Способ стимуляции выработки эритропоэтина в культуре клеток in vitro


 


Владельцы патента RU 2589288:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга" (RU)

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины, а именно к способу стимуляции выработки эритропоэтина клетками костного мозга in vitro. Способ стимуляции выработки эритропоэтина клетками костного мозга in vitro, заключается в том, что неприлипающую фракцию миелоцитов культивируют CO2-инкубаторе в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, добавляют ингибитор протеинкиназы р38 в концентрации 300 мкМ, при определенных условиях. Вышеописанный способ позволяет эффективно стимулировать выработку эритропоэтина неадгезирующими миелокариоцитами in vitro. 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и касается способа стимуляции выработки эритропоэтина in vitro.

Наиболее близким по технической сущности, механизму действия и достигаемому результату (прототипом) является способ стимуляции выработки эритропоэтина с помощью конкавалина-А (Кон-А), который добавляют в необходимой концентрации в культуру ткани и инкубируют при 37°С, 5% CO2 и 100% влажности воздуха в течение 24 часов [1].

Недостатком данного способа является незначительная стимуляция выработки гемопоэтина под действием данного митогена.

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности способа.

Поставленная задача решается тем, что к неадгезирующей фракции костного мозга, которую культивируют в CO2-инкубаторе при 37°С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, добавляют ингибитор протеинкиназы р38 в концентрации 300 мкМ, определяющий функциональную активность гемопоэтических клеток.

Новым в предлагаемом изобретении является применение ингибитора протеинкиназы р38 в качестве стимулятора продукции эритропоэтина.

На сегодняшний день среди разнообразных фармакологических средств, используемых в качестве гемостимуляторов, наиболее значимой группой, являются препараты на основе эндогенных стимуляторов кроветворения (эритропоэтин и колониестимулирующие факторы), которые, связываясь со специфическими рецепторами, запускают многочисленные сигнальные механизмы, участвующие в реализации ключевых функций клетки - дифференцировки, пролиферации, старения, опухолевой трансформации. Особого внимания заслуживают препараты рекомбинантного эритропоэтина, гемостимулирующие эффекты которых сопоставимы с активностью природного эритропоэтина [2]. Учитывая перспективность разработки лекарственных препаратов с таргетным действием для модуляции выработки эндогенных гемопоэтинов путем активации/ингибирования внутриклеточного сигналинга, исследование синтеза и специфических биологических свойств данного гемопоэтина в системе in vitro ляжет в основу методологии создания данной группы фармсредств.

Известно, что наряду с классическими STAT-путями, в проведении сигналов от ростовых факторов в клетку могут быть задействованы MAP- и PI3K/Akt-сигнальные каскады [3, 4, 5]. Следует отметить, что данные пути также играют важную роль и в контроле продукции гемопоэтинов клетками кроветворного микроокружения [6, 7]. Однако работ, результаты которых позволили бы вскрыть конкретную роль данных сигнальных путей (их активация либо ингибирование) в продукции эритропоэтина в изучаемой нами литературе, не найдено. Таким образом, исследования, направленные на изучение путей контроля уровня гемопоэтинов, являются, несомненно, актуальными и помогут в разработке новых препаратов для стимуляции кроветворения.

Факт применения ингибитора протеинкиназы р38 с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции выработки эритропоэтина in vitro, для специалиста является не очевидным.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом.

Взвесь клеток костного мозга мышей (5×106 клеток/мл) разделяют на адгезирующую и неадгезирующую фракции. Полученные неприлипающие клетки инкубируются в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 300 мкМ ингибитора протеинкиназы р38, в CO2-инкубаторе при 37°С, 5% CO2 и 100% влажности воздуха в течение 24 часов. По окончании инкубации собирают кондиционные среды после центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 минут и хранят не более месяца при -26°С.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах-самцах линии C57B I/6JY в количестве 2 шт., массой 20-22 г. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИ фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга (сертификат имеется).

Пример 1

Суспензию костномозговых клеток, полученную в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром), инкубировали в течение 45 мин в среде RPMI-1640 ("Sigma", США), содержащей 10% ЭТС («Sigma», США), в 90 мм пластиковых чашках Петри («Corning», США) диаметром 35 мм в течение 40-50 мин при 37°С, 5% CO2 и 100% влажности для выделения неадгезирующей фракции миелокариоцитов. После чего с помощью пипетки собирали неприлипающие миелокариоциты, которые инкубировались в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640 («Sigma», США), 10% ЭТС («Sigma», США), 280 мг/л L-глутамина («Sigma», США), 50 мг/л гентамицина («Sigma», США), 300 мкМ ингибитора протеинкиназы р38 («Calbiochem», США), при 37°С, 5% CO2 и 100% влажности. По окончании инкубации собирали кондиционные среды и определяли в них уровень эритропоэтина методом ИФА, с помощью набора фирмы «R&D systems» (USA) согласно методическим указаниям производителя.

При этом контролем и группой сравнения служили кондиционные среды от неприлипающих клеток костного мозга без добавления ингибитора и с добавлением конкавалина-А соответственно, полученных по способу прототипу: аналогичным описанному выше путем.

В ходе эксперимента показано, что добавление ингибитора протеинкиназы р38 в культуру неприлипающих миелокариоцитов значительно повышало уровень эритропоэтина в кондиционных средах по сравнению с таковым в супернатантах, полученных при культивировании неадгезирующих миелокариоцитов без ингибитора и с добавлением конкавалина-А (табл.1).

Таблица 1
Уровень эритропоэтина (ЭП, mU/mL) в кондиционных средах от неприлипающих миелокариоцитов мышей линии CBA/CaLac культивированных без ингибитора (1), с добавлением конкавалина-А (2) либо ингибитора протеинкиназы р38 (3), (Х±m)
Группы ЭП
1 12,69±0,45
2 14,25±0,53*
3 26,33±0,83*#

* - отмечена достоверность различий с показателями в 1-й группе при р<0,05;

# - отмечена достоверность различий с показателями во 2-й группе при р<0,05.

Таким образом, инкубация неприлипающей фракции гемопоэзиндуцирующего микроокружения с ингибитором протеинкиназы р38 приводит к стимуляции выработки эритропоэтина in vitro.

Предлагаемый в качестве изобретения способ позволяет эффективно стимулировать выработку эритропоэтина неадгезирующими миелокариоцитами in vitro.

Цитируемая литература

1. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии, Томск, 1992, с. 64-65.

2. Дыгай A.M., Жданов В.В., Удут У.В. Фармакологическая регуляция эритропоэза, Москва, 2009, с. 58-71.

3. Fischer О.М., Hart S., Gschwind A., Ullrich A. EGFR signal transactivation in cancer cells. // Biochemical Society Transactions, 2003, 31, p. 1203-1208.

4. Grimberg A. Mechanisms by which IGF-I may promote cancer. // Cancer Biol Ther, 2003, 2, p. 630-635.

5. Whitmarsh A.J., Cavanagh J., Tournier C. et al. A mammalian scaffold complex that selectively mediates MAP kinase activation // Science. 1998, 281, p. 1671-1674.

6. Дыгай A.M., Жданов В.В., Мирошниченко Л.А. и др. // Бюл. экс-пер. биол. 2014. №9. С. 282-286.

7. Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н. // Бюл. экспер. биол. №1. С. 39-49.

Способ стимуляции выработки эритропоэтина клетками костного мозга in vitro, заключающийся в том, что неприлипающую фракцию миелокариоцитов культивируют в СО2-инкубаторе при 37°С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, с добавлением стимулятора, отличающийся тем, что в качестве стимулятора используют ингибитор протеинкиназы р38 в концентрации 300 мкМ.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) клетками костного мозга, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к средству для ингибирования фермента поли(АДФ-рибозо)полимеразы-1 человека, представляющее собой 6-ацетил-7,9-дигидрокси-8,9b-диметил-2-етилид-2,11-ен-1,9b,2,3-тетрагидро-11-N-карбоксифенилметиламино-1,3-диоксодибензофуран общей формулы (I): Данное средство оказывает специфическое ингибирующее действие на фермент поли(АДФ-рибозо)полимераза-1 человека (ПАРП-1) и, являясь дешевым и доступным, расширяет арсенал специфических ингибиторов данного фермента и может быть использовано для разработки лекарственных препаратов, применимых в клинической медицине.

Изобретение относится к средству для ингибирования фермента поли(АДФ-рибозо)полимеразы-1 человека, представляющему собой производные нуклеозидов общей формулы (I), где Х - Н или OR1; один или два из заместителей R1, R 2, R3 - моносахаридные остатки, остальные - протоны водорода; В - азотистое основание, присоединенное в - или -положении.

Изобретение относится к молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии и касается соединения 6-амино-4-хлоропиразоло[3,4-d] пиримидин. .

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к медицине и касается цитозольной изоцитратдегидрогеназы, ее гена и их использования в лечении ожирения, гиперлипидемии и жировой инфильтрации печени.

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к биотехнологии, в частности касается ингибирования цистеиновых аспартат-специфичных протеаз (каспаз), и может быть использовано в биохимии, клеточной биологии, физиологии и фармакологии для изучения и направленной регуляции процессов, связанных с индукцией, развитием и/или предотвращением программированной клеточной гибели (апоптоза), а также для исследования строения и механизма действия каспаз.

Изобретение относится к биохимии, в частности к применению известных бромпроизводных бензотетразин-1,3-диоксида общей формулы I где R1 и R2 различны и означают водород или Вr, в качестве необратимых ингибиторов Н, К-аденозинтрифосфатазы (Н,К-АТРазы).

Изобретение относится к биотехнологии, ветеринарии, клеточной биологии и связано с применением экстракта лиофильно высушенной медицинской пиявки в качестве компонента питательной среды для культивирования клеток млекопитающих.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой пептид, который имеет аминокислотную последовательность, состоящую из смежных аминокислот, полученных из белка WT1, и индуцирует WT1-специфические хелперные Т-клетки связыванием с молекулой МНС класса II.

Группа изобретений относится к области культивирования клеток. Предложена пластина, выполненная с возможностью переворачивания для образования висячих капель для культивирования клеток, комплект пластин для переноса трехмерных клеточных совокупностей и способ тестирования вещества на токсичность по отношению к клеткам.
Изобретение относится к способу получения действующего вещества из пантов марала. Способ получения действующего вещества из пантов марала включает выделение стволовых клеток и их культивирование, в качестве источника стволовых клеток используют панты марала, которые мелко диспергируют и обрабатывают в коллагеназе II типа, клетки культивируют в рабочей среде DMEM, FBS, L-глутамина, пенициллина и стрептомицина, при достижении культурой 75-80% монослоя проводят смену среды и культивируют повторно, полученную кондиционированную среду очищают и фильтруют при определенных условиях.

Изобретение относится к клеточным технологиям. Описана клеточная популяция клеток человека, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, где указанная изолированная популяция клеток человека получена путем культивирования линии эмбриональных стволовых клеток человека, выбранной из группы, включающей H1 (код NIH: WA01), Н7 (код NIH: WA07) и Н9 (код NIH: WA09) (WiCell Research Institute (WiCell)) в среде, дополненной активатором протеинкиназы С, причем более 60% клеток в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, одновременно экспрессируют PDX1 и NKX6.1, и где клетки в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, экспрессируют CDX2.
Изобретение относится к области генетической инженерии, молекулярной биологии и медицины. Предложен способ увеличения экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы.

Изобретение относится к биохимии. Описано выделение раковой клетки, которая резистентна к химиотерапевтическому агенту и обладает свойствами стволовой клетки, включая экспрессию ОСТ4.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ получения клеток, производных от кардиальной ткани человека, которые не экспрессируют теломеразу и Isl-1 и экспрессируют CD117.

Мыши adam6 // 2582261
Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Предложены мыши со сниженной или отсутствующей активностью ADAM6, обеспечиваемой эндогенным локусом ADAM6, либо с отсутствующим эндогенным локусом, кодирующим белок ADAM6 мыши, отличающиеся тем, что у указанных мышей присутствует последовательность, кодирующая ADAM6, либо его ортолог, гомолог или фрагмент, функциональный у мышей-самцов.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения мультипотентных стволовых клеток/клеток-предшественников млекопитающего, а также к применению клеток, полученных данным способом.

Группа изобретений раскрывает способ получения карбамилированного дарбэпоэтина 9C-DEPO, карбамилированного по всем аминокислотным остаткам лизина, входящим в молекулу дарбэпоэтина, содержащего карбамилированный аминокислотный остаток аланина в N-концевой области этого белка, включающий карбамилирование дарбэпоэтина в присутствии цианатов, а также лекарственное средство, включающее карбамилированный дарбэпоэтин 9C-DEPO.
Наверх