мл раствора микроэлементов, содержащего в 1 дм3: 23 мг MnCL2·2H2O; 31 мг Н3ВО3; 36 мг СоСl2·6Н2O; 10 мг СuСl2·2Н2O; 20 мг NiCl2·6H2O; 50 мг ZnCl2; 30 мг Na2MoO4·2H2O. Вода дистиллированная - до 1 дм3; рН=7,0. В присутствии фенантрена в количестве 100 мг на 1 дм3 питательной среды в качестве единственного источника углерода. Опыт проводят в четырех повторностях.

В колбы объемом 100 см3 вносят по 30 см3 минеральной среды и по 3 мг фенантрена. Колбы засевают клетками штамма Pseudomonas denitrificans Fdl до концентрации 1·107 КОЕ/см3. В качестве контролей используют незасеянные колбы со средой, а также с фенантреном. Колбы культивируют на качалке при 150 об/мин и 35°С течение 14 суток. Эффективность биодеградации определяют после экстракции циклогексаном путем измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 254 нм. Результаты эксперимента представлены в таблице 1. Полученные результаты показывают, что в течение 14 суток при 35°С штамм Fdl утилизирует фенантрен на 83,2±5,7% (таблица1).

Примечание: М - среднее четырех повторностей; m - доверительный интервал с вероятностью 95%

Пример 3

Штамм Pseudomonas denitrificans Fdl выращивают на жидкой минеральной среде, содержащей в 1 дм3: 1,0 г (NH4)2SO4; 5,0 г KН2РO4; 0,1 г MgSO4·7H2O; 5 мг Fe(NH4)2(SO4)2; 1 мл раствора микроэлементов, содержащего в 1 дм3: 23 мг MnCL2·2Н2O; 31 мг Н3ВО3; 36 мг СоСl2·6Н2O; 10 мг СuСl2·2Н2O; 20 мг NiCl2·6H2O; 50 мг ZnCl2; 30 мг NaMoO4·2H2O. Вода дистиллированная - до 1 дм3; рН=7,0. В присутствии 100 мг фенантрена и 7,5 г детергента ТВИН-20 на 1 дм3 питательной среды. Опыт проводят в четырех повторностях. В колбы объемом 100 см3 вносят по 30 см3 минеральной среды, по 3 мг фенантрена и по 250 мг детергента ТВИН-20. Колбы засевают клетками штамма Pseudomonas denitrificans Fdl до концентрации 1·107 KOE/cм3. В качестве контролей используют незасеянные колбы со средой, а также с фенантреном. Колбы культивируют на качалке при 150 об/мин и 35°С в течение 24 часов. Эффективность биодеградации определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Результаты эксперимента представлены в таблице 2. Полученные результаты показывают, что в течение 24 часов при 35°С, рН=7.0 штамм Pseudomonas denitrificans Fdl утилизирует фенантрен на 100% (таблица 2).

Примечание: М - среднее четырех повторностей; m - доверительный интервал с вероятностью 95%

Пример 4

Штамм Pseudomonas denitrificans Fdl выращивают на жидкой минеральной среде, содержащей в 1 дм3: 1,0 г (NH4)2SO4; 5,0 г KН2РO4; 0,1 г MgSO4·7H2O; 5 мг Fe(NH4)2(SO4)2; 1 мл раствора микроэлементов, содержащего в 1 дм3: 23 мг МnСL2·2Н2О; 31 мг Н3ВО3; 36 мг СоСl2·6Н2O; 10 мг СuСl2·2Н2O; 20 мг NiCl2·6Н2O; 50 мг ZnCl2; 30 мг NaMoO4·2H2O. Вода дистиллированная - до 1 дм3; рН=5,0. В присутствии фенантрена в количестве 100 мг на 1 дм3 питательной среды в качестве единственного источника углерода. Опыт проводят в четырех повторностях. В колбы объемом 100 см3 вносят по 30 см3 минеральной среды и по 3 мг фенантрена. Колбы засевают клетками штамма Pseudomonas denitrificans Fdl до концентрации 1·107 КОЕ/см3. В качестве контролей используют незасеянные колбы со средой, а также с фенантреном. Колбы культивируют на качалке при 150 об/мин и 35°С в течение 14 суток. Эффективность биодеградации определяют после экстракции циклогексаном путем измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 254 нм. Результаты эксперимента представлены в таблице 3. Полученные результаты показывают, что в течение 14 суток при 35°С, рН=5,0 штамм Pseudomonas denitrificans Fdl утилизирует фенантрен на 76,6±4,5% (таблица 3).

Примечание: М - среднее четырех повторностей; m - доверительный интервал с вероятностью 95%

Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является то, что он при температуре 35°С, рН=7.0 утилизирует фенантрен за 14 суток на 83,2±5,7% (100 мг/л), в присутствии детергента ТВИН-20 за 1 сутки на 100% (100 мг/л).

Источники информации

1. Патент России №2134723, кл. С12N 1/20. Штамм Pseudomonas alcaligenes Е7, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1999.

2. Патент России №2157842, кл. С12N 1/26. Штамм Trichoderma lignorum Л-1 ГКМ ВИЗР №103 для окисления углеводородов нефти и нефтепродуктов. - 2000.

3. Патент России №2133770, кл. С12N 1/20. Штамм Pseudomonas alcaligenes В-1, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1999.

4. Патент России №92005971, кл. С12N 1/20. Штамм Mycobacterium flavescens ЕХ-91, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1996.

5. Патент России №95119734, кл. С12N 1/20. Штамм Rhodococcus species 56D, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1998.

6. Патент России №2134722, кл. С12N 1/20. Штамм Pseudomonas putida 9, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1999.

7. Патент России №2133769, кл. С12N 1/20. Штамм Rhodococcus species MFN, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1998.

8. Дэвис Р., Бодстайн Д., Рот Дж. Методы генетической инженерии. Генетика бактерий. Пер. с англ. под редакцией чл. - корр. АН СССР Р.Б. Хесина. - М.: Мир, 1984-176 с.

9. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Ninth Edition. Baltimore, Maryland: Williams&Wilkins, 1994. - 787 p.

10. Патент Республики Корея KR 20110059478 (А), кл. A62D 3/02; B09C 1/10; C12N 1/20. NEW MICROBIAL STRAIN ALTEROMONAS SP. SN2 FOR DEGRADING POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBON. - 2011.

11. Патент США US 6503746 (B1), кл. B09B 3/00; B09C 1/10; C02F 3/34; C12N 1/20. Biologically pure Paenibacillus validus bacterial strains that degrade polyaromatic hydrocarbons. - 2003.

12. Mitchell R., Togel S., Chet I. Bacterial chemoreception. An important ecological phenomenon inhibited by hydrocarbons. 1972, Water Res. 6: 1137-1140.

13. Baker, J.M. Growth stimulation following oil pollution. In: Cowell EB (ed.) The ecological effects of oil on pollution and littoral communities. 1971, London Inst, of Petroleum, 72-77.

14. Ильницкий А.П., Лемвик Ж.Л., Шабад Л.М. О распределении канцерогенных углеводородов в пресноводных водоемах. - В кн. Канцерогенные вещества в окружающей среде. 1979, М. с. 48-53.

15. Шабад Л.М. О циркуляции канцерогенов в окружающей среде. 1973, М.: Медицина. 300 с.

16. Алексеева Т.А., Теплицкая Т.А. Спектрофлуориметрические методы анализа ароматических углеводородов в природных и техногенных средах. Под ред. Ф. Я. Ровинского. 1981, Л. Гидрометеоиздат, 215 с.

17. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ по измерению концентраций 3,4-бензпирена и некоторых других полиароматических углеводородов (ПАУ) (нафталин, фенантрен, антрацен, 1,2-бензантрацен, пирен, 3-метилхолантрен, 1,12-бензперилен) в воздухе рабочей зоны методом жидкостной хроматографии. №5879-91 от 10.09.1991.

18. Zhong Y., Carmella S.G., Upadhyaya P., Hochalter J.B., Rauch D., Oliver A., Jensen J., Hatsukami D., Wang J., Zimmerman C, Hecht S.S. Immediate Consequences of Cigarette Smoking: Rapid Formation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Diol Epoxides // Chemical Research in Toxicology, 2010; 101227010050010. DOI: 10.1021 / tx100345x.

Штамм бактерий Pseudomonas denitrificans ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» №12999, обладающий свойством утилизировать фенантрен.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Предложен новый бактериальный штамм Pseudomonas delhiensis KТ-13 ВКПМ В-11400 - деструктор нефти и нефтепродуктов.

Изобретение относится к фотобиотехнологии. Штамм микроводорослей Haematococcus pluvialis ВМ1 депонирован в Российской Коллекции Микроводорослей при учреждении Институт физиологии растений им.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ испытания чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам, применение индикатора для вышеуказанного способа, где индикатором является теллурит или смесь теллурита и мочевины, твердая среда для способа испытания чувствительности, применение твердой среды, нагревательный термостат для способа испытания чувствительности и бокс культивирования для способа испытания чувствительности.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способы получения полимера, включающего фукозу, полимер, содержащий фукозу, и его применения.

Изобретение относится к хлебопекарной промышленности. Настоящее изобретение предлагает дрожжи, пригодные для производства хлебобулочных изделий с применением большого количества дрожжей, а также композиции, которые могут дать хлебобулочное изделие, содержащие указанные дрожжи.

Заявленная группа изобретений относится к биотехнологии. Штамм Lactobacillus jensenii депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им Г.К.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к биологически активным соединениям, проявляющим антибактериальную активность. Заявлен природный гликопептидный антибиотик ИНА 5812, который может быть применен в качестве лекарственного препарата в медицинской практике.

Изобретение относится к области экологии. Предложен способ очистки водной среды от нефти и нефтепродуктов.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для культивирования дифтерийных микробов на искусственных двухфазных питательных средах.
Группа изобретений относится к вариантам штамма Saccharomyces cerevisiae, подходящего для выработки пекарских дрожжей, и их применению. Предложены штамм Saccharomyces cerevisiae CNCM I-4312, штамм Saccharomyces cerevisiae CNCM I-4313, штамм Saccharomyces cerevisiae CNCM I-4409 или штамм Saccharomyces cerevisiae CNCM под №I-4410, используемые в качестве пекарских дрожжей и являющиеся осмоустойчивыми, имеющими наследуемую сопротивляемость к слабым органическим кислотам.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ очистки от нефти и нефтепродуктов солоноватоводных и морских объектов и экосистем.

Изобретение относится к охране окружающей среды, в частности к экологической биотехнологии, микробиологии. Предложен консорциум микроорганизмов Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, взятых в соотношении 1:1, для очистки различных типов мерзлотных почв от нефтезагрязнений.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм Microbacterium species BKM Ac-2614D для очистки загрязненных и хронически загрязненных пресноводных объектов в температурном диапазоне от +2ºC до +25ºC.

Изобретение относится к области микробиологии. Предложен штамм бактерий Pseudomonas stutzeri ВКПМ B-11230 - деструктор нефтяных алифатических и ароматических углеводородов, стимулятор роста растений в ассоциации с растениями.
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для очистки почв, вод, сточных вод, шламов от нефти и нефтепродуктов. Штамм Rhodotorula sp.
Изобретение относится к области микробиологии. Предложен штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum ВКПМ B-11011, обладающий способностью быстро утилизировать нефть, дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат.
Изобретение относится к области микробиологии. Предложен штамм бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 - деструктор нефти и нефтепродуктов.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки загрязненных нефтью почв. Препарат, содержащий биодеструктор нефтяного загрязнения, представляет собой фугат культуральной жидкости микробной массы консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов, иммобилизованных на торфоносителе.

Изобретение относится к области инженерной экологии. Устройство для финишной очистки морских прибрежных вод, представляющее собой санитарную водорослевую плантацию, включающую силовые пропиленовые канаты диаметром 30-40 мм, удерживаемые в горизонтальном положении металлическими тросами, прикрепленными к гравитационным якорям через крепежные элементы плавучих буев, соединенных с силовыми канатами.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, разрушающих нефть. .

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Предложен новый бактериальный штамм Pseudomonas delhiensis KТ-13 ВКПМ В-11400 - деструктор нефти и нефтепродуктов.
Наверх