Устройство, применяемое для детектирования аффинностей связывания
Изобретение относится к устройствам, применяемым для детектирования аффинностей связывания, и может быть использовано в биодатчиках. Устройство содержит планарный волновод (2), размещенный на подложке (3), и оптическую развязку (4) для вывода когерентного света (1) заданной длины волны в планарный волновод. Когерентный свет распространяется через планарный волновод (2), а затухающее поле (6) распространяется вдоль внешней поверхности (5) планарного волновода. Внешняя поверхность (5) планарного волновода содержит сайты (7) связывания, способные связывать на ней пробы-мишени (8) с сайтами (7) связывания таким образом, чтобы свет затухающего поля (6) рассеивался пробами-мишенями (8), связанными с сайтами (7) связывания. Сайты (7) связывания размещают вдоль множества заданных линий (9), размещенных таким образом, чтобы рассеянный свет конструктивно интерферировал в заданном местоположении детектирования с разницей длины оптического пути, являющейся целым кратным заданной длине волны. Технический результат – повышение эффективности детектирования, универсальности конструкции. 3 н. и 21 з.п. ф-лы, 21 ил.
Настоящее изобретение относится к устройству, применяемому для детектирования аффинностей связывания, а также к системе и способу детектирования аффинностей связывания по соответствующему независимому пункту формулы изобретения.
Такие устройства используют в качестве биодатчиков в большом количестве разнообразных применений. Одним из частных применений является обнаружение или контроль аффинностей связывания или процессов. Например, с помощью таких биодатчиков можно осуществлять разнообразные исследования по детектированию связывания проб-мишеней с сайтами связывания. Как правило, большое количество таких исследований выполняют на биосенсоре в зонах, расположенных на двухмерном микрочипе на поверхности биосенсора. Применение микрочипов обеспечивает инструментарием для одновременного детектирования аффинностей связывания или обработки разнообразных проб-мишеней в высокопроизводительных скринингах, при которых возможен быстрый анализ больших массивов проб-мишеней, таких как молекулы, белки или ДНК. Для детектирования аффинностей проб-мишеней к связыванию специфичных сайтов связывания (например, аффинностей молекул-мишеней к связыванию с различными молекулами захвата), большое количество сайтов связывания иммобилизуют на поверхности биосенсора в зонах, которые могут быть нанесены с помощью, например, струйного нанесения. Каждое пятно образует самостоятельную зону для измерения определенного типа молекулы захвата. Для получения информации об аффинности связывания пробы-мишени определяют аффинность пробы-мишени к специфичному типу молекулы захвата.
В известной технологии детектирования аффинностей связывания проб-мишеней применяют метки, способные испускать при возбуждении ультрафиолетовый свет. Например, в качестве меченых участков в пробах-мишенях могут применяться флуоресцентные метки. Возбуждение флуоресцентных меток вызывает испускание флуоресцентного света, обладающего характеристическим эмиссионным спектром. Детектирование этого характеристического эмиссионного спектра в конкретном пятне указывает на то, что меченная молекула-мишень связана с конкретным типом сайтов связывания, присутствующим в соответствующем пятне.
Сенсор для выявления меченых проб-мишеней описан в статье "Zeptosens' protein microarrays: A novel high performance microarray platform for low abundance protein analysis", Proteomics 2002, 2, S. 383-393, Wiley-VCH Verlag GmbH, 69451 Weinheim, Germany. Сенсор, описанный в данной работе, содержит планарный волновод, расположенный на подложке, и решетку для ввода когерентного света определенной длины волны в планарный волновод. Дополнительную решетку размещают на крае планарного волновода, удаленном от решетки для ввода света в волновод. Когерентный свет, распространяющийся по планарному волноводу, выводят из волновода посредством дополнительной решетки. Выведенный свет применяют для юстировки ввода в планарный волновод когерентного света заданной длины волны. Когерентный свет распространяется по планарному волноводу при полном отражении затухающего поля когерентного света, распространяющегося вдоль внешней поверхности планарного волновода. Глубина проникновения поля в среду с более низким показателем преломления на внешней поверхности планарного волновода составляет по порядку величины долю длины волны когерентного света, распространяющегося по планарному волноводу. Затухающее поле возбуждает меченые флуоресцентные участки меченых проб-мишеней, связанных с сайтами связывания, размещенными на поверхности планарного волновода. Из-за очень незначительного проникновения затухающего поля в оптически более тонкую среду на внешней поверхности планарного волновода возбуждаются только меченые пробы, связанные с сайтами связывания, иммобилизованными на внешней поверхности планарного волновода. Флуоресцентный свет, порожденный этими участками, затем обнаруживают с помощью CCD камеры (камеры с ПЗС матрицей).
Хотя, применяя флуоресцентные метки, принципиально возможно определять аффинности связывания, данная технология имеет тот недостаток, что обнаруженный сигнал создается метками, а не партнерами по связыванию как таковыми. Кроме того, метка проб-мишеней требует дополнительных стадий обработки. Более того, меченые пробы-мишени являются сравнительно дорогими. Другим недостатком является фальсификация результатов, обусловленная эффектами фотообесцвечивания или гашения.
Задача настоящего изобретения состоит в создании устройства, применяемого для детектирования аффинностей связывания пробы-мишени, а также системы и способа, способных обнаруживать поименованные аффинности связывания, преодолевающие или по меньшей мере сильно уменьшающие недостатки вышеописанного сенсора, известного в уровне техники.
В соответствии с изобретением эта задача решается при помощи устройства, применяемого для детектирования аффинностей связывания. Устройство содержит планарный волновод, размещенный на подложке и дополнительно содержит оптическую развязку для вывода когерентного света заданной длины волны в планарный волновод, таким образом что когерентный свет распространяется по планарному волноводу, в то время как затухающее поле когерентного света распространяется вдоль внешней поверхности планарного волновода. Внешняя поверхность планарного волновода содержится сайты связывания, способные к связыванию проб-мишеней с сайтами связывания, таким образом, что свет затухающего поля рассеивается пробами-мишенями, связанными с сайтами связывания. Сайты связывания размещают вдоль множества заданных линий, причем заданные линии размещают таким образом, что свет, рассеиваемый пробами-мишенями, связанными с сайтами связывания в заданном местоположении детектирования, интерферирует с разницей длины оптического пути, являющейся целым кратным заданной длине волны света.
Детектирование аффинностей связывания согласно изобретению не ограничена ни специфичными типами проб-мишеней, ни каким бы то ни было типом сайтов связывания, при том, что в значительной степени характеристики связывания молекул, белков, ДНК и так далее могут быть проанализированы по отношению к любому типу сайтов связывания на планарном волноводе. Детектирование аффинностей связывания может осуществляться без применения метки. В качестве альтернативы, для увеличения чувствительности детектирования могут применяться усилители рассеяния (например, метки рассеивания), сильно рассеивающие свет. Такие усилители рассеивания могут представлять собой наночастицу (как таковую или со связующим) или другую разновидность коллоидной частицы. Тип связывания, подлежащий анализу, может быть статическим (например, можно доказать наличие или отсутствие связи пробы-мишени с сайтами связывания) или динамическим (например, можно проанализировать динамику процесса связывания во времени). Сайты связывания представляют собой местоположения на внешней поверхности планарного волновода, с которыми могут связываться пробы-мишени. Например, сайты связывания могут содержать молекулы захвата, иммобилизованные на внешней поверхности планарного волновода, или могут просто содержать активированные местоположения на внешней поверхности планарного волновода, способные связывать пробы-мишени с активированными местоположениями, или могут быть воплощены любым иным способом, который в состоянии связывать пробы-мишени в искомых местоположениях на внешней поверхности планарного волновода. Множество заданных линий может содержать индивидуальные отдельные линии или может содержать систему линий, в которой индивидуальные линии соединены так, что они образуют одну линию, например систему извилистых линий. Расстояние между соседними заданными линиями, вдоль которой размещены сайты связывания, выбирают с учетом заданной длины волны света. Предпочтительное расстояния между соседними заданными линиями составляют порядка или более 100 нм. Диапазон расстояний между соседними заданными линиями от около 100 нм до около 1000 нм является предпочтительным при использовании в планарном волноводе видимого света, чтобы рассеянный свет можно было детектировать при помощи стандартных оптических средств. Вдобавок, предпочтительно, чтобы планарный оптический волновод имел более высокий показатель преломления относительно среды на внешней поверхности планарного волновода, так чтобы глубина проникновения затухающего поля была незначительной, а доля когерентного света, распространяющегося в поле, была высокой. Например, показатель преломления планарного волновода может находиться в диапазоне от 1,6 до 2,5, в то время как показатель преломления среды на поверхности планарного волновода находится как правило в диапазоне от 1 до 1,5. К примеру, сайты связывания могут содержать молекулы захвата, иммобилизованные на внешней поверхности планарного волновода. К тому же связанные иммобилизованные молекулы захвата вместе с пробами-мишенями образуют множество центров рассеяния, рассеивающих когерентный свет затухающего поля. Когерентный свет, распространяющийся вдоль планарного волновода, имеет заданную длину волны, и предпочтительно является монохроматичным (в идеале с одной длиной волны). Поскольку свет от затухающего поля, распространяющийся вдоль поверхности планарного волновода, является когерентным, так же как и свет, распространяющийся внутри планарного волновода, когерентный свет затухающего поля рассеивается когерентно центрами рассеивания, образованными молекулами-мишенями, связанными с молекулами захвата (или в более общем смысле, пробой-мишенью, связанной с сайтами связывания), расположенными на различных заданных линиях. Рассеянный свет в любом местоположении можно определить сложением вкладов от каждого индивидуального центра рассеяния. Максимум рассеянного света расположен в заданном местоположении детектирования, так как заданные линии размещают таким образом, что в заданном местоположении оптическая длина пробега света, рассеянного различными центрами рассеяния, отличается на целое кратное длине волны света. Чтобы обеспечить в местоположении детектирования максимальный сигнал, оптическая длина пробега света от оптической развязки до заданных линий и оттуда до заданного местоположения детектирования также представляет собой целое кратное от заданной длины волны. Таким образом, свет, рассеянный пробами-мишенями, связанными с сайтами связывания интерферирует в заданном местоположении детектирования. Сигнал любого рассеянного света, добавляющий к детектируемому сигналу в местоположении детектирования, отвечает требованию конструктивной интерференции. Заданное местоположение детектирования не ограничено конкретной формой, например, оно может иметь форму точки или полоски. Точное расположение сайтов связывания на заданных линиях «вдоль заданных линий» является оптимальным случаем, в котором все сайты связывания точно расположены на заданных линиях. В результате такого оптимального положения сайтов связывания достигается максимальный сигнал в местоположении детектирования. Специалисту в данной области техники очевидно, что на практике расположение сайтов связывания до некоторой степени отклоняется от такого оптимального расположения. Например, отклонение может быть обусловлено способом, с помощью которого сайты связывания размещают на внешней поверхности планарного волновода, как более подробно будет объяснено ниже.
В соответствии с одним аспектом устройства по изобретению расстояние между соседними заданными линиями уменьшается в направлении распространения света затухающего поля. Как правило, углы, под которыми рассеянный свет затухающего поля интерферирует в заданном местоположении детектирования, неодинаковы в различных центрах рассеяния (пробы-мишени, связанные с сайтами связывания), расположенных вдоль заданных линий. Поскольку необходимо, чтобы при заданном местоположении детектирования рассеянный свет интерферировал на максимуме, разность оптической длины пробега, рассеянной от различных центров рассеяния, должна быть целым кратным длины волны света. Уменьшение расстояния между соседними заданными линиями проводят с учетом этого факта и тем самым свет в местоположении детектирования вынуждают интерферировать на максимуме, что позволяет отказаться от формы детектора в виде точки или маленького пятна, но позволяет придавать ему форму полоски или любую другую желаемую форму.
В соответствии с дополнительным аспектом устройства по изобретению, множество заданных линий, на которых размещены сайты связывания, содержит кривые линии. Кривизна линий такова, что свет затухающего поля, рассеянный пробами-мишенями, связанными с сайтами связывания, расположенными вдоль этих заданных линий интерферирует на максимуме в заданном местоположении детектирования. Местоположение детектирования предпочтительно имеет форму точки. Каждая из индивидуальных заданных линий может иметь кривизну, отличную от кривизны других заданных линий. На практике местоположение детектирования не является точкой, но может представлять собой маленькое пятно или полоску длиной, меньшей длины заданных линий, вдоль которых размещены сайты связывания. Кривизну каждой из индивидуальных кривых линий выбирают такой, чтобы оптическая длина пробега света, распространяющегося от оптической развязки к индивидуальной заданной линии и оттуда в заданное местоположение детектирования, являлась целым кратным от заданной длины волны распространяющегося света для кривой линии на всем протяжении. Это полезно в том отношении, что свет, рассеиваемый центрами рассеяния, сосредоточенный на удаленных частях заданных линий, вносит вклад в сигнал в пространственно уменьшенной области точечного (или в форме пятна, или в форме полоски) положения детектирования.
В соответствии с еще одним дополнительным аспектом устройства по изобретению множество заданных линий размещают на внешней поверхности планарного волновода таким образом, что их геометрические положения в координатах xj, yj определяют уравнением
где
λ представляет собой длину волны света, распространяющегося в вакууме,
N представляет собой эффективный показатель преломления канализированной моды в планарном волноводе; N зависит от толщины и показателя преломления планарного волновода, показателя преломления подложки, показателя преломления среды на внешней поверхности планарного волновода и поляризации канализированной моды,
ns представляет собой показатель преломления подложки,
f представляет собой толщину подложки,
А0 представляет собой целое число, которое выбирают близким к произведению показателя преломления ns на толщину f подложки деленному на длину волны λ, и
j представляет собой переменную, выраженную целым числом, показывающую индекс соответствующей линии.
Выбранному целому числу А0 приписывают отрицательные значения χ в центре линий при отрицательных значениях j, и положительные значения x в центре линий при положительных значениях j. Или говоря другими словами, целое число А0 определяет начало отсчета в системе координат x, y, применяемой для определения места линий y внешней поверхности планарного волновода; выбранное значение А0 задает местоположение детектирования при x=0, y=0, z=-f.
Как уже подчеркивалось выше, для улучшения сигнала в заданном местоположении детектирования, предпочтительно, чтобы множество заданных линий было размещено таким образом, чтобы центры рассеяния, размещенные вдоль этих заданных линий, были сосредоточены на изогнутой решеткообразной структуре с уменьшенным расстоянием между соседними заданными линиями. Такое размещение удовлетворяет следующему условию: разность оптической длины пробега света, распространяющегося от оптической развязки, и расстояния от заданного местоположения детектирования до индивидуальных заданных линий, и рассеянного центрами рассеяния, является целым кратным заданной длине волны света, распространяющегося в волноводе. Также оптическая длина пробега света, распространяющегося от оптической развязки до индивидуальных заданных линий, и оттуда до заданного местоположения детектирования является целым кратным заданной длины волны распространяющегося света на всей кривой линии. Таким образом, возможно создать компактное устройство, коль скоро сайты связывания размещены на поверхности планарного волновода, в то время как местоположение детектирования может осуществляться на нижней поверхности подложки, несущей планарный волновод.
Два варианта осуществления изобретения особенно отвечают на вопрос, каким образом сайты связывания можно разместить вдоль множества заданных линий. Согласно первому варианту осуществления изобретения, сайты связывания содержат только молекулы захвата, прикрепленные к поверхности планарного волновода только вдоль заданных линий. Эти молекулы захвата способны связывать пробы-мишени и иммобилизованы на внешней поверхности планарного волновода (хотя как было упомянуто выше, сайты связывания могут формироваться самой активированной поверхностью планарного волновода). Иммобилизация молекул захвата на внешней поверхности планарного волновода вдоль заданных линий, как правило, может проводиться любым подходящим способом, например, она может проводиться применением фотолитографических способов, применяя криволинейный литографический шаблон с кривыми линиями. Само собой разумеется, что размещение сайтов связывания вдоль заданных линий по любому варианту осуществления изобретения, предположительно большинства сайтов связывания - по настоящему воплощению изобретения также и молекул захвата, сосредоточенных вдоль заданных линий однозначно включает размещение некоторых сайтов связывания в других местоположениях.
Согласно второму варианту осуществления изобретения сайты связывания опять содержат молекулы захвата, способные связывать пробы-мишени, причем отсутствуют ограничения относительно конкретного типа сайта связывания или конкретного типа пробы-мишени. Молекулы захвата по-прежнему способны связывать пробы-мишени. Однако, размещение молекул захвата, способных связывать пробы-мишени вдоль заданных линий, проводят, распределяя и иммобилизуя молекулы захвата, способные связывать пробы-мишени на (всей) поверхности планарного волновода, и впоследствии дезактивируя те молекулы захвата, которые не были размещены вдоль заданных линий. Термин «дезактивация» в этом смысле относится к любому подходящему способу изменения связывающей способности молекулы захвата (например, экспозицией молекул захвата к свету в течение заданного времени), чтобы ликвидировать их способность связывать пробы-мишени. Согласно этому варианту осуществления изобретения, молекулы захвата можно наносить на внешнюю поверхность планарного волновода равномерно или статистически. После дезактивации молекул захвата, размещенных между заданными линиями, только молекулы захвата, размещенные вдоль заданных линий (те которые не были дезактивированы), способны связывать пробу-мишень. Тем не менее, дезактивированные молекулы захвата остаются иммобилизованными на поверхности планарного волновода.
Данный вариант осуществления изобретения имеет еще одно преимущество, состоящее в том, что увеличивается вклад сигнала, генерированного светом, рассеянным молекулами-мишенями, связанными с молекулами захвата, в общий сигнал в местоположении детектирования. Как правило, разница между сигналами от света, рассеянного молекулами-мишенями, связанными с молекулами захвата и от света, рассеянного молекулами захвата без каких-либо связанных с ними молекул-мишеней является незначительной по сравнению со светом, рассеянным только молекулами захвата. Если предположить, что рассеивающие свойства молекул захвата (не дезактивированных), размещенных вдоль заданных линий и дезактивированных молекул захвата, размещенных между заданными линиями являются идентичными, и дополнительно предположить, что молекулы захвата распределены равномерно по внешней поверхности планарного волновода, тогда в идеале в местоположении детектирования сигнал не будет вырабатываться и после иммобилизации молекул захвата на внешней поверхности планарного волновода, и после дезактивации молекул захвата, размещенных между заданными линиями. На практике, однако, дезактивация молекул захвата слегка изменяет рассеивающие свойства молекул захвата, так что существует вероятность не идеально дезактивировать все молекулы захвата размещенные между заданными линиями. Вместо этого, можно дезактивировать только подавляющее большинство молекул захвата, размещенных между заданными линиями. Дезактивацию молекул захвата проводят до величины, обеспечивающей суммарный сигнал в местоположении детектирования, вызванный молекулами захвата, размещенными вдоль заданных линий и дезактивированными и не дезактивированными молекулами захвата, размещенными между заданными линиями, сведенным к минимуму, а предпочтительно к нулю. Предположим, что величина сигнала, получаемого в местоположении детектирования, может быть уменьшен до нуля, это значит, что после добавления проб-мишеней сигнал, вырабатываемый в местоположении детектирования, соответствует только пробам-мишеням, связанным с молекулами захвата. В случае если объекты целевой выборки не связаны с молекулами захвата, сигнал у местоположения детектирования остается нулевым. Это увеличивает чувствительность детектора для сигнала, генерированный светом, рассеянным молекулами-мишенями, связанными с молекулами захвата в местоположении детектирования.
В соответствии с дополнительным аспектом устройства по изобретению планарный волновод имеет показатель преломления nw, существенно выше, чем показатель преломления ns подложки, и существенно выше, чем показатель преломления nmed среды на внешней поверхности планарного волновода, так что для заданной длины волны затухающее поле имеет глубину проникновения в диапазоне от 40 нм до 200 нм. Термин "существенно выше" следует понимать как обозначение разницы в показателе преломления, позволяющей ввод света в планарный волновод, в условиях распространения при полном отражении. Свет, распространяющийся вдоль планарного волновода, имеет затухающее поле, распространяющееся вдоль внешней поверхности планарного волновода. Затухающее поле имеет глубину проникновения, зависящую от индекса nmed, эффективного показателя преломления N канализированной моды, а также от длины волны распространяющегося света, поэтому глубину проникновения можно подобрать таким образом, чтобы свет от затухающего поля когерентно рассеивался пробами-мишенями, связанными с сайтами связывания, размещенными на (или поблизости) от заданных линий на внешней поверхности. Следует понимать, что, в пределы упомянутой приблизительной оценки глубины проникновения включены их точные граничные значения.
В соответствии с дополнительным аспектом устройства по изобретению устройство содержит дополнительную оптическую развязку для вывода света, распространившегося через планарный волновод. Как оптическая развязка для ввода света в планарный волновод, так и дополнительная оптическая развязка для вывода света, прошедшего через планарный волновод, могут содержать оптическую решетку для вывода света внутрь и изнутри планарного волновода когерентно. Оптическая развязка и дополнительная оптическая развязка содержат оптическую решетку для ввода света внутрь и вывода изнутри планарного волновода когерентно под соответствующими определенными углами для ввода внутрь и вывода изнутри. Угол для ввода внутрь и угол для вывода изнутри определяются длиной волны света, а также особенностью оптической развязки. Однако в рамках объема изобретения свет может быть введен внутрь и выведен изнутри планарного волновода толщиной от нескольких нанометров до нескольких сотен нанометров посредством любых иных средств. Только в качестве примера, альтернативной оптической развязкой может являться оптическая призма.
В соответствии с дополнительным аспектом устройства по изобретению планарный волновод имеет первую концевую секцию и вторую концевую секцию, размещенные на противоположных концах планарного волновода, с учетом направления распространения света через планарный волновод. Первая концевая секция и вторая концевая секция содержат материал, поглощающий длину волны света, распространяющегося вдоль планарного волновода по направлению к соответствующей концевой секции и обратно в планарный волновод. Абсорбирующий материал уменьшает отражения света, распространяющегося вдоль планарного волновода по направлению к соответствующей концевой секции и обратно в волновод. Это улучшает детектируемый сигнал, так как удаляется или по меньшей мере минимизируется свет, который иначе мог бы отразиться от концов планарного волновода.
В соответствии с дополнительным аспектом устройства по изобретению на внешней поверхности планарного волновода размещают множество измерительных зон. В каждой измерительной зоне сайты связывания размещают вдоль заданных линий. При высокопроизводительном скрининге может быть достигнуто одновременное детектирование аффинностей связывания пробы к различным типам сайтов связывания и пробам-мишеням, размещая соответствующие пробы-мишени, связанные с сайтами связывания в отдельных измерительных зонах. Каждая измерительная зона имеет соответствующее индивидуальное местоположение, чтобы обеспечивать одновременное детектирование рассеянного света затухающего поля.
В соответствии с дополнительным аспектом устройства по изобретению множество измерительных зон содержит измерительные зоны разного размера. Известны все размеры измерительных зон. При соответствующем местоположении детектирования можно сравнивать свет, рассеянный в соответствующих измерительных зонах различного размера, в которых один и тот же тип проб-мишеней связывают с одним и тем же типом сайтов связывания. Интенсивность рассеянного света в местоположениях детектирования находится в квадратичной зависимости от числа рассеивающих центров в соответствующей измерительной зоне на планарной поверхности волновода. Так, для равномерного распределения и плотности размещения рассеивающих центров в измерительных зонах, интенсивности рассеивающего центра в соответствующих местоположениях детектирования соответствующих измерительных зон различного размера находятся в квадратичной зависимости от размера соответствующих измерительных зон. Поэтому интенсивности рассеянного света в местоположениях детектирования измерительных зон различного размера можно использовать, чтобы проконтролировать, что измеренные интенсивности действительно репрезентативно отражают свет, рассеянный центрами рассеяния, размещенными на заданных линиях.
В соответствии с аспектом изобретения каждая измерительная зона имеет площадь, превышающую 25 мкм2, при том что во множестве заданных линий расстояние между соседними заданными линиями составляет менее 1,5 мкм, в частности менее 1 мкм. Это позволяет реализовать весьма сложные устройства с большим количеством измерительных зон, например, 1000, 10000, 100000, …, до 4×106 измерительных зон на квадратный сантиметр.
Полезно размещать сайты связывания вдоль по меньшей мере двух множеств заданных линий в одной и той же измерительной зоне. Каждое из двух множеств заданных линий размещают таким образом, чтобы свет, рассеиваемый пробами-мишенями, связанными с сайтами связывания, размещенными вдоль соответствующего множества заданных линий, интерферировал при разнице в оптической длине пробега, являющейся целым кратным заданной длины волны света в индивидуальном местоположении детектирования для каждого множества заданных линий. Индивидуальные местоположения детектирования пространственно разделены друг от друга. Более чем одно множество заданных линий в измерительной зоне размещены таким образом, чтобы обеспечить возможность в пространственно разделенных местоположениях детектирования применять дополнительные способы детектирования событий связывания (например, детектирование кооперативных связываний или детектирование каскадов реакций).
В соответствии с еще одним аспектом устройства по изобретению устройство содержит диафрагму, имеющую отверстие, расположенное таким образом, чтобы свет в местоположении детектирования имел возможность проходить через отверстие, но в то же время свет в местоположениях, отличных от местоположения детектирования блокировался диафрагмой. Для блокировки всего света, кроме света, рассеиваемого в местоположении детектирования, могут применяться, как механическая, так и электронная диафрагма. Предпочтительно, чтобы диафрагма была установлена на внешней поверхности подложки, на дальней стороне от планарного волновода. Например, на поверхность подложки, удаленной от волновода, может помещаться непрозрачный материал, например, слой хрома. Непрозрачный хромовый слой содержит прозрачное отверстие в направлении местоположения детектирования, через которое может проходить свет, рассеянный в направлении местоположения детектирования, в то время как остальной свет, не рассеиваемый на отверстие, не проходит.
В соответствии с еще одним дополнительным аспектом устройства по изобретению диафрагма дополнительно содержит по меньшей мере одно дополнительное отверстие, смежное с отверстием, если смотреть в направлении распространения света через планарный волновод. Дополнительное отверстие расположено рядом таким образом, что некогерентный свет, рассеянный на дополнительное отверстие, может проходить через дополнительное отверстие. Предпочтительно детектируемый некогерентный фоновый свет может быть исправлен применением диафрагмы с дополнительным отверстием. Дополнительное отверстие само по себе не детектирует некогерентный фоновый свет в местоположении детектирования, но позволяет определить количество некогерентного света в местоположении детектирования, измеряя некогерентный свет в местоположении, отличном от местоположения детектирования. Установленное таким образом количество некогерентного света в местоположении детектирования не может быть отделено от когерентного света в местоположении детектирования, но может вычтено из полного сигнала в местоположении детектирования тогда, когда в местоположении детектирования детектором был измерен полный сигнал. Для улучшенной коррекции первое дополнительное отверстие размещено по отношению к направлению распространяющего света перед местоположением детектирования, а второе дополнительное отверстие размещено позади местоположения детектирования. Такая конфигурация позволяет детектировать усредненную величину некогерентного света в местоположении детектирования, чтобы корректировать сигнал в местоположении детектирования.
Еще один аспект изобретения относится к системе детектирования аффинностей связывания, содержит устройство для детектирования аффинностей связывания по изобретению. Система дополнительно содержит источник света, излучающий когерентный свет заданной длины волны, причем источник света и устройство размещают одно относительно другого таким образом, что когерентный свет вводят в планарный волновод через оптическую развязку. В качестве альтернативы система дополнительно содержит оптическое средство для сканирования и/или настройки угла, под которым свет падает на оптическую развязку, так как точное значение угла падения света на оптическую развязку может меняться от устройства к устройству. В качестве альтернативы, конструкционные особенности позволяют настраивать длину волны света, излученного источником света в систему, что может оказаться предпочтительным при фиксированном значении угла света, падающего на оптическую развязку.
Согласно еще одному аспекту системы по изобретению система дополнительно содержит модуль формирования изображения, причем модуль формирования изображения сфокусирован на формирование изображения в местоположении детектирования устройства. Модуль формирования изображения способен предоставлять изображение заданного местоположения детектирования, в котором свет, рассеянный пробами-мишенями, связанными с сайтами связывания, интерферирует с разницей в оптической длине пробега, равной целому кратному от заданной длины волны света. Модуль формирования изображения можно применять для визуализации света, присутствующего в местоположении детектирования, в местоположении наблюдения. Модуль формирования изображения можно адаптировать для изображения как света от местоположения детектирования, так и света от дополнительного отверстие или дополнительных отверстий, коль скоро этот свет может применяться для вычитания некогерентного фонового света из полного света, присутствующего в местоположении детектирования. В качестве альтернативы или в дополнение, модуль формирования изображения можно применять для выделения только света в местоположении детектирования, фокусируя модуль формирования изображения на местоположение детектирования. В этом случае отпадает необходимость в диафрагме.
Еще один аспект изобретения относится к способу детектирования аффинностей связывания. Способ содержит этапы, на которых:
- обеспечивают сборку устройства, содержащего планарный волновод, на подложке и оптической развязке,
- вводят когерентный свет заданной длины волны в планарный волновод таким образом, что когерентный свет распространяется вдоль планарного волновода, в то время как когерентный свет с затухающим полем, распространяется вдоль внешней поверхности планарного волновода,
- присоединяют пробы-мишени к сайтам связывания, размещенным по множеству заданных линий на внешней поверхности планарного волновода,
- детектируют в местоположении детектирования света затухающего поля, рассеянного пробами-мишенями, связанного с сайтами связывания, имеющего в заданном местоположении детектирования разницу в длине оптического пути, являющуюся целым кратным заданной длине волны света.
Дополнительные полезные аспекты изобретения становятся очевидными при рассмотрении нижеследующего описания вариантов осуществления изобретения при отсылке к сопровождающим схематическим рисункам, на которых:
Фиг. 1 показывает вариант осуществления устройства по изобретению - вид в перспективе;
Фиг. 2 показывает вид в разрезе устройства по Фиг. 1;
Фиг. 3 показывает иллюстрацию различных путей для света затухающего поля, распространяющегося вдоль внешней поверхности и рассеянного в местоположении детектирования;
Фиг. 4 показывает измерительную зону устройства согласно изобретению, содержащую размещение множества заданных линий с сайтами связывания, иммобилизованными вдоль заданных линий;
Фиг. 5 показывает измерение по Фиг. 4 с некоторыми пробами-мишенями, связанными с сайтами связывания;
Фиг. 6 показывает измерительную зону устройства по изобретению, содержащую размещение множества заданных линий с сайтами связывания, иммобилизованными вдоль заданных линий и между заданными линиями;
Фиг. 7 показывает измерительную зону по Фиг. 6, с теми дезактивированными сайтами связывания, которые размещены между заданными линиями;
Фиг. 8 показывает измерительную зону по Фиг. 7 с добавленными пробами-мишенями;
Фиг. 9 показывает измерительную зону по Фиг. 8 с пробами-мишенями, связанными с сайтами связывания, иммобилизованными вдоль заданных линий;
Фиг. 10 показывает иллюстрацию конструкции подготовительной секции, на которой заданные линии измерительной зоны были вынужденно удалены;
Фиг. 11 показывает измерительную зону по Фиг. 10, с подготовительной секцией с удаленными заданными линиями;
Фиг. 12 показывает вид сверху по дополнительному варианту осуществления изобретения устройства по изобретению, содержащего множество измерительных зон;
Фиг. 13 показывает вид снизу по варианту осуществления изобретения устройства по Фиг. 10 с отверстием, предусмотренным в местоположении детектирования и двумя дополнительными отверстиями, предусмотренными в местоположениях спереди и сзади местоположения детектирования для каждой измерительной зоны;
Фиг. 14-17 показывают часть измерительной зоны устройства по изобретению в различных фазах процесса связывания проб-мишеней;
Фиг. 18 показывает вид в разрезе дополнительного варианта осуществления изобретения устройства, согласно которому устройство содержит дополнительную подложку-носитель;
Фиг. 19 показывает иллюстрацию различных оптических путей света затухающего поля, рассеянного у двух различных множеств заданных линий, размещенных в одной и той же измерительной зоне;
Фиг. 20 показывает вид сверху устройства по Фиг. 18, имеющего двенадцать размещенных на нем измерительных зон, с тремя множествами заданных линий, размещенных в каждой измерительной зоне, и
Фиг. 21 показывает вид снизу устройства по Фиг. 18 с отверстиями в непрозрачном слое, образованном на верху дополнительной подложки-носителя.
Фиг. 1 показывает вид в перспективе варианта осуществления устройства по изобретению для детектирования аффинностей связывания пробы. Устройство содержит подложку 3 из прозрачного материала, имеющую, согласно варианту осуществления изобретения форму прямоугольного куба, без ограничения по форме. Планарный волновод 2 (см. также Фиг. 2) размещают на верхней стороне подложки 3, в волновод 2 вводят когерентный свет 1, так чтобы когерентный свет при полном отражении распространялся через планарный волновод 2. Поскольку планарный волновод 2 имеет толщину порядка только от нескольких нанометров до нескольких сотен нанометров, он на Фиг. 1 не показан как отдельный слой, но увеличенный на Фиг. 2. Как показано на Фиг. 1 параллельными стрелками, когерентный свет 1 заданной длины волны вводят через подложку 3 в планарный волновод 2 с помощью решетки 4, выполняющей роль оптической развязки. Когерентный свет, который вводят в планарный волновод 2, распространяется вдоль планарного волновода 2, причем затухающее поле 6 (представленное стрелкой) проникает в среду над верхней поверхностью планарного волновода 2 (см. опять Фиг. 2). Затухающее поле 6 распространяется вдоль верхней поверхности 5 планарного волновода 2. Измерительная зона 10, размещенная на внешней поверхности планарного волновода 2 содержит множество заданных линий 9 (каждая из показанных линий представляет множество линий, конкретно по настоящему примеру такого устройства пятьдесят линий и только одна такая измерительная зона для ясности показана на Фиг. 1). Сайты связывания (не показаны на Фиг. 1), с которыми могут связываться пробы-мишени, размещают вдоль этих заданных линий 9. Когерентный свет затухающего поля 6 рассеивается пробами-мишенями, связанными с сайтами связывания внутри измерительной зоны 10. Некоторое количество света, рассеянного пробами-мишенями, связанными с сайтами связывания, направляют в местоположение детектирования, где размещена диафрагма 11, содержащая отверстие 21. Диафрагма 11 изготовлена из непрозрачного материала, и она может, например, представлять собой слой хрома, наносимый на нижнюю поверхность подложки 3.
Фиг. 2 показывает вид в разрезе устройства по Фиг. 1, причем толщину планарного волновода для объяснения общего рабочий принципа показывают увеличенной. Как можно видеть, свет, вводимый в планарный волновод 2 при помощи оптической решетки 4, распространяется через планарный волновод 2 при полном отражении, пока не достигнет дополнительной решетки 13, размещенной на противоположном конце планарного волновода 2. Эта дополнительная решетка служит в качестве дополнительной оптической развязки при выводе света из планарного волновода. Чтобы избежать отражения и для уменьшения некогерентного фонового света, первая концевая секция 14 и вторая концевая секция 15 планарного волновода 2 содержат поглощающий материал. Соответствующее свету, распространяющемуся в планарном волноводе, затухающее поле 6 распространяется вдоль внешней поверхности 5 планарного волновода 2.
Показатель преломления nw планарного волновода 2 существенно выше, чем показатель преломления ns подложки 3, а также существенно выше, чем показатель преломления nmed среды на внешней поверхности 5 планарного волновода 2. Показатель преломления nmed среды на внешней поверхности 5 может изменяться в зависимости от типа нанесенной на него пробы. Например, показатель преломления nmed среды на внешней поверхности 5 может быть порядка показателя преломления воды, в случае если проба-мишень представлена в водном растворе, приложенным к внешней поверхности 5 планарного волновода 2, или может быть порядка показателя преломления воздуха в случае сухих проб-мишеней, или может быть порядка показателя преломления гидрогелевого слоя 16, в случае если сайты связывания, с которыми могут связываться пробы-мишени 8 содержатся в гидрогелевом слое 16 на внешней поверхности 5. Глубина проникновения поля 6 в среду на внешней поверхности 5 планарного волновода 2 (расстояние между внешней поверхностью 5 планарного волновода 2 и точкой уменьшения интенсивности затухающего поля в 1/е2 раз 6) зависит от показателя nmed среды на внешней поверхности 5 планарного волновода 2, эффективного показателя преломления N канализированной моды и длины волны λ света.
Свет в затухающем поле 6, распространяющийся вдоль внешней поверхности 5 планарного волновода 2, рассеивается пробами-мишенями 8, связанными с сайтами связывания, и эти сайты связывания могут содержать молекулы 7 захвата, которые могут связывать пробы-мишени 8 и которые размещены в измерительной зоне 10 вдоль заданных линий 9 (Фиг. 1). На Фиг. 2 это показано стрелками уменьшающейся длины, таким образом, что расстояние между соседними заданными линиями, вдоль которых размещены молекулы 7 захвата, уменьшается если смотреть в направлении распространения света. Как можно видеть далее, в варианте осуществления изобретения, показанном на Фиг. 2, пробы-мишени 8 были нанесены на измерительную зону путем подачи капли, содержащей пробы-мишени 8. Некоторое количество света, рассеянного пробами-мишенями 8, связанными с молекулами 7 захвата направляют в местоположение детектирования, где размещено отверстие 21 диафрагмы 11. В качестве альтернативы свет в местоположении детектирования может быть визуализирован на фотодетекторе 20 модулем 19 формирования изображения. Модуль 19 формирования изображения и фотодетектор 20, как показано, окружены футляром, нарисованным пунктирными линиями, хотя их можно предоставить или отдельно друг от друга, или совместно, в частном случае их применяют в совместно, в одном блоке.
Хотя уже из Фиг. 2 очевидно, что длины оптических путей света затухающего поля 6, рассеянного пробами-мишенями 8, связанными с различными молекулами 7 захвата, в местоположение детектирования являются различными, это становится даже более понятным, если посмотреть на Фиг. 3, в которой однозначно показано число таких различных оптических путей. Некоторое количество когерентного света затухающего поля 6 рассеивается пробами-мишенями 8, связанными различными молекулами 7 захвата так, чтобы интерферировать в местоположении детектирования, которое является местоположением отверстия 21 диафрагмы 11. Для заданного местоположения детектирования размещение и геометрию заданных линий 9, а также толщину подложки 3 выбирают таким образом, чтобы в местоположении детектирования разница длины оптического пути являлась целым кратным заданной длине волны когерентного света. Таким образом, интерференция света в местоположении детектирования представляет собой когерентную аддитивную суперпозицию света, рассеянного в местоположении детектирования целевыми молекулами 8, связанными с различными молекулами 7 захвата.
В варианте осуществления изобретения, показанном на Фиг. 3, множества заданных кривых линий 9 размещены на внешней поверхности 5 планарного волновода так, что их местоположения в плоскости внешней поверхности 5 планарного волновода геометрически выражаются уравнением в xj, yj-координатах
где
λ представляет собой длину волны рассеянного света в вакууме,
N представляет собой эффективный показатель преломления канализированной моды в планарном волноводе; N зависит от толщины и показателя преломления планарного волновода, показателя преломления подложки, показателя преломления среды на внешней поверхности планарного волновода и поляризации канализированной моды,
ns представляет собой показатель преломления подложки,
f представляет собой толщину подложки,
А0 представляет собой целое число, выбранное близким к произведению показателя преломления ns и толщины f подложки, разделенному на длину волны λ и
j представляет собой переменную, выраженную целым числом, показывающую индекс соответствующей линии.
Фиг. 4 показывает увеличенное изображение измерительной зоны 10, содержащий заданные линии 9 и сайты связывания, представленные молекулами 7 захвата, иммобилизованными на внешней поверхности планарного волновода 5 (см. Фиг. 1) вдоль заданных линий 9. Иммобилизация молекул 7 захвата вдоль заданных линий может быть выполнена с помощью литографических технологий, как это обсуждалось выше. На Фиг. 5 пробы-мишени 8 связаны с некоторыми из молекул 7 захвата. Поскольку молекулы 7 захвата размещают вдоль множества заданных линий 9, пробы-мишени 8, связанные с молекулами 7 захвата также размещаются вдоль множества заданных линий 9. В местоположении детектирования это приводит к когерентной аддитивной суперпозиции света, рассеянного рассеивающими центрами, образованными пробами-мишенями 8, связанными с молекулами 7 захвата, как пояснялось выше.
На Фиг. 6, Фиг. 7, Фиг. 8 и Фиг. 9 снова показано увеличенное изображение измерительной зоны 10. Однако, способ связывания молекул 7 захвата проб-мишеней 8, иммобилизированных на вдоль заданных линий 9, другой.
Как можно видеть на Фиг. 6, на первом этапе молекулы 7 захвата иммобилизованы в измерительной зоне 10 по всей (полной) внешней поверхности планарного волновода, таким образом, что молекулы захвата не были размещены вдоль множества заданных линий 9. Поэтому свет затухающего поля, рассеянный молекулами 7 захвата, не интерферирует в местоположении детектирования вышеописанным способом.
Как можно видеть на Фиг. 7, молекулы захвата, размещенные между заданными линиями 9, были дезактивированы, поэтому пробы-мишени более не могут связываться с такими дезактивированными молекулами 12 захвата. Соответственно, только молекулы 7 захвата, размещенные вдоль множества заданных линий 9, способны связывать пробы-мишени. Точность иммобилизации молекул 7 захвата вдоль заданных линий 9 зависит от способа прикрепления, иммобилизации или дезактивации молекул 7 захвата. В результате, местоположение иммобилизованных молекул 7 захвата, способных связывать пробы-мишени 8, не обязательно будет точно «на» заданных линиях 9, но может до некоторой степени отклоняться от точного местоположения «на» заданных линиях 9. На практике, отклонение от точного местоположения «на» заданных линиях может находиться в диапазоне менее четверти расстояния между соседними заданными линиями 9. Это еще достаточно для конструктивной интерференции света, рассеянного в местоположении детектирования.
Как пояснялось во вводной части, дезактивацию молекул 12 захвата, размещенных между заданными линиями 9, проводят таким образом, чтобы после дезактивации полный сигнал в местоположении детектирования (пробы-мишени 8 еще не добавлены), вызванный дезактивированными молекулами 12 захвата и молекулами 7 захвата, способными связывать пробы-мишени 8, устанавливают или настраивают на минимальный сигнал в местоположении детектирования, в идеале на ноль.
Следующим этапом является добавление проб-мишеней 8 в измерительную зону 10 на внешней поверхности планарного волновода, как показано на Фиг. 8. Так как только молекулы 7 захвата, размещенные вдоль заданных линиях 9, способны связывать пробы-мишени 8, пробы-мишени 8 связаны только с теми молекулами 7 захвата, которые находятся вдоль заданных линий 9, как показано на Фиг. 9. Из-за того что настроенный сигнал, вызванный дезактивированными молекулами 12 захвата и молекулами 7 захвата в местоположении детектирования, настроен на минимум путем установки или регулировки (см. выше), сигнал в местоположении детектирования в основном (или полностью, если сигнал, вызванный дезактивированными молекулами захвата и молекулами захвата предварительно был уменьшен до нуля) обусловлен светом, рассеянным пробами-мишенями 8, связанными с молекулами 7 захвата, размещенными вдоль заданных линий.
Фиг. 10 показывает часть вышеописанной измерительной зоны 10, иллюстрируя устройство незаполненной области, из которой необходимо удалить заданные линии 9 во избежание брэгговских отражений второго порядка в планарном волноводе. Следует избегать брэгговских отражений, так как они приводят к уменьшению интенсивности света, распространяющегося по планарному волноводу. Это является особенно неблагоприятным в случае, если множество измерительных зон 10 размещено одна за другой на внешней поверхности планарного волновода в направлении распространяющегося света. Таким образом, уменьшение интенсивности распространяющегося света, рассеянного в последующих измерительных зонах, обусловлено не только описанными процессами рассеяния в различных измерительных зонах, но и дополнительными потерями из-за брэгговских отражений в планарном волноводе. Поскольку в любой измерительной зоне расстояние между соседними заданными линиями 9 в круговом сечении измерительной зоны удовлетворяет условиям брэгговского отражения второго порядка, брэгговское отражение второго порядка в планарном волноводе определяет дополнительное местоположение 22, в котором конструктивно интерферирует брэгговский отраженный свет. В показанном примере, точки пересечения показанной дуги окружности 21 с заданными линиями 9 показывают те местоположения заданных линий 9, для которых точно выполняется условие Брэгга, поэтому свет отражается и конструктивно интерферирует в дополнительном местоположении 22. Этот отраженный свет не доступен для рассеивания в последующих размещенных измерительных зонах 10.
На Фиг. 11 показана измерительная зона 10, содержащая область 23 в непосредственной близости от дуги окружности 21, в котором заданные линии 9 удалены во избежание таких брэгговских отражений второго порядка.
На Фиг. 12 и Фиг. 13 показаны виды сверху и снизу дополнительного варианта осуществления изобретения устройства по изобретению. Этот вариант осуществления изобретения устройства содержит множество измерительных зон 10 основного размера и измерительных зон 17 различного размера. Каждая измерительная зона 10 содержит область 23, в которой во избежание брэгговских отражений (см. выше) удалены заданные линии 9. Как правило, также возможно, чтобы измерительные зоны не содержали областей 23. Предусмотрены оптическая решетка 4 для ввода света в планарный волновод и дополнительная решетка 13 для вывода света из планарного волновода. Между оптической решеткой 4 и дополнительной оптической решеткой 13 размещают множество измерительных зон 10 основного размера и измерительных зон 17 различного размера, где размещают сайты связывания вдоль заданных линий 9, как подробно обсуждалось выше. Наличие множества измерительных зон 10 основного размера и множества измерительных зон 17 различных размеров дает возможность одновременного детектирования различных сочетаний проб-мишеней и сайтов связывания, таким образом, во множестве сочетаний проб-мишеней и сайтов связывания можно одновременно определять аффинность связывания конкретных проб-мишеней с конкретными сайтами связывания. Или же для тех же сочетаний проб-мишеней и сайтов связывания могут проводиться дублирующие измерения.
Рассматривая вид снизу на Фиг. 13, можно видеть, что отверстие 21 предусмотрено для каждой измерительной зоны в местоположении детектирования, откуда рассеянный свет с разницей оптической длины пробега, являющейся целым кратным длине волны света, распространяется в волноводе до центра рассеивания на заданной линии и оттуда в заданное местоположение детектирование, что также подробно обсуждалось выше. Само собой разумеется, может быть предусмотрен модуль формирования изображения, как это подробно обсуждалось выше для Фиг. 2.
Измерительные зоны 17 различного размера размещают между измерительными зонами 10. Измерительные зоны 17 имеют известный размер, отличный от размера измерительной зоны 10, все размеры которой также известны. В соответствующем местоположении детектирования можно сравнивать свет, рассеянный в измерительных зонах 10 и в соответствующих измерительных зонах 17 (для конкретного типа пробы-мишени, связанного с конкретным типом сайтов связывания). Интенсивность рассеянного света в местоположении детектирования находится в квадратичной зависимости от числа центров рассеяния в измерительной зоне на планарной поверхности волновода. Если предположить однородность распределения и поверхностной плотности центров рассеяния в измерительных зонах различного размера, тогда интенсивности рассеянного света в соответствующих местоположениях детектирования соответствующих измерительных зон находятся в квадратичной зависимости от размера соответствующих измерительных зон. Соответственно, интенсивности рассеянного света в местоположениях измерительных зон различных размеров могут применяться для контроля того, что измеренные интенсивности действительно представляют собой свет, рассеянный центрами рассеяния, размещенными на заданных линиях.
Для улучшения детектирования аффинностей связывания на подложке 3 формируют два дополнительных отверстия 18 спереди и позади каждого отверстия 21, специально предназначенного для соответствующей измерительной зоны 10. Поскольку когерентный свет, распространяющийся через планарный волновод 2, может также некогерентно рассеиваться по мере его продвижения через планарный волновод 2, вклад этого некогерентно рассеянного света также детектируется в местоположении детектирования через отверстие 21. Отверстия 18 впереди и сзади отверстия 21 на заданном расстоянии позволяют определить, отвечающий этому некогерентно рассеянному свету, средний сигнал в местоположении детектирования, который можно применить для коррекции детектирования сигнала, вычитая средний сигнал некогерентного света из общего сигнала, детектированного в местоположении детектирования. Эта коррекция сигнала в местоположении детектирования является особенно полезной в комбинации с вышеупомянутым подавлением фонового сигнала, обусловленного рассеянием на сайтах связывания в отсутствии каких-либо присоединенных к ним молекул-мишеней.
На Фиг. 14-Фиг. 17 показана часть измерительной зоны, образованной на внешней поверхности 5 планарного волновода по изобретению. Показаны различные фазы процесса связывания проб-мишеней 8 с молекулами 7 захвата. В этом процессе связывание проб-мишеней 8 к молекулам 7 захвата усиливается. Молекулы 7 захвата иммобилизуются на внешней поверхности 5. После этого наносят пробы-мишени 8 и линкеры 24. Нанесенным пробам-мишеням 8 предоставляют возможность связываться с молекулами 7 захвата до момента достижения равновесия, когда процессы связывания проб-мишеней 8 с молекулами 7 захвата и высвобождения проб-мишеней 8 из молекул 7 захвата находятся в равновесии. Затем активируют линкер (например, светом), чтобы усилить связи между пробами-мишенями 8 и молекулами 7 захвата. После этого смывают не связавшиеся пробы-мишени 8, а также неиспользованные линкеры 24. Поскольку связи между пробами-мишенями 8 и молекулами 7 захвата были усилены линкерами 24, случайное вымывание проб-мишеней 8, связанных с молекулами 7 захвата, предотвращается или по меньшей мере сильно уменьшается. Таким образом, сигнал в местоположении детектирования может быть дополнительно усилен. Пример такого процесса с применением фотоактивированных линкеров подробно описан в "Capture Compound Mass Spectrometry: A Technology for the Investigation of Small Molecule Protein Interactions", ASSAY and Drug Development Technologies, Volume 5, Number 3, 2007.
На Фиг. 18 показан вид в разрезе устройства, схематично показанного на Фиг. 1, но в соответствии с дополнительным вариантом осуществления изобретения обладает слоистой структурой для применения, например, в высокоинтегрированных системах (то есть до примерно 4×106 измерительных зон на см2). В представленном примере, измерительная зона 10 имеет площадь размера около 25 мкм2. Этот размер позволяет размещать многочисленные измерительные зоны 10 на внешней поверхности 5 планарного волновода 2, с целью обеспечить проведение многочисленных измерений с применением одного устройства. Уменьшение размера измерительной зоны 10 достигается, например, виртуальным «вырезанием» упомянутой площади уменьшенного размера 25 мкм2 из более крупных измерительных зон. Однако, сохранение без изменения расстояния между заданными линиями в такой измерительной зоне 10 уменьшенного размера, привело бы к тому, что конус, образованный рассеянным светом на пробах-мишенях, связанных с сайтами связывания, имел бы значительно меньший апертурный угол по сравнению с более крупными измерительными зонами. Меньший апертурный угол конуса света привел бы к тому, что тот же блок оптического детектирования (сравнимый с представленным на Фиг. 2), примененный для измерения более крупных измерительных зон, и имеющий данный апертурный угол, измерит не только свет в местоположении детектирования, но и некоторое количество некогерентного фонового света. Это ухудшит отношение сигнал-шум (отношение S/N). Для того чтобы предотвратить это уменьшение отношения сигнал-шум, следует уменьшить расстояние между измерительной зоной 10 и местоположением детектирования, в идеале так, чтобы апертурный угол конуса, образованного светом, рассеянным пробами-мишенями, связанными с сайтами связывания в измерительной зоне 10 уменьшенного размера и интерферирующим в местоположения детектирования, совпадал бы с апертурным углом блока оптического детектирования. В целях уменьшения расстояния между измерительной зоной 10 уменьшенного размера и местоположением детектирования размещение множества заданных линий в измерительной зоне 10 уменьшенного размера должно подчиняться вышеописанной формуле, ссылка на Фиг. 3, так, чтобы свет, рассеянный пробами-мишенями связанными с сайтами связывания в новом местоположении детектирования, интерферировал. Поскольку расстояние между измерительной зоной 10 уменьшенного размера и новым местоположением детектирования может находиться только в пределах от десяти мкм (мкм) до нескольких сотен микрометров (мкм), толщина подложки 3 может стать непрактично тонкой. В особенности может оказаться неблагоприятным иметь дело с устройствами, содержащими подложки 3 с толщиной в диапазоне от 10 до нескольких сотен микрометров (мкм) в лабораторных условиях. Для облегчения эксплуатации такого устройства, устройство по данному варианту осуществления изобретения имеет следующую структуру слоев (от нижней стороны до верхней стороны): дополнительная несущая подложка 24, слой 111 из непрозрачного материала, подложка 3 и планарный волновод 2. Дополнительная подложка 24 в качестве носителя изготовлена из прозрачного материала (например, стекло, пластик) и имеет толщину, которая дает возможность эксплуатации устройства (например, до 3 мм). Слой 111 из непрозрачного материала формируют на верху дополнительной несущей подложки 24. Слой 111 из непрозрачного материала представляет собой, например, слой из черненого хрома, в котором отверстия 21, 18 изготавливают литографическим способом. Подложка 3 представляет собой прозрачный материал и обладает толщиной, соответствующей расстоянию между измерительной зоной 10 уменьшенного размера и местоположением детектирования. Планарный волновод 2 и измерительные зоны 10, как дополнительно было описано выше, являются принципиально похожими. Каждая измерительная зона 10 может содержать более чем одно множество заданных линий, как будет обсуждаться подробно ниже в связи с Фиг. 19.
Иллюстрация оптических путей на Фиг. 19 имеет сходство с иллюстрацией, приведенной на Фиг. 3. Однако в одной измерительной зоне размещают два различных множества заданных линий 9, 91, и в каждой такой зоне свет рассеивается в пространственно разделенные местоположения (фокусы) пробами-мишенями, привязанными к разным множествам заданных линий 9, 91. Свет затухающего поля 6, распространяющегося вдоль внешней поверхности 5, рассеивается на пробах-мишенях, связанных с сайтами связывания вдоль первого множества заданных линий 9 таким образом, что он интерферирует в правостороннем фокусе (жирные линии), а на пробах-мишенях, связанных с сайтами связывания вдоль второго множества заданных линий 91, таким образом, что он интерферирует в левостороннем фокусе (пунктирные линии). Этот принцип применим для любого множества заданных линий 9, 91 в отношении соответствующего местоположения детектирования, так что в пределах такой измерительной зоны могут быть размещены дополнительные множества заданных линий (например, три, как показано на Фиг. 20). Проба-мишень, способная к связыванию с сайтами связывания, размещенными на обоих заданных линиях 9, 91 (Фиг. 19), может образовывать кооперативные связи посредством взаимодействий многократных связей на пересечении линий 9, 91. Такое взаимодействие многократных связей является весьма сильным. Такие связи могут формироваться одновременно или последовательно в течение коротких промежутков времени (мгновенно). Такие взаимодействия многократных связей оптически детектируются в двух отдельных местоположениях детектирования, что обеспечивает в обоих местоположениях детектирования коррелированные сигналы.
На Фиг. 20 показан вид сверху устройства по Фиг. 18 с двенадцатью измерительными зонами 10, размещенными на внешней поверхности планарного волновода. В каждой измерительной зоне 10 предусмотрены три множества заданных линий, и пробы-мишени, связанные с сайтами связывания вдоль этих трех множеств заданных линий, рассеивают свет, вводимый в планарный волновод через оптическую развязку 4 на три пространственно разделенные индивидуальные местоположения детектирования. Размещение трех множеств дает выгоду, поскольку становятся детектируемыми каскады процессов. Такой каскад процессов осуществляется, например тогда, когда проба-мишень, размещаемая таким образом, чтобы обеспечить сигнал в первом местоположении детектирования, расщепляется на молекуле захвата на отдельные продукты по первому типу. Первый продукт этой реакции затем образует связь со вторым типом молекул захвата, обеспечивая сигнал во втором местоположении детектирования. Второй продукт реакции образует связь с третьим типом молекулы захвата, обеспечивая сигнал в третьем местоположении детектирования.
На Фиг. 21 показан вид снизу устройства по Фиг. 20. Снизу, через прозрачную дополнительную несущую подложку 24 можно видеть слой 111 из непрозрачного материала, размещенный наверху дополнительной несущей подложки 24. В слое 111 из непрозрачного материала формируют группы из девяти отверстий. Структурно, слой 111 из непрозрачного материала содержит несколько отверстий, имеющих форму, позволяющую маскировать любой свет за исключением рассеянного света, необходимого для измерения в соответствующем местоположении детектирования. Для оптимального подавления диффузного некогерентного фонового света в местоположении детектирования диаметр кругового отверстия выбирают так, чтобы он превышал диаметр d0 фокусного пятна, образованного рассеянным светом, интерферирующим в местоположении детектирования. В принципе размер задается формулой Аббе, применяемой для расчета теоретически возможного разрешения микроскопа:
d0=λ/2nssinα=λf/nsD
где
λ представляет собой длину волны когерентного света в вакууме, распространяющегося в планарном волноводе,
α представляет собой половину угла расходимости измерительной зоны,
ns представляет собой показатель преломления подложки 3,
f представляет собой фокусное расстояние измерительной зоны и
D представляет собой диаметр измерительной зоны.
Для измерения среднего фонового сигнала в непрозрачных слоях 111 формируют дополнительные отверстия до и после отверстия 21 (см. Фиг. 18). Форму отверстий можно выбрать так, чтобы она соответствовала форме фокусного пятна, образованного светом в местоположении детектирования, интерферирующим в местоположении детектирования. Может быть выгодно поставить продолговатое отверстие 21 (вытянутое в направлении распространения запредельного поля), чтобы избежать отсекание детектируемого света в местоположении детектирования краями отверстия, например, в случаях изменений местоположения фокусного пятна, вызванных изменением показателя преломления пробы, нанесенной на внешнюю поверхность планарного волновода, или вызванных небольшим изменением толщины планарного волновода.
В то время как варианты осуществления изобретения были описаны с помощью чертежей, возможны различные модификации и изменения описанных вариантов осуществления изобретения, не выходящие за рамки общей идеи, лежащей в основе изобретения. Поэтому не следует понимать, что изобретение ограничено описанными вариантами осуществления изобретения, напротив объем правовой охраны определяется формулой изобретения.
1. Устройство для применения при детектировании аффинностей связывания, причем устройство содержит планарный волновод (2), размещенный на подложке (3) и дополнительно содержащий оптическую развязку (4) для ввода когерентного света (1) заданной длины волны в планарный волновод (2) так, чтобы когерентный свет распространялся через планарный волновод (2), а затухающее поле (6) когерентного света распространялось вдоль внешней поверхности (5) планарного волновода (2), причем внешняя поверхность (5) планарного волновода (2) содержит на себе сайты (7) связывания, способные связывать пробы-мишени (8) с сайтами (7) связывания таким образом, чтобы свет затухающего поля (6) рассеивался пробами-мишенями (8), связанными с сайтами (7) связывания, причем сайты (7) связывания размещают вдоль множества заданных линий (9), причем заданные линии (9) размещены таким образом, чтобы свет, рассеиваемый пробами-мишенями (8), связанными с сайтами (7) связывания, интерферировал в заданном местоположении детектирования с разницей в оптическую длину пробега, являющейся целым кратным заданной длине волны света.
2. Устройство по п. 1, в котором расстояние между соседними заданными линиями (9) уменьшается в направлении распространения света затухающего поля.
3. Устройство по п. 1, в котором множество заданных линий (9) с размещенными на них сайтами (7) связывания содержит кривые линии, причем кривизна линий является такой, чтобы свет затухающего поля (6), рассеиваемый пробами-мишенями (8), связанными с сайтами (7) связывания, интерферировал в заданной точке детектирования в качестве местоположения детектирования.
4. Устройство по п. 1, в котором множество заданных линий (9) размещены на внешней поверхности (5) планарного волновода (2) таким образом, чтобы геометрия их местоположения определялась уравнением
где
λ представляет собой длину волны распространяющегося света в вакууме,
N представляет собой эффективный показатель преломления канализированной моды в планарном волноводе; N зависит от толщины и показателя преломления планарного волновода, показателя преломления подложки, показателя преломления среды на внешней поверхности планарного волновода и поляризации канализированной моды,
nS представляет собой показатель преломления подложки,
f представляет собой толщину подложки,
A0 представляет собой целое число, которое выбирают близким к произведению показателя преломления nS на толщину f подложки, деленному на длину волны λ, и
j представляет собой переменную, выраженную целым числом, показывающую индекс соответствующей линии.
5. Устройство по п. 1, в котором сайты связывания содержат молекулы (7) захвата, прикрепленные к поверхности планарного волновода (2) только вдоль заданных линий (9), причем молекулы захвата могут присоединять пробы-мишени (8).
6. Устройство по п. 1, в котором сайты связывания содержат молекулы (7) захвата, способные связывать пробы-мишени (8), причем молекулы (7) захвата способны связывать пробы-мишени (8), размещенные вдоль заданных линий (9) посредством распределения молекул (7) захвата, способных связывать пробы-мишени (8), на внешней поверхности (5) планарного волновода (2), и посредством дезактивации молекул (12) захвата, не размещенных вдоль заданных линий (9).
7. Устройство по п. 1, в котором планарный волновод (2) имеет показатель преломления (nw), существенно превышающий показатель преломления (nS) подложки (3) и также существенно превышающий показатель преломления (nmed) среды на внешней поверхности (5) планарного волновода (2) таким образом, чтобы для заданной длины волны света затухающее поле (6) имело глубину проникновения в диапазоне от 50 нм до 200 нм.
8. Устройство по п. 1, причем устройство содержит дополнительную оптическую развязку (13) для вывода света, распространяющегося через планарный волновод (2), причем как оптическая развязка (4) для вывода света в планарный волновод (2), так и дополнительная оптическая развязка (13) для вывода света, распространяющегося через планарный волновод (2), содержат оптические решетки (4, 13) для когерентного вывода света в планарный волновод (2) и из планарного волновода (2).
9. Устройство по п. 1, в котором планарный волновод (2) имеет первую концевую секцию (14) и вторую концевую секцию (15), расположенные на противоположных концах планарного волновода (2) по отношению к направлению распространения света, причем каждая из первой концевой секции (14) и второй концевой секции (15) содержат материал, поглощающий свет длины волны, распространяющейся через планарный волновод (2).
10. Устройство по п. 1, в котором множество измерительных зон (10, 17) размещено на внешней поверхности (5) планарного волновода (2), причем в каждой измерительной зоне (10) сайты (7) связывания размещены вдоль множества заданных линий (9).
11. Устройство по п. 10, в котором множество измерительных зон содержит измерительные зоны различных размеров (10, 17).
12. Устройство по п. 10, в котором каждая измерительная зона (10) имеет площадь, превышающую 25 мкм2, и при этом множество заданных линий (9) имеет расстояние между соседними заданными линиями (9) менее 1,5 мкм, в частности менее 1 мкм.
13. Устройство по п. 11, в котором каждая измерительная зона (10) имеет площадь, превышающую 25 мкм2, и при этом множество заданных линий (9) имеет расстояние между соседними заданными линиями (9) менее 1,5 мкм, в частности менее 1 мкм.
14. Устройство по п. 10, в котором сайты (7) связывания размещены вдоль по меньшей мере двух множеств заданных линий (9) в одной измерительной зоне (10), каждое из двух множеств заданных линий (9) размещено таким образом, чтобы свет, рассеянный пробами-мишенями (8), связанными с сайтами (7) связывания, размещенными вдоль соответствующих множеств заданных линий (9), интерферировал с разницей в длине оптического пути, являющейся целым кратным заданной длине волны света в индивидуальном местоположении детектирования для каждого множества заданных линий (9), при этом индивидуальные местоположения детектирования пространственно разделены друг от друга.
15. Устройство по п. 11, в котором сайты (7) связывания размещены вдоль по меньшей мере двух множеств заданных линий (9) в одной измерительной зоне (10), каждое из двух множеств заданных линий (9) размещено таким образом, чтобы свет, рассеянный пробами-мишенями (8), связанными с сайтами (7) связывания, размещенными вдоль соответствующих множеств заданных линий (9), интерферировал с разницей в длине оптического пути, являющейся целым кратным заданной длине волны света в индивидуальном местоположении детектирования для каждого множества заданных линий (9), при этом индивидуальные местоположения детектирования пространственно разделены друг от друга.
16. Устройство по п. 12, в котором сайты (7) связывания размещены вдоль по меньшей мере двух множеств заданных линий (9) в одной измерительной зоне (10), каждое из двух множеств заданных линий (9) размещено таким образом, чтобы свет, рассеянный пробами-мишенями (8), связанными с сайтами (7) связывания, размещенными вдоль соответствующих множеств заданных линий (9), интерферировал с разницей в длине оптического пути, являющейся целым кратным заданной длине волны света в индивидуальном местоположении детектирования для каждого множества заданных линий (9), при этом индивидуальные местоположения детектирования пространственно разделены друг от друга.
17. Устройство по п. 13, в котором сайты (7) связывания размещены вдоль по меньшей мере двух множеств заданных линий (9) в одной измерительной зоне (10), каждое из двух множеств заданных линий (9) размещено таким образом, чтобы свет, рассеянный пробами-мишенями (8), связанными с сайтами (7) связывания, размещенными вдоль соответствующих множеств заданных линий (9), интерферировал с разницей в длине оптического пути, являющейся целым кратным заданной длине волны света в индивидуальном местоположении детектирования для каждого множества заданных линий (9), при этом индивидуальные местоположения детектирования пространственно разделены друг от друга.
18. Устройство по п. 1, дополнительно содержащее диафрагму (11), имеющую отверстие (21), размещенное таким образом, чтобы позволять свету в местоположении детектирования проходить через отверстие (21), в то время как свет в местоположении, отличном от местоположения детектирования, блокируется диафрагмой (11).
19. Устройство по п. 18, в котором диафрагма (11) дополнительно содержит по меньшей мере одно дополнительное отверстие (18), размещенное смежно с отверстием (21), если смотреть в направлении распространения света через планарный волновод (2).
20. Система детектирования аффинностей связывания, содержащая устройство по любому из предшествующих пунктов и дополнительно содержащая источник света для излучения когерентного света (1) заданной длины волны, причем источник света и устройство размещены относительно друг друга таким образом, чтобы когерентный свет (1) вводился в планарный волновод (2) через оптическую развязку (4).
21. Система по п. 20, дополнительно содержащая модуль (19) формирования изображения, причем модуль (19) формирования изображения сфокусирован таким образом, чтобы формировать изображение местоположения детектирования устройства.
22. Система по п. 20, причем система дополнительно содержит фотодетектор (20) для измерения интенсивности света в местоположении детектирования.
23. Система по п. 21, причем система дополнительно содержит фотодетектор (20) для измерения интенсивности света в местоположении детектирования.
24. Способ детектирования аффинностей связывания, причем способ содержит этапы, на которых:
- обеспечивают устройство, содержащее планарный волновод (2), размещенный на подложке (3), и оптическую развязку (4),
- вводят когерентный свет (1) заданной длины волны в планарный волновод (2) таким образом, чтобы когерентный свет распространялся вдоль планарного волновода (2), а затухающее поле (6) когерентного света распространялось вдоль внешней поверхности (5) планарного волновода (2),
- прикрепляют пробы-мишени (8) к сайтам (7) связывания, размещенным вдоль множества заданных линий (9) на внешней поверхности (5) планарного волновода (2),
- детектируют в заданном местоположении детектирования свет затухающего поля, рассеянный пробами-мишенями (8), связанными с сайтами (7) связывания, размещенными вдоль заданных линий (9), а также свет, рассеянный пробами-мишенями (8), связанными с сайтами (7) связывания, имеющими в заданном местоположении детектирования разницу длины оптического пути, равную целому кратному от заданной длины волны света.
