Способ оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии при специфической активации антигеном

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов. Для этого используют бруцеллин для специфической активации лимфоцитов. Детекцию бластных форм лимфоцитов проводят с помощью моноклональных антител к CD34 с последующим подсчетом клеток методом проточной цитофлуориметрии. Использование данного способа позволяет проводить учет активированных бруцеллином лимфоцитов в РБТЛ с использованием моноклональных антител CD34 у больных бруцеллезом и здоровых доноров. 1 табл.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки интенсивности специфической активации антигеном лимфоцитов крови человека. Для этого проводят оценку реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) при стимуляции их в течение 72 часов антигеном, иммунофлуоресцентным методом на проточном цитофлуориметре. В качестве маркера бластных форм лимфоцитов используют моноклональные антитела к CD34.

Пролиферативный ответ лимфоцитов на определенный антиген дает представление о наличии и выраженности специфической сенсибилизации организма. Специфическими митогенами являются растворимые и корпускулярные антигены, которые вовлекают в процесс бласттрансформации иммунные к ним Т- и В-лимфоциты. В отличие от неспецифических стимуляторов, антигены активируют только те лимфоциты, которые несут специфические к нему рецепторы.

РБТЛ изучают в культуре лимфоцитов in vitro. При постановке РБТЛ у человека берут кровь, выделяют из нее лейкоциты и вносят их в среду 199, затем добавляют специфический антиген или митоген. Учет реакции после стимуляции антигенами производят через 3-5 суток. Под влиянием специфических антигенов в бласты трансформируются не более 7-12% малых лимфоцитов.

Количество образовавшихся бластных клеток в мазках крови определяют с использованием обзорной окраски по Романовскому-Гимзе [B.C. Камышников, 2011]. Однако из-за низкой объективности и трудоемкости (подсчет не менее 1000 лимфоцитов) учета результатов реакции микроскопическим методом был заменен на метод с использованием радиоактивной метки 3Н-тимидина, которая при инкубации встраивается в бласттрансформированные лимфоциты, с последующим подсчетом радиоактивности на автоматическом сцинтилляционном β-счетчике [Дж. М. Клаус, 1990]. Использование радиоактивной метки в РБТЛ считается объективным методом учета при исследовании функционального состояния лимфоцитов в качестве показателя активности клеточного иммунитета, который описан как в отечественной, так и в зарубежной литературе [К.А. Лебедев, И.Д. Понякин, 2003; Л. Йегер, 2007; Т.В. Ferreira et all, 2014; J. Kolata et all, 2015]. Однако необходимость использования радиоактивного 3Н-тимидина в качестве метки для оценки функционального состояния лимфоцитов при антигенной стимуляции в РБТЛ резко ограничивает широкое внедрение метода в лабораторную практику, так как требует специальных условий для его проведения. Прототипом предлагаемого способа, можно считать метод использования моноклональных антител к рецептору Ki-67 для оценки пролиферативной активности лимфоцитов при стимуляции фитогемагглютинином [Е.Г. Артеменко, 2004; Т.И. Булычева, Н.Л. Дейнеко, А.А. Григорьев, 2014]. Однако в данном случае учет реакции проводят методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью люминесцентного микроскопа, что также усложняет учет реакции (подсчет не менее 1000 клеток) и не исключает долю субъективности, за счет разного восприятия у исследователей интенсивности свечения флюорохрома.

Спектр применения РБТЛ в практике достаточно широк: оценка иммунного статуса, изучение механизмов активации клеток при пролиферации, оценка действия иммунотропных и иммуномодулирующих средств [Н.Н. Дергунова, 2003; B.C. Камышников, 2011; P.C. Janson, 2011; Р. Marits, 2014]. В последнее время в связи с резким увеличением количества работ по трансплантации органов и костного мозга, при онкологических и онкогематологических заболеваниях этот тест становится особенно востребованным. В связи с вышеизложенным, в настоящее время повышается актуальность внедрения новых, объективных способов учета результатов РБТЛ с использованием высокоточного аналитического оборудования.

В практике здравоохранения при иммунофенотипировании бластных форм лимфоцитов используют моноклональные антитела к CD34 [С.А. Луговская, М.Е. Почтарь, 2005; Г.Э. Плужникова, 2008; В. А. Зурочка, А.В. Зурочка, Е.Г. Костоломова, 2012; W.R. Widowati et all, 2014; F. Liu et all, 2015].

Реакция основана на экспрессии гемопоэтическими бластными лимфоидными клетками антигена CD34 и заключается в том, что клетки инкубируют с моноклональными антителами к CD34. Подсчет количества бластных форм лимфоцитов (CD34+) осуществляют автоматически с помощью проточной цитофлуориметрии.

В доступной литературе не обнаружены данные об использовании проточной цитофлуориметрии для подсчета бласттрансформированных клеток в РБТЛ с применением моноклональных антител к CD34.

Задачей изобретения является повышение качества учета активированных антигеном лимфоцитов в РБТЛ с использованием моноклональных антител CD34 при помощи проточного цитофлуориметра.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. В стерильную пробирку, содержащую 1 мл среды 199, добавить 100 Ед пенициллина и 10 Ед стрептомицина, внести антиген и 100 мкл плазмы с лейкоцитами крови пациентов. Для оптимального протекания РБТЛ необходимо присутствие макрофагов, поэтому использовать высокоочищенные лимфоциты не рекомендуется [В.А. Зурочка, А.В. Зурочка, Е.Г. Костоломова, 2012], для моделирования клеткам специфического микроокружения в смесь добавляли 100 мкл аутологичной сыворотки. Реакционную смесь культивировали в CO2-инкубаторе при 37°С в течение 72 часов с последующим центрифугированием при оборотах 2000g 10 мин, надосадочную жидкость сливали. К 50 мкл осажденных клеток приливали 10 мкл моноклональных антител к антигену CD34, конъюгированных с флуорохромом, инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. Далее добавляли 500 мкл лизирующего раствора в разведении 1:10, не содержащего фиксирующих компонентов, и инкубировали в течение 10-12 минут в темноте при комнатной температуре. Клетки осаждали центрифугированием при 2000g в течение 5 минут, освобождали от надосадочной жидкости. К получившемуся осадку приливали 450 мкл отмывочного буфера (Cell Wash) и ресуспендировали. Подсчитывали количество бластных клеток (CD34) на проточном цитофлуориметре, при этом в каждой пробе анализировали 30000 клеток.

Подсчет количества бластных клеток (CD34) осуществляли непосредственно после окончания реакции.

На примере больных бруцеллезом была изучена специфичность и чувствительность предлагаемого способа. В качестве антигена использовали бруцеллин - производство «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России (Россия). Для определения специфичности заявляемого способа, при постановке РБТЛ, в плазму вносили антигены: тулярин - производство «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России» (Россия) и туберкулин - производство ФГУП СПбНИИВС ФМБА (Россия). Пред постановкой РБТЛ определяли фоновое количество CD34+ лимфоцитов у больных бруцеллезом и относительно здоровых доноров. Для контроля спонтанной неспецифической пролиферации лимфоцитов у обследуемых, в пробы вносили равный с антигеном объем (50 мкл) стерильного физиологического раствора.

Проведена сравнительная оценка способов подсчета бластных клеток в анализируемом материале по заявляемому способу и применяемого в лабораторной практике обзорного окрашивания мазков по Романовскому-Гимзе. Объектом исследования служили 55 образцов крови больных бруцеллезом (40) и относительно здоровых доноров (15).

Постановку РБТЛ с плазмой крови каждого образца осуществляли одновременно. Осажденные клетки после инкубации использовали для приготовления мазков на предметном стекле с последующей их окраской по Романовскому-Гимзе и подсчетом количества бластных клеток в световом микроскопе. Часть клеток инкубировали с моноклональными антителами к антигену CD34, и по окончании инкубации определяли количество бластных лимфоцитов в проточно-цитометрическом анализе.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Microsoft Excel 2010. Для выявления статистической значимости различий результатов использовали t-критерий Стьюдента, при уровне достоверности Р≤0,05.

Полученные результаты представлены в таблице. Как видно из таблицы, уровень пролиферативного ответа лимфоцитов на бруцеллин, у неинфицированных возбудителем бруцеллеза и больных бруцеллезом, достоверно различался (Р≤0,001).

Активация лимфоцитов крови туберкулином и тулярином не стимулировала статистически достоверного увеличения количества CD34+ клеток, выявляемых после постановки РБТЛ, что свидетельствует о специфичности предлагаемого способа.

Таким образом, предлагаемый способ оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов при стимуляции антигеном, с применением проточной цитофлуориметрии не требует специальных условий проведения, как при использовании радиоактивной метки, отличается простотой учета и высокой объективностью за счет большего количества автоматически учтенных клеток (30000 клеток), высокой чувствительностью (100%) и специфичностью (>99%).

Способ оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов, включающий использование бруцеллина для специфической активации лимфоцитов и моноклональных антител к CD34 для детекции бластных форм лимфоцитов, с последующим подсчетом количества клеток методом проточной цитофлуориметрии.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к онкогематологии, и может быть использовано для прогнозирования развития безрецидивной выживаемости у больных множественной миеломой после аутологической трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, и может быть использовано для диагностики нагноившейся постнекротической псевдокисты поджелудочной железы.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии. Для этого окрашивают исследуемый образец крови моноклональными антителами CD235a (FITC)/ CD59(PE)/CD71 (АРС).

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для диагностики наследственной оптической нейропатии (НОН). Для этого проводят клинические и цитологические исследования и дополнительно из кожи пациента получают культуру фибробластов плотностью 5000-10000 клеток на см2, окрашивают митохондриальным потенциалзависимым флюоресцентным красителем TMRE до конечной концентрации 25 нМ.

Изобретение относится к медицине и описывает хемилюминесцентный реактив для определения присутствия и/или количества анализируемого вещества в образце с предполагаемым содержанием анализируемого вещества, при этом реактив является недисперсным и растворимым в водной среде и содержит партнера по связыванию для анализируемого вещества и хемилюминесцентную композицию, содержащую олефиновое соединение и хелат металла, где олефиновое соединение является соединением, которое способно реагировать с синглетным кислородом присоединением 2+2 с образованием диоксетана или которое способно реагировать с синглетным кислородом с циклоприсоединением 4+2 с диенами, и где металл или хелат металла представляет собой редкоземельный металл или металл Группы VIII, и где металл координирован с двумя или более атомами той же молекулы или хелирующего агента, где два или более атомов выбраны из группы, состоящей из кислорода, азота и серы.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для определения еx-vivo эффективности лечения рака. Для этого после введения одной или более доз иммуногенной композиции субъекту измеряют уровень активированных Т-лимфоцитов (CD3+ CD69+) в организме.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения генотипа человека по полиморфизму в гене матриксной металлопротеиназы ММР9-1562 C>Т (rs3918242).

Изобретение касается способа определения биологической активности эмбрионированных яиц Trichuris. Охарактеризованный способ включает осуществление по меньшей мере 3-х анализов, выбранных из: - оценки и/или подтверждения стадии эмбрионального развития яиц с помощью метода количественной ПЦР с использованием пригодных маркерных последовательностей для определения количества копий геномной ДНК, - оценки метаболической активности эмбрионированных яиц с помощью биохимических и/или молекулярно-биологических методов, - оценки индуцибельности генной экспрессии в эмбрионированных яйцах, - оценки подвижности личинок Trichurs с помощью микроскопа в течение продолжительных периодов наблюдения после предварительной инкубации при повышенных температурах и/или - оценки коэффициента вылупляемости личинок Trichuris в организме лабораторного животного.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для прогнозирования риска сердечно-сосудистой летальности у пациентов с постинфарктной хронической сердечной недостаточностью, сочетающейся с сахарным диабетом 2 типа.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и клинической биохимии. Сущность способа заключается в том, что фиксированные клетки периферической крови обрабатывают первичными антителами к эстроген-связываюшему белку, специфически взаимодействующими с антигенами на поверхности сегментоядерных гранулоцитов, затем к полученному комплексу антиген-антитело добавляют вторичные антивидовые флуоресцентно-меченные антитела, и при наличии окрашивания поверхности сегментоядерных гранулоцитов диагностируют злокачественные новообразования, а при отсутствии окрашивания поверхности сегментоядерных гранулоцитов диагностируют доброкачественные новообразования.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для определения антител к аллогенным HLA-G в сыворотки крови. Для этого используют тест перекрестной совместимости (cross match) мононуклеаров донора с сывороткой реципиента. Проводят анализ субпопуляций мононуклеаров с помощью проточной цитофлуорометрии на связывание моноклональных антител HLA-G и оценивают степень экспрессии HLA-G на опытных и контрольных мононуклеарах донора. При этом значимыми являются субпопуляции CD3-HLA-G+ и CD3+HLA-G+, по которым рассчитывают коэффициент подавления (КП) в опытной постановке по отношению к контрольной по формуле: КП HLA-G = ( H L A − G О П − H L A − G К О Н Т ) H L A − G К О Н Т × 100, где HLA-Gоп - суммарное относительное число субпопуляций экспрессирующих HLA-G: (CD3-HLA-G++CD3+HLA-G+) в опытной постановке, %; HLA-Gконт - суммарное относительное число субпопуляций экспрессирующих HLA-G: (CD3-HLA-G++CD3+HLA-G+) в контрольной постановке, %. При этом наличие сенсибилизации к аллогенным HLA-G диагностируют при отрицательном значении КПHLA-G. Использование данного способа позволяет выявлять аллогенную сенсибилизацию к HLA-G с помощью проточной цитофлуориметрии, определяя субпопуляции CD3-HLA-G+ и CD3+HLA-G+. 3 пр., 3 ил., 2 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования рецидива угрожающего выкидыша. Для этого проводят иммунологическое исследование периферической венозной крови в 7-12 недель гестации у женщин с угрозой невынашивания беременности. После проведенного лечения угрозы прерывания беременности определяют относительное содержание CD45RA-CD62L- в популяции CD8+ лимфоцитов. При его значении более 23,9% прогнозируют возникновение угрожающего выкидыша во втором триместре у женщин с привычным невынашиванием в анамнезе. Использование данного способа позволяет прогнозировать рецидив угрожающего выкидыша во втором триместре гестации, что позволит выбрать правильную тактику ведения беременной женщины, позволит снизить частоту данного осложнения. 1 табл., 4 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к трансфузиологии, и может быть использовано для контроля эффективности облучения донорской крови. Способ включает постановку реакции бласттрансформации клеток крови с митогеном фитогемагглютинином и учет результатов реакции путем определения индекса стимуляции лимфоцитов. Постановку реакции проводят в отношении облученной донорской крови, учет результатов выполняют с помощью проточного цитофлюориметра с использованием моноклональных антител, меченных разными флюорохромами, проведением гейтирования активированных лимфоцитов со сниженной экспрессией общелейкоцитарного маркера CD45 и определением среди них процента дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8-, при этом в качестве контроля берут необлученный образец той же крови. После чего определяют эффективность облучения по соотношению содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в проверяемой облученной и той же необлученной контрольной крови как Эоб=Сднтло-Сднтлк, где Эоб - эффективность облучения, Сднтло - процент содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в опыте (в проверяемой облученной крови), Сднтлк - процент содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в контроле (в необлученном образце той же крови). При разнице с контролем более чем в 50% делают вывод о функциональной неполноценности Т-лимфоцитов в облученной крови и иммунологической безопасности данного препарата крови для реципиента. Использование данного способа позволяет определять эффективность облучения донорской крови методом проточной цитометрии.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и позволяет прогнозировать угрожающий поздний выкидыш у беременных женщин. Для этого в сроке 5-12 недель гестации определяют относительное количество CD178+ моноцитов гестации в периферической венозной крови. При его значении равном 37,7% или менее в моноцитарном гейте прогнозируют угрожающий поздний выкидыш у женщин с угрозой прерывания беременности ранних сроков и привычным невынашиванием в анамнезе. Использование данного способа позволяет выбрать правильную тактику ведения беременности, провести комплекс лечебно-профилактических мероприятий и снизить риск развития осложнений и неблагоприятных исходов беременности в группе женщин с высоким риском невынашивания беременности. 3 пр., 1 табл.
Наверх