Способ получения восстановленной формы коэнзима q10

Изобретение относится к области медицины и химико-фармацевтической промышленности, а именно к способу получения восстановленной формы коэнзима Q₁₀, включающему (i) восстановление окисленной формы коэнзима Q₁₀ путем приготовления насыщенного коэнзимом Q₁₀ этанольного раствора с растворенными коэнзимом Q₁₀ и аскорбиновой кислоты при их массовом соотношении 1:0,5-2 в присутствии нерастворенного расплавленного коэнзима Q₁₀ при температуре 50-70°С с добавлением катализатора – ионов Cu²⁺; (ii) ингибирование реакции путем добавления комплексообразующего с Cu²⁺ соединения; (iii) охлаждение смеси, осаждение и кристаллизация восстановленной формы коэнзима Q₁₀ в виде белого осадка; (iv) многократное промывание полученного осадка водой; (v) фильтрование в токе азота; (vi) высушивание. Изобретение обеспечивает получение восстановленного коэнзима Q₁₀ в виде стабильной при хранении химически чистой субстанции, пригодной для медицинского и других применений. 5 з.п. ф-лы, 6 пр.

 

Настоящее изобретение относится к способу получения восстановленного коэнзима Q₁₀. По сравнению с окисленной формой коэнзима Q₁₀, восстановленный коэнзим Q₁₀ показывает большую биодоступность и может быть использован в медицине, косметике и пищевых продуктах.

Кофермент Q₁₀, который также известен как убихинон, является жирорастворимым, витаминоподобным веществом, присутствует почти во всех тканях человека и вовлечен в клеточные процессы производства энергии в митохондриях, где он выступает в качестве донора электронов и переносчика протонов при клеточном дыхании и производстве АТФ (Quinzii С.М. et al. / Coenzyme Q and mitochondrial disease // Developmental disabilities research reviews. - 2010. - Vol. 16. - №2. - P. 183-188). В восстановленной форме (убихинол) коэнзим Q₁₀ выступает в качестве антиоксиданта как в митохондриях, так и в липидных мембранах либо путем непосредственного связывания свободных радикалов или в сочетании с токоферолом (Sohal R.S. et al / Coenzyme Q, oxidative stress and aging // Mitochondrion. - 2007. - Vol. 7: S103-S111). Из-за его важного биологического значения, коэнзим Q₁₀, широко используется в качестве добавки к пище людьми, заботящихся о своем здоровье, и людьми с заболеваниями, в том числе различными сердечными расстройствами (Villalba J.M. et al. / Therapeutic use of coenzyme Q10 and coenzyme Q10-related compounds and formulations // Expert opinion on investigational drugs. - 2010. - Vol. 19. - №4. - P. 535-554). Убихинол является наиболее распространенной формой кофермента Q₁₀ в естественных условиях и составляет более 80% от суммарного количества кофермента Q₁₀ находящегося в плазме, кишечнике и печени человека. Применение восстановленной формы коэнзима Q₁₀ более эффективно, чем использование его окисленной формы. Восстановленная форма коэнзима Q₁₀ обладает в 8 раз большей тканевой биодоступностью, чем окисленная (Hosoe K. et al. / Study on safety and bioavailability of ubiquinol (Kaneka QH™) after single and 4-week multiple oral administration to healthy volunteers // Regulatory Toxicology and Pharmacology. - 2007. - Vol. 47. - №1. - P. 19-28). При этом убихинол (восстановленный коэнзим Q₁₀) превосходит убихинон по биодоступности и скорости обнаружения в крови после орального применения. В силу этого применение меньших доз восстановленной формы Q₁₀ может существенно снизить расходование субстанции с сохранением эквивалентного биологического эффекта.

В качестве способа получения восстановленного коэнзима Q₁₀ применяют синтез, ферментацию, экстракцию из природных источников и тому подобное.

Из уровня техники известен способ получения восстановленной формы коэнзима Q₁₀ с использованием природных экстрактов, полученных различными способами экстрагирования из растительного материала. По сравнению с окисленной формой кофермента Q₁₀, восстановленный кофермент Q₁₀ показал высокую способность к пероральной абсорбции, а также к высокой тканевой биодоступности. В этом способе определенные компоненты, обладающие восстановительными свойствами, и содержащиеся в растительном сырье, предварительно выделенные из него, используются в качестве восстанавливающих компонентов для получения восстановленной формы кофермента Q₁₀. Восстанавливающие компоненты могут содержаться в природном растительном сырье, которое может быть наиболее предпочтительным с точки зрения содержания свободных и активных восстановителей, и представлять собой, например: экстракт ацеролы, экстракт чая, экстракт розмарина, экстракт сосновой коры и т.д. (Заявка на патент US 20120201802 А1, опубл. 09.08.2012).

Недостатком этого способа является использование для препаративного восстановления коэнзима Q₁₀ значительных количеств дорогостоящих гидрофобных растительных экстрактов и, как следствие трудности отделения от экстрактов полученного в конечной смеси восстановленного продукта.

Из уровня техники также известен способ извлечения биологических редуктаз, а также способ получения восстановленного кофермента Q₁₀ путем превращения окисленного кофермента Q₁₀ в восстановленный кофермент Q₁₀ при действии одной или нескольких извлеченных биологических редуктаз. Способ извлечения биологических редуктаз из культур бактерий, грибков и/или дрожжей, содержащих коэнзим Q₁₀, включает методы ультразвукового и химического разрушение клеток или мицелий из указанных бактерий, грибков и/или дрожжей для последующего использования выделенных редуктаз для восстановления коэнзима Q₁₀ (Заявка на патент WO 2011078648 А2, опубл. 20.06.2011).

Недостатком этого способа является высокая стоимость биотехнологического процесса и технологическая сложность отделения редуктаз от полученного продукта.

Известен препаративный способ получения убихинола, в котором реакция восстановления может протекать в присутствии органического растворителя, воды, жира, масла или смеси жир/масло, в том числе и при одновременном присутствии в органическом растворителе вместе с окисленной формой коэнзима Q₁₀ и гидрофобного экстракта солодки. При этом стабилизация восстановленного коэнзима Q₁₀ может быть обеспечена в присутствии гидрофобного экстракта солодки. Способ некаталитического восстановления коэнзима Q₁₀ аскорбиновой кислотой использует кипящий этанол (78°С). Реакция восстановления окисленной формы коэнзима Q₁₀ L-аскорбиновой кислотой протекает при 78°С в течение 30 часов, после чего реакционная смесь охлаждалась до 2°С со скоростью 10 град/ч до получения белого содержимого. После фильтрования полученной смеси кристаллы промывались охлажденной водой и охлажденным этанолом до 2°С, и высушивались в потоке азота (при 20-40°С) до сухих белые кристаллы (Заявка на патент US 20110123505 A1, опубл. 26.05.2011).

Недостатком этого способа является длительность протекания некаталитического восстановления Q₁₀ до 30 часов и, как следствие, возможность окисления конечного продукта в условиях высокой температуры и большого интервала времени. Недостатком также является усложнение технологического процесса, связанное с пожароопасностью и сложностью недопущения потерь кипящего растворителя, а также высокая энергозатратность процесса.

Известен способ восстановления окисленной формы коэнзима Q₁₀ с помощью аскорбиновой кислоты или ее аналогов в качестве восстановителя в водосодержащем органическом растворителе при рН среды не более 5,0, который может сократить период восстановления коэнзима Q₁₀ без дополнительного добавления основной субстанции и исключает протекание побочных реакций. Согласно указанному способу к водосодержащему этанолу (соотношение этанол : вода составляет 90:10) добавляют 10 г коэнзима Q₁₀ и 6 г аскорбиновой кислоты при 78°С для проведения реакции при рН, равном 3,5. Полученный через 13 часов этанольный раствор восстановленного коэнзима Q₁₀ охлаждают до 50°С и смешивают с водой и гексаном (массовое соотношение вода : гексан составляет 1:1). После разделения смеси на 2 слоя, удаления водной фазы и выпаривания растворителя, полученная масляная субстанция содержала 99,5% убихинола (Заявка на патент US 20100234643 A1, опубл. 16.09.2010).

Недостатками этого способа являются длительность протекания некаталитического восстановления Q₁₀ до 13 часов, усложнение технологического процесса, связанное с пожароопасностью и сложностью недопущения потерь кипящего растворителя, а также высокая энергозатратность процесса.

Из уровня техники известен способ продуцирования восстановленного кофермента Q₁₀, который предусматривает культивирование микроорганизмов, продуцирующих восстановленный кофермент Q₁₀, в культуральной среде, содержащей источник углерода, источник азота, источник фосфора и микроэлементы, с получением микробных клеток, содержащих восстановленный кофермент Q₁₀ в количестве не менее чем 70 мол. % от общего количества коферментов Q₁₀. Проводится разрушение указанных микробных клеток и экстракция продуцированного таким образом восстановленного кофермента Q₁₀ органическим растворителем. В способе микробные клетки подвергают разрушению различным путем: экстракции, физической обработки (с использованием гомогенизатора высокого давления, ультразвукового гомогенизатора, пресса Френча или шаровой мельницы), химической обработки (сильной кислотой, в кислотных или в слабоосновных условиях), ферментативной обработки, термообработки, автолиза, осмолизиса или плазмоптиза или термообработки. В качестве органического растворителя для экстракции восстановленного кофермента Q₁₀ используется по меньшей мере одно соединение, выбранное из углеводородов, эфиров жирных кислот, простых эфиров и нитрилов, гидрофильного органического растворителя, ацетона, ацетонитрила, метанола, этанола, 1-пропанола или 2-пропанола, гидрофобного органического растворителя, например, углеводородов, эфиров жирной кислоты или простых эфиров (Патент RU 2298035 С2, опубл. 27.04.2007).

Недостатком этого способа является высокая стоимость биотехнологического процесса, технологическая сложность обработки культуральной среды микроорганизмов и среды разрушенных клеток.

Известен также экстракционный способ извлечения смеси окисленной формы коэнзима Q₁₀ и его восстановленной формы из различных частей пальмы путем последовательной экстракции различными растворителями и последующей реакции с хлоридом железа (III) и очисткой на Сефадексе 4В (Заявка на патент WO 2011059311 А2, опубл. 19.05.2011).

Недостатком данного способа является использование значительного количества растворителей, получение как окисленной, так и восстановленной форм коэнзима Q₁₀, отсутствие данных, подтверждающих отсутствие в конечном продукте ионов железа, а также данных, подтверждающих стабильность восстановленного Q₁₀ при хранении.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения убихинола из окисленной формы коэнзима Q₁₀, основанный на каталитическом восстановлении Q₁₀ в присутствии пригодных для фармацевтического и пищевого применения восстановителя, растворителя и микроколичеств катализатора - меди Cu²⁺, включающий последовательные стадии: (i) предварительное растворение окисленной формы коэнзима Q₁₀ и аскорбиновой кислоты при мольном соотношении не менее 1:5 соответственно; (ii) добавление микроколичеств катализатора ионов Cu²⁺ и каталитическое восстановление коэнзима Q₁₀ с образованием его восстановленной формы (убихинола); (iii) добавление комплексообразующего с Cu²⁺ соединения при достижении количественного выхода целевого продукта; (iv) кристаллизация и выделение целевого продукта - восстановленной формы коэнзима Q₁₀ с последующим промыванием водой (Патент RU 2535928 С1, опубл. 20.12.2014), выбранный авторами за прототип.

Недостатками предложенного способа являются получение восстановленной формы коэнзима Q₁₀ в виде неочищенной суспензии в органическом растворителе, а также отсутствие в описании оптимальной технологии получения значимых количеств убихинола в форме безводной химически чистой субстанции, пригодной для парентерального введения.

Использование данного способа не позволяет получить стабильный при длительном хранении препарат, пригодный для использования в медицине.

Технический результат настоящего изобретения заключается в получении восстановленного коэнзима Q₁₀ в виде стабильной при хранении химически чистой субстанции, пригодной для медицинского и других применений.

Технический результат достигается способом получения восстановленной формы коэнзима Q₁₀, включающим (i) восстановление окисленной формы коэнзима Q₁₀ путем приготовления насыщенного коэнзимом Q₁₀ этанольного раствора с растворенными коэнзимом Q₁₀ и аскорбиновой кислоты при их массовом соотношении 1:0,5-2 в присутствии нерастворенного расплавленного коэнзима Q₁₀ при температуре 50-70°С (система «раствор - расплав») с добавлением катализатора - ионов Cu²⁺; (ii) ингибирование реакции путем добавления комплексообразующего с Cu²⁺; (iii) охлаждение смеси, осаждение и кристаллизация восстановленной формы коэнзима Q₁₀ в виде белого осадка; (iv) многократное промывание полученного осадка водой; (v) фильтрование в токе азота; (vi) высушивание.

Препаративное получение восстановленной формы коэнзима Q₁₀ проводят в условиях насыщения этанола растворенным коэнзимом Q₁₀ в присутствии нерастворенного расплавленного остатка Q₁₀ при температуре 50-70°С (раствор - расплав) при постоянном барботаже азотом, из расчета массового соотношения коэнзима Q₁₀ и аскорбиновой кислоты 1:0,5-2.

Используемый растворитель (этанол) может быть предварительно дегазирован в условиях вакуума.

Текущий контроль наличия аскорбиновой кислоты в полученном осадке в ходе промывания осуществляли по реакции с азотнокислым серебром, а наличие и содержание ионов меди контролировали спектрофотометрически по наличию и интенсивности характеристического для комплекса Cu²⁺ - динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) максимума поглощения 744 нм в УФ-спектре. Количественный контроль содержания аскорбиновой кислоты в субстанции осуществляли методом ВЭЖХ-анализа.

Сущность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами конкретного осуществления изобретения.

Пример 1.

В круглодонную колбу вместимостью 250 мл загружали 200 мл спирта этилового и 20 г смеси коэнзима Q₁₀ и аскорбиновой кислоты при их массовом соотношении 1:1, затем добавляли 0,2 г катализатора Cu²⁺ и проводили реакцию восстановления в течение 15 мин при температуре 60°С в присутствии расплавленного остатка коэнзима Q₁₀. По завершении реакцию останавливали добавлением 200 мкл раствора ЭДТА. После этого содержимое колбы медленно охлаждали при постоянной продувке азота до +20°…+25°С и при этой температуре выдерживали в закрытом виде до появления в растворе шлама белого цвета и полного заполнения им объема растворителя. Колбу в закрытом виде охлаждали в течение нескольких часов при температуре -20°…-22°С для достижения полного выпадения восстановленной формы в виде шлама. Промывание полученного шлама (белого осадка) осуществляли предварительно дегазированной, ионизированной и охлажденной до 0°С (фазовое состояние вода - лед) дистиллированной водой в токе азота. Промывание повторяли до полного избавления от катализатора, комплексона ЭДТА и излишков аскорбиновой кислоты. Полученный порошок белого цвета высушивали. Содержание восстановленного коэнзима Q₁₀ в полученном продукте составило не менее 95% (методом ВЭЖХ), температура плавления 48-50°С.

Пример 2.

Осуществляли в соответствии с примером 1, за исключением того, что массовое соотношение коэнзима Q₁₀ и аскорбиновой кислоты составляло 1:0,5.

Пример 3.

Осуществляли в соответствии с примером 1, за исключением того, что массовое соотношение коэнзима Q₁₀ и аскорбиновой кислоты составляло 1:2.

Пример 4.

Осуществляли в соответствии с примером 1, за исключением того, что реакцию восстановления проводили при температуре 50°С.

Пример 5.

Осуществляли в соответствии с примером 1, за исключением того, что реакцию восстановления проводили при температуре 70°С.

Пример 6. Определение стабильности при хранении полученных в примерах 1-5 субстанций.

Стабильность при хранении субстанций, полученных в примерах 1-5, оценивали по сохранению характеристик субстанций в течение длительного времени, таких как содержание восстановленного коэнзима Q₁₀ и температура плавления.

Установлено, что после 2-х и 3-х лет хранения субстанции, полученные в примерах 1-5, оставались химически чистыми (содержание восстановленного коэнзима Q₁₀ уменьшалось не более чем на 2%, температура плавления не изменялась или изменялась незначительно). На основе полученных данных можно сделать вывод о том, что в соответствии с заявленным способом может быть получен восстановленный коэнзим Q₁₀ в виде химически чистой субстанции, пригодной для медицинского и других применений, стабильной при хранении как минимум в течение 2,5-3 лет.

Лекарственные формы на основе восстановленного коэнзима Q₁₀, полученного в соответствии со способом, описанном в прототипе (Патент RU 2535928 С1, опубл. 20.12.2014), сохраняют стабильность при хранении в течение 2-х лет. Однако следует отметить, что для обеспечения указанной стабильности при хранении к восстановленному коэнзиму Q₁₀ дополнительно добавляют стабилизаторы, такие как аскорбиновая кислота или аскорбилпальмитат. Восстановленный коэнзим Q10, полученный в соответствии со способом, описанном в настоящем изобретении, стабилен в течение как минимум 2-3 лет без добавления дополнительных стабилизаторов.

1. Способ получения восстановленной формы коэнзима Q₁₀, включающий (i) восстановление окисленной формы коэнзима Q₁₀ путем приготовления насыщенного коэнзимом Q₁₀ этанольного раствора с растворенными коэнзимом Q₁₀ и аскорбиновой кислоты при их массовом соотношении 1:0,5-2 в присутствии нерастворенного расплавленного коэнзима Q₁₀ при температуре 50-70°C с добавлением катализатора - ионов Cu²⁺; (ii) ингибирование реакции путем добавления комплексообразующего с Cu²⁺ соединения; (iii) охлаждение смеси, осаждение и кристаллизация восстановленной формы коэнзима Q₁₀ в виде белого осадка; (iv) многократное промывание полученного осадка водой; (v) фильтрование в токе азота; (vi) высушивание.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стадию (i) проводят при постоянном барботаже азотом.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что массовое соотношение коэнзима Q₁₀ и аскорбиновой кислоты составляет 1:1.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что этанол предварительно дегазируют в условиях вакуума.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве комплексообразующего с Cu²⁺ соединения используют динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что промывание полученного осадка проводят предварительно дегазированной, деионизированной и охлажденной до 0°C дистиллированной водой.