Набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена омра/мотв burkholderia pseudomallei



Набор 5-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена омра/мотв burkholderia pseudomallei
Набор 5-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена омра/мотв burkholderia pseudomallei
Набор 5-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена омра/мотв burkholderia pseudomallei

 

C12N1/00 - Микроорганизмы, например простейшие; их композиции (лекарственные препараты, содержащие материал из микроорганизмов A61K 35/66; приготовление лекарственных составов, содержащих бактериальные антигены или антитела, например бактериальных вакцин A61K 39/00); способы размножения, содержания или консервирования микроорганизмов или их композиций; способы приготовления или выделения композиций, содержащих микроорганизмы; питательные среды

Владельцы патента RU 2608505:

Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии. Изобретение представляет собой набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции гена ompA/motB, кодирующего поверхностный протеин OmpA/MotB возбудителя мелиоидоза. Изобретение позволяет получить в высокой концентрации фрагмент ДНК, несущий полную последовательность гена ompA/motB, кодирующего высокоиммуногенный поверхностный протеин OmpA/MotB возбудителя мелиоидоза, что позволит в перспективе осуществить его клонирование в составе экспрессирующего вектора с целью накопления рекомбинантного антигена. 1 ил., 2 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии. Предложен набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) гена ompA/motB, кодирующего поверхностный протеин OmpA/MotB возбудителя мелиоидоза. Изобретение может быть использовано в молекулярной биологии и биотехнологии для амплификации полной кодирующей нуклеотидной последовательности гена ompA/motB поверхностного антигена В. pseudomallei.

Возбудитель особо опасной инфекции - мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) - аэробная грамотрицательная неферментирующая бактерия, принадлежащая к роду Burkholderia подкласса протеобактерий семейства Burkholderiaceae. В настоящее время род Burkholderia включает более 50 видов микроорганизмов и представляет собой довольно гетерогенную таксономическую группу, объединяющую сапрофиты, фитопатогены и патогены теплокровных животных.

Мелиоидоз эндемичен для влажных тропических и субтропических регионов Юго-Восточной Азии, Северной Австралии, Западной Африки и Латинской Америки. В последнее время было отмечено довольно большое число спорадических случаев заболевания для ряда стран умеренного климатического пояса, связанных с заносом из эндемичных регионов.

В. pseudomallei относится к агентам II группы патогенности, все работы с которыми строго регламентированы СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».

Важной диагностической задачей следует считать точную и быструю индикацию вирулентных штаммов возбудителя мелиоидоза и их дифференциацию от генетически и иммунологически близких непатогенных сапрофитных представителей рода, широко распространенных в естественных биоценозах.

Успешная реализация вышеуказанных задач зависит прежде всего от выбора и детальной технологической проработки стратегии поиска и выявления биополимеров В. pseudomallei, перспективных для использования в качестве специфичных диагностических мишеней при конструировании иммуно- и генодиагностических систем нового поколения.

На основании проведенного нами сравнительного in silico исследования последовательностей геномов В. pseudomallei был осуществлен выбор дифференцирующих групп кодирующих последовательностей поверхностных белков возбудителя мелиоидоза. В результате множественного выравнивания формально транслированных аминокислотных последовательностей были отобраны протеины, формировавшие наиболее гомогенные группы. Для каждого кластера белков исследованы потенциальные антигенные свойства и выделены линейные эпитопы. При этом наибольший интерес представляли протеины семейства OmpA, обладающие высокой потенциальной иммуногенностью. Использование приложения BLAST-protein показало, что белок MotB семейства OmpA видоспецифичен для В. pseudomallei. Следовательно, исследуемый протеин и кодирующий его регион могут являться перспективными диагностическими мишенями.

Современной тенденцией совершенствования лабораторной диагностики мелиоидоза считают сочетанное применение двух методов: ПЦР и иммуноферментного анализа (ИФА). ИФА на основе моноклональных антител может быть использован для аналитических исследований, связанных с идентификацией видовой принадлежности микроорганизмов и анализом топографии биологически активных и диагностически значимых компонентов бактериальной клетки.

ПЦР является прямым методом выявления ДНК и обладает высокой специфичностью и чувствительностью. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Процесс амплификации нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий фрагментов ДНК, специфичных для конкретных определенных типов генетических последовательностей, например, генов мембранных протеинов микроорганизмов, в число которых входит и ген ompA/motB.

Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для исследуемой генетической мишени. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах детектируемого фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК проходит только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор ДНК-мишени и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации.

Близкими аналогами можно считать олигонуклеотидные затравки, использованные в нескольких работах для амплификации и последующего клонирования гена основного порина внешней мембраны BpsOmp38 (38 кДа) [Siritapetawee J., Prinz Н. et al. Expression and refolding of Omp38 from Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis, and its function as a diffusion porin // J. Biochem. - 2004. - P. 384] и гена цефалоспориназы (blaABPS) возбудителя мелиоидоза [Terence K.М. Cheung, P.L. Ho et al. Cloning and Expression of Class A β-Lactamase Gene blaABPS in Burkholderia pseudomallei // Antimicrob Agents Chemother. - 2002. - Vol. 46. - P. 1132-1135]. В данных работах были использованы праймеры, фланкирующие полную кодирующую последовательность соответствующих генов, для их клонирования в гетерологичных системах и функциональной характеристики рекомбинантных биополимеров.

Целью настоящего изобретения является разработка олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена ompA/motB В. pseudomallei.

Цель достигается конструированием специфичных олигонуклеотидов для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена ompA/motB В. pseudomallei.

На основе геномных сиквенсов Burkholderia pseudomallei, представленных в общедоступных генетических базах данных (Genbank, EMBL, DDBJ), были подобраны 1 прямой и 2 варианта обратного (поскольку последовательность выбранной области отжига обратного праймера у проанализированных in silico геномов В. pseudomallei содержит SNP) праймеров, комплементарные фланкирующим последовательностям гена поверхностного протеина OmpA/MotB. Сконструированные олигонуклеотиды, структура которых указана в таблице 1, обладают активностью прямого (bps4255ricF) и обратных (bps4255ricR1, bps4255ricR2) праймеров в реакции амплификации. К специфической нуклеотидной последовательности прямого и обратных праймеров на 5'-конце добавлена фосфорилированная последовательность.

Характеристика генетических мишеней для данных пар праймеров и ожидаемые размеры амплифицируемых фрагментов ДНК приведены в таблице 2.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров для амплификации полной нуклеотидной последовательности гена ompA/motB, кодирующего высокоиммуногенный поверхностный протеин OmpA/MotB возбудителя мелиоидоза, методом ПЦР.

На основе сравнительного анализа in silico последовательностей геномов микроорганизмов рода Burkholderia с использованием ресурса Pathema (http://pathema.jcvi.org/Pathema/) были выбраны дифференцирующие группы кодирующих последовательностей поверхностных белков возбудителя мелиоидоза. Использование приложения BLAST-protein (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) показало, что наиболее перспективной диагностической мишенью является видоспецифичный для В. pseudomallei белок MotB семейства OmpA.

Были выбраны специфические участки ДНК, являющиеся консервативными фрагментами нуклеотидных последовательностей гена ompA/motB, к которым с помощью сервиса PrimerBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/primer-blast) были подобраны комплементарные олигонуклеотиды, формирующие 2 пары праймеров. К специфической нуклеотидной последовательности прямого и обратного праймеров на 5'-конце добавлена фосфорилированная последовательность, позволяющая повысить эффективность клонирования амплифицированного фрагмента. Расчетная длина фрагмента ДНК, фланкируемого предлагаемыми праймерами, составила 1320 п.н. для пары bps4255ricF - bps4255ricR1 и 1310 п.н. для пары bps4255ricF - bps4255ricR2.

Праймеры были проанализированы с помощью компьютерной программы BLASTN (http://www.ncbi.nlm.mh.gov/BLAST/) для установления гомологии между ними и нуклеотидными последовательностями близкородственных буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (EMBL, GenBank, DDBJ). На момент проведения компьютерного анализа гомологии выявлено не было.

Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК возбудителя мелиоидоза с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров.

Для выделения ДНК использовался метод протеиназного лизиса [Higuchi R. Rapid, efficient DNA extraction for PCR from cells or blood // Amplifications: A Forum for PCR Users. Perkin-Elmer, Norwalk, CT. - 1989. - Issue 2] с модификациями: 200 мкл свежеприготовленной бактериальной взвеси в стерильной бидистиллированной воде плотностью 2×109 м.к./мл смешивали с равным объемом лизирующего буфера (20 мМ трис-HCl, 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 0.2 мг/мл желатина, 0.9% Nonidet Р-40, 0.9% Твин 20, 150 мкг/мл протеиназы К), инкубировали при 60°С 120 мин, прогревали при 99°С 30 мин для инактивации фермента.

Для постановки ПЦР использовался ДНК-амплификатор С1000 (Bio-Rad, США) с 96-луночным реакционным блоком. Программа амплификации для обеих пар праймеров состояла из этапов начального прогрева проб 95°С 4 мин, 35 реакционных циклов (денатурация 94°С 40 с, отжиг праймеров 66.2°С 30 с, удлинение цепи 72°С 1 мин 20 с) и финальной элонгации 72°С 10 мин.

Объем реакционной смеси на 1 пробу составлял 15 мкл. В состав реакционной смеси входили по 50 пМ прямого и обратного праймеров, 1.25 Ед. ДиаТак ДНК-полимеразы и 1×ПЦР-буфер с дНТФ и MgCl2 (ILS, Россия). Препараты геномной ДНК вносили в реакционную смесь в объеме 3 мкл.

Проводили электрофоретический анализ продуктов ПЦР в 1,5% агарозном геле и визуализировали ампликоны окрашиванием бромистым этидием. Размер ампликона оценивали, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркерных фрагментов ДНК. Электрофоретический анализ реакции амплификации гена ompA/motB возбудителя мелиоидоза, результаты которого приводятся на рисунке 1, показал наличие расчетных ампликонов размером 1320 п.н. с праймерами bps4255ricF/bps4255ricR1 и 1310 п.н. с праймерами bps4255ricF/bps4255ricR2 (дорожки 1 и 2 на электрофореграмме соответственно).

Таким образом, сконструированные праймеры позволяют получить в высокой концентрации фрагмент ДНК, несущий полную последовательность гена ompA/motB, кодирующего высокоиммуногенный поверхностный протеин OmpA/MotB возбудителя мелиоидоза, что позволит в перспективе осуществить клонирование в составе экспрессирующего вектора с целью накопления рекомбинантного антигена.

Набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена ompA/motB Burkholderia pseudomallei, обладающих активностью прямого (bps4255ricF) и обратных (bps4255ricR1, bps4255ricR2) праймеров в реакции амплификации и имеющих следующую структуру:

bps4255ricF 5'-(P)AAGCTTTGTTGGGGAGTGCGTCACAAATG-3'
bps4255ricR1 5'-(P)AATTCTTATTACAGCGTGACTGCGATTTC-3'
bps4255ricR2 5'-(P)AATTCTTATTACAGCGTGACCGCGATTTC-3'



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с PCE-SH (гибридизацией сигнального олигонуклеотида, зависящей от расщепления и удлинения зондирующего и метящего олигонуклеотида (РТО)).

Изобретение относится к биохимии. Описаны способы повышения экспрессии полинуклеотида NANOG с помощью олигонуклеотидов длиной от 19 до 30 нуклеотидов.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу диагностики растительного материала на трансгенность. Способ включает выделение из биоматериала ДНК и проведение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с зондами, меченными флуоресцентными красителями и гасителями флуоресценции.

Изобретение относится к области биохимии, клинико-лабораторной диагностики, в частности к определению степени обсемененности пародонта патогенными бактериями с помощью ПЦР в реальном времени.

Изобретение относится к области медицины, стоматологии, молекулярной биологии и клинико-лабораторной диагностики. Описан способ определения выраженности нагноения (гноетечения) тканей пародонта.

Изобретение относится к области биохимии и медицины, в частности к способу выявления кандидатных генов для проведения популяционных исследований генетического полиморфизма у детей, проживающих в условиях стронциевой геохимической провинции.

Изобретения относятся к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к генетической инженерии. Предложены синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления РНК атипичного пестивируса крупного рогатого скота и способ их применения.

Настоящее изобретение относится к области генетики. Предложен способ оценки риска возникновения у индивида тромбоэмболического эпизода или диагностики возникновения или наличия такой болезни или эпизода на основании присутствия серпина А10 (ингибитор протеина Z) Arg67Stop (rs2232698), серпина С1 (антитромбин) Ala384Ser (Cambridge II), фактора XII С46Т (rs1801020), фактора XIII Val34Leu (rs5985), фактора II (протромбин) G20210A (rs1799963), фактора V Leiden Arg506Gln (rs6025), фактора V Cambridge Arg306Thr, фактора V Hong Kong Arg306Gly, группы крови ABO rs8176719, группы крови ABO rs7853989, rs8176743 и rs8176750.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к синтетическим олигонуклеотидным зондам и праймерам для выявления ДНК вируса африканской чумы свиней. Предложенные синтетические олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно меченый зонд с внутренним гасителем комплементарны консервативной области гена Р30 (CP204L) вируса африканской чумы свиней и имеют следующий нуклеотидный состав: F1 р30 5'-GTTACGACCGCTATAAAAACA-3' R1 р30 5'-TTCCATTCTTCTTGAGACCTG-3' Z1 (int) p30 5'-(FAM)TACTGTT(RTQ1)AAGTATGATATTGTGA(BHQ1)-3' Предложенное изобретение может быть использовано в генодиагностике инфекционных болезней свиней и ветеринарной вирусологии.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и представлена набором олигонуклеотидных зондов для профилирования микробиоты желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), где указанный набор включает в частности (a) олигонуклеотид, состоящий из (ai) нуклеотидной последовательности, выбранной из ACGCTTGCACCCT (SEQ ID NO: 1) необязательно с не более тремя замещенными основаниями или AGGGTGCAAGCGT (SEQ ID NO: 27) необязательно с не более тремя замещенными основаниями, и (aii) 0-5 нуклеотидов в дополнение к (ai), где олигонуклеотид согласно (а) способен гибридизоваться с SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 1, соответственно, в строгих условиях гибридизации.

Предлагаемый способ относится к фотобиотехнологии, промышленной микробиологии, аквакультуре, экологии, альгологии, биохимии, может быть также использован в пищевой промышленности, животноводстве при производстве кормов, в медицинской и ветеринарной микробиологии.
Изобретение относится к технологии производства биопрепаратов для растениеводства. Изобретение представляет собой способ получения базовой композиции биопрепарата для растениеводства, включающий в себя наработку биомассы гриба Mortierella alpina ВКПМ F-1134, удаление культуральной жидкости, извлечение из мицелия комплекса жирных кислот с преобладанием арахидоновой кислоты, приготовление из него спиртового раствора с введением дополнительных компонентов, где гриб выращивается на поверхности тонкого слоя жидкой питательной среды, инокуляция которой осуществляется до розлива, процесс культивирования длится 18-19 суток, разрушение мицелия осуществляется криодеструкцией и щелочным гидролизом, в конечный продукт добавляется биоразлагаемый детергент, где наработка биомассы происходит на картофельном отваре с добавлением глюкозы и хлорида кальция, наработка биомассы происходит в термостате, биомасса подвергается криодеструкции во влажном состоянии, щелочной гидролиз биомассы проводится при температуре 60°С, стадию щелочного гидролиза совмещают с первым этапом экстракции жирных кислот благодаря использованию раствора гидроксида натрия в 96% этиловом спирте, на втором этапе экстракции жирных кислот в качестве экстрагента используется н-гексан, комплекс жирных кислот после удаления н-гексана перерастворяется в 96% этиловом спирте.
Группа изобретений относится к микробиологии. Предложены жидкая микробиологическая питательная среда и ее применение.

Изобретение относится к биохимии. Описан липополисахарид, антагонист эндотоксинов, продуцируемый штаммом Rhodobacter capsulatus PG, депонированным в ВКМ ИБФМ РАН под номером В-2381 Д, в качестве средства для дифференцировки моноцитоподобных клеток.

Изобретение относится к композиции для поддержания функции тромбоцитов, где композиция в качестве активного ингредиента содержит соединение, представленное общей формулой (I), или его фармацевтически приемлемую соль: где соединение, представленное общей формулой (I), представляет собой любое из N-[2-(4-бут-2-инилоксибензолсульфонил)-1-(4-диэтиламинометилфенил)этил]-N-гидроксиформамида и N-{4-[2-(4-бут-2-инилоксибензолсульфонил)-1-(формилгидроксиамино)этил]бензил}метансульфонамида.

Изобретение относится к области культивирования клеток и тканей. Предложено устройство для культивирования клеточных культур.

Изобретение относится к антибактериальной композиции, содержащей одно или более очищенных соединений, выбираемых из соединений формулы I:, где R1 и R2 независимо выбирают из группы, состоящей из водорода и галогена; и R3 выбирают из группы, состоящей из водорода и C1-С6алкила; и формулы(II), где:R1 и R2 независимо выбирают из группы, состоящей из водорода и галогена; и R3 представляет собой водород, и фармацевтически приемлемых солей.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению модифицированного фактора FVII, и может быть использовано в медицине. Полипептид FVII модифицируют путем замены аминокислотного остатка, выбранной из D196L, D196I, D196Y, К197Е, K197D, K197L, К197М, K197I, K197V, K197F, K197W, K197Y, K199D и K199E, в аминокислотной последовательности FVII, представленной в виде SEQ ID NO: 3, или в соответствующих остатках его предшественника с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ определения функциональной устойчивости сапротрофного микробного комплекса почвы.

Изобретение относится к области биохимии. Предложено средство для выработки электроэнергии.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии. Изобретение представляет собой набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) полной кодирующей последовательности гена мембранного протеина системы секреции III типа (TTSS) HrcV возбудителя мелиоидоза. Изобретение позволяет получить в высокой концентрации фрагмент ДНК, несущий полную последовательность гена, кодирующего высокоиммуногенный мембранный протеин TTSS HrcV возбудителя мелиоидоза, что позволит в перспективе осуществить его клонирование в составе экспрессирующего вектора с целью накопления рекомбинантного антигена. 1 ил., 2 табл., 2 пр.
Наверх