Способ оценки влияния цитомегаловирусной инфекции на активность над-зависимой изоцитратдегидрогеназы в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты на третьем триместре беременности

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики нарушения энергетического обмена в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации. Для этого в периферической крови определяют титр антител к цитомегаловирусу, выполняют гистохимическую реакцию на NAD-изоцитратдегидрогеназу, и при титре антител класса G к цитомегаловирусу 1:1600, снижении активности NAD-изоцитратдегидрогеназы до 21,6±1,91 усл. ед. диагностируют нарушение энергетического обмена в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты, отрицательно влияющее на формирование плода в период гестации. Способ позволяет диагностировать нарушение энергетического обмена в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты при простоте его исполнения. 2 ил.

 

1. Цель изобретения - выявить характер влияния цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации на активность НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы в синцитиотрофобласте плаценты, приводящей к нарушению энергетических процессов в фетоплацентарном барьере.

2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке гистохимического способа диагностики снижения активности НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы, доказывающего нарушение процессов энергообмена в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты при обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре беременности.

3. Раскрытие изобретения

Изоцитратдегидрогеназа катализирует обратимое превращение изоцитрата в α-кетоглутарат и CO2 в двухстадийной реакции [3, 6]. Первый шаг реакции включает окисление изоцитрата в промежуточный оксалосукцинат. На втором этапе реакции происходит декарбоксилирование оксалосукцината в α-кетоглутарат. Существует три изоформы изоцитратдегидрогеназы. Две формы фермента являются НАДФ-зависимыми, одна из них находится в митохондриях, другая - в цитозоле. Окисление изоцитрата, связанное с работой цикла трикарбоновых кислот, осуществляется исключительно НАД-зависимой формой фермента, локализованного в митохондриях. В результате реакции, катализируемой изоцитратдегидрогеназой, производятся восстановительные эквиваленты - НАДН, при прохождении которых по дыхательной цепи генерируются три высокоэнергетические фосфатные связи посредством образования АТФ из АДФ в процессе окислительного фосфорилирования. Считается, что именно эта реакция лимитирует скорость всего цикла трикарбоновых кислот [4]. Снижение активности изоцитратдегидрогеназы указывает на уменьшение интенсивности работы цикла трикарбоновых кислот и, соответственно, аэробных энергетических процессов в плаценте, что, в свою очередь, влияет на формирование плода.

4. Новая техническая задача

Определить уровень активности НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы при обострении цитомегаловирусной инфекции у беременных на третьем триместре гестации с целью оценить характер состояния энергетического обмена в фетоплацентарном барьере, от чего зависит нормальное формирование плода.

5. В доступной литературе имеются упоминания об исследовании изоцитратдегидрогеназы в плаценте при осложненной беременности, однако данная работа касается изучения НАДФ-зависимой формы фермента [2]. Также известно изучение активности НАД- и НАДФ-изоцитратдегидрогеназ в плаценте при физиологической беременности [7], которое выполняется биохимическими методами. Кроме этого активность изоцитратдегидрогеназы изучается иммуногистохимическим методом в солидных опухолях человека [5], недостатком которого является необходимость дорогостоящих реактивов, оборудования и длительного времени исполнения.

В отличие от вышеприведенных прототипов в данной работе имеются существенные отличия: 1. Изменения активности изоцитратдегидрогеназы происходят под влиянием обострения цитомегаловирусной инфекции во время беременности. 2. Использование данного метода позволяет судить о состоянии энергетического обмена в фетоплацентарном барьере, влияющего на развитие плода. Метод прост в исполнении, не требует дорогостоящих реактивов, обладает хорошей разрешающей способностью и может быть рекомендован в проведении научно-исследовательских работ и лабораторной диагностики.

6. Осуществление изобретения

6.1. Обследованы 36 беременных женщин 18-25 лет с обострением хронической цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, контрольную группу составили 30 беременных женщин с хронической цитомегаловирусной инфекцией в латентной стадии. У беременных женщин симптоматически цитомегаловирусная инфекция проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз (обострение хронической цитомегаловирусной инфекции) устанавливается по результатам комплексного исследования периферической крови на наличие ДНК цитомегаловируса (ЦМВ), JgM или увеличение титра антител JgG в парных сыворотках (в 4 раза и более) в динамике через 10 суток, а также индекса авидности (более 65%). Исследования проводят с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.

6.2. Верификацию ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществляют методами ИФА на спектрофотометре «Stat Fax-2100» с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), ДНК ЦМВ выявляют методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

6.3. Активность изоцитратдегидрогеназы гистохимически определяют на криостатных срезах свежезамороженной нефиксированной ткани плаценты следующим методом. Метод основан на восстановлении соли тетразолия в формазан электронами, акцептируемыми от субстрата через кофермент НАД [1]. Субстратом служит 0,1 M раствор тринатриевой соли изолимонной кислоты «Sigma» (США). Инкубационный раствор готовится на основе 0,1 M фосфатного буфера рН 7,2-7,4 с добавлением нитросинего тетразолия фирмы «ICN Biomedicals)) (США) в конечной концентрации 5 мМоль, НАД+ фирмы «Applichem» (Германия) - 1 мМоль.

Состав инкубационной среды:

- 0,1 M фосфатный буфер pH 7,2-7,4 - 1 мл;

- нитросиний тетразолий - 1 мг;

- НАД+- 1 мг;

- тринатриевая соль изолимонной кислоты · H2O - 27,6 мг.

6.4. В 1 мл инкубационного раствора помещают свежеприготовленные срезы ткани. Инкубацию проводят при 37°C в течение 30 минут. По окончании инкубации срезы промывают дистиллированной водой, фиксируют в 10%-ном нейтральном формалине при комнатной температуре, вновь промывают дистиллированной водой, подсушивают и заключают в глицерин-желатин. Контрольные срезы инкубировали в среде, содержащей вместо раствора изоцитрата натрия адекватное количество фосфатного буфера. Полученные гистологические препараты изучают цитофотометрическим компьютерным методом с помощью программы Scion (США) на цифровом микроскопе MEIJI (Япония).

6.5. Статистический анализ и обработка данных проводится с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Характеристика вариационных рядов: средняя арифметическая (М), стандартная ошибка (m), коэффициент вариации 95%, доверительный интервал для средних значений M±m, где t определялось по таблице граничных значений критерия Стьюдента при доверительном уровне 95% и числе степеней свободы F=n1+n2-2. Для определения достоверности различий используется непарный параметрический критерий Стьюдента. Принимаются во внимание р<0,05; 0,01; 0,001. Для определения достоверности различий в случае негауссовых распределений - непараметрические критерии Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни.

7. Полученные данные

В процессе исследования получены следующие результаты. Гистохимическая реакция выявления активности НАД-изоцитратдегидрогеназы является достаточно специфичной, так как в отсутствие субстрата в инкубационной среде выпадение гранул формазана в тканевых структурах не наблюдается. На гистохимических препаратах плаценты беременных женщин, перенесших обострение хронической цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, при регистрации роста титра антител класса G к цитомегаловирусу до 1:1600 отмечается снижение активности NAD-изоцитратдегидрогеназы до 21,6±1,91 усл. ед. (контроль - 35,5±2,28 усл. ед.) (фигура 1, 2).

Таким образом, снижение активности НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы при нарастании титра антител класса G к цитомегаловирусу 1:1600 указывает на нарушение энергообмена в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты, влияющего на формирование плода в период гестации.

8. Литература

1. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы: пер. с англ. М.: Мир, 1982. 272 с.

2. Назыров А.Т., Шафранова Н.Г., Алманиязова К.К. Изоцитратдегидрогеназа плаценты при осложненной беременности // Акушерство и гинекология. 1977. №5. С. 47-49.

3. Frey Р.А., Abies R.H., Hegeman A.D. Enzymatic Reaction Mechanisms. United Kingdom: Oxford University Press, 2006. 848p.

4. Kim Y.O., Koh H.J., Kim S.H., Jo S.H, Huh J.W., Jeong K.S., Lee I.J., Song B.J., Huh T.L. Identification and functional characterization of a novel, tissue-specific NAD+ dependent isocitrate dehydrogenase beta-subunit isoform. // J. Biochem. 1999. Vol, 274. P. 36866-36875.

5. Mauzo S.H., Lee M., Petros J., Hunter S., Chang С.М., Shu H.K., Bellail A.C., Hao C., Cohen C. Immunohistochemical demonstration of isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) mutation in a small subset of prostatic carcinomas. // Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 2014. Vol. 22, №4. P. 284-287.

6. Qi F., Chen X., Beard DA. Detailed kinetics and regulation of mammalian NAD-linked isocitrate dehydrogenase. // Biochim. Biophys. Acta. 2008. Vol. 1784, №11. P. 1641-1651.

7. Scislowski P.W., Zolnierowicz S., Zelewski L. Subcellular distribution of isocitrate dehydrogenase in early and term human placenta // Biochem. J. 1983. Vol. 214, №2. P. 339-343.

Способ диагностики нарушения энергетического обмена в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты беременных при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации, включающий определение в периферической крови титра антител к цитомегаловирусу, выполнение гистохимической реакции на NAD-изоцитратдегидрогеназу, и при титре антител класса G к цитомегаловирусу 1:1600, снижении активности NAD-изоцитратдегидрогеназы до 21,6±1,91 усл. ед. диагностируют нарушение энергетического обмена в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты, отрицательно влияющее на формирование плода в период гестации.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений раскрывает способ выявления субъекта с повышенным содержанием аутоантител к плазминогену или его фрагментам, тест-систему, позволяющую выявить такого субъекта, и применение данной тест-системы для проведения диагностики у субъекта онкологического процесса.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и касается выбора тактики ведения беременных с плацентарной недостаточностью и синдромом задержки роста плода (СЗРП).

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для прогнозирования инфекционного осложнения хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и может быть использовано для эпидемиологических и микробиологических исследований. Штамм микроорганизма Helicobacter pylori №782, предназначенный для создания диагностических тест-систем, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером ГКПМ - Оболенск В-7215.

Изобретение относится к области биохимии. Представлены антитела, связывающиеся с опухолеассоциированным антигенным полипептидом-мишенью (полипептидом «TAT»), который в более высокой степени экспрессируется на поверхности раковых клеток, чем на поверхности нормальных клеток.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в практической работе бактериологических лабораторий для дифференциации грибов Candida albicans вагинального биотопа женщин на нормальную и патогенную микрофлору.

Группа изобретений относится к медицине и касается способа количественного определения нескольких антиген-специфических иммуноглобулинов в анализируемом образце, включающего стадию анализа связывания серии образцов, содержащих иммуноглобулин известной антигенной реактивности, с несколькими антигенными компонентами или их фрагментами, иммобилизованными на твердой подложке.

Изобретение относится к области сельского хозяйства и ветеринарии и предназначено для определения жизнеспособности новорожденных телят. Способ включает взятие у телят венозной крови через 24-36 часов после рождения в утренние часы до кормления, определение в сыворотке крови концентрации кортизола и дегидроэпиандростерон-сульфата и расчет индекса жизнеспособности как соотношение концентрации кортизола (нМ/л) к концентрации дегидроэпиандростерон-сульфата (нМ/л).

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и медицине, в частности может быть использовано для детектирования присутствия и/или количества наркотических или психотропных веществ в биологических жидкостях человека.
Представленная группа изобретений касается способа получения концентрата культуры клеток бруцелл из штамма Brucella abortus 19 для приготовления бруцеллезных антигенов, способа получения концентрата клеток бруцелл из штамма Brucella abortus 19 для получения сыворотки бруцеллезной диагностической, способа получения единого бруцеллезного антигена РА, РСК и РДСК, способа получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП), способа получения бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком, способа получения сыворотки бруцеллезной диагностической, тест-системы для диагностики бруцеллеза животных в РА, РСК и РДСК, тест-системы для диагностики бруцеллеза животных в РБП и тест-системы для диагностики бруцеллеза животных в КР с молоком.
Наверх