Способ определения концентрации 146s-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Изобретение относится к области биотехнологии и производству противоящурных вакцин и предназначено для определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в сырье. Подготавливают калибровочную панель контрольных положительных образцов с концентрациями РНК вируса ящура. Выделяют РНК вируса ящура из сырья для вакцины. Элюаты добавляют к смеси компонентов для проведения ОТ-ПЦР-РВ. Проводят ОТ-ПЦР-РВ с последующей детекцией продуктов амплификации с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора. Определяют величину порогового цикла амплификации. Устанавливают зависимость между пороговым циклом амплификации и концентрацией 146S-компонента вируса ящура в сырье. Изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности определять концентрацию 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины на основе ОТ-ПЦР-РВ с последующим применением разработанной отрицательной регрессионной модели. 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл., 6 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и производству противоящурных вакцин, а именно к способу определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) и разработанной отрицательной регрессионной модели зависимости величины порогового цикла амплификации от концентрации 146S-частиц.

Ящур - высококонтагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, которое относится к категории трансграничных инфекций [2, 9]. Возбудитель принадлежит к порядку Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus [8]. Характерной особенностью вируса ящура является наличие 7 типов: О, А, С, Asia-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и множества топотипов с различными генетическими характеристиками [3]. При репродукции в биосистеме вирус ящура образует 3 варианта специфических компонентов: 146S-компонент («полные» частицы), состоящие из одной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждая из которых представляет собой комплекс белков VP1, VP2, VP3, VP4; 75S-частицы, лишенные РНК и включающие в себя 60 копий полипептида VP1-VP3-VP0; 12S-частицы, представленные белками VP1, VP2, VP3 [6].

Система мер для борьбы с ящуром и его профилактики предусматривает иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота, а также контроль уровня напряженности иммунитета [4, 10]. При промышленном производстве противоящурных вакцин большое значение имеет концентрация 146S-частиц, которые обладают всеми биологическими свойствами вируса ящура и являются основными компонентами, непосредственно влияющими на иммуногенность вакцины [2]. Исходя из этого, каждую партию сырья для производства противоящурной вакцины исследуют на определение концентрации 146S-компонента, применяя количественный вариант реакции связывания комплемента (РСК). Однако данный метод имеет ряд недостатков: трудоемкость и продолжительность проводимого анализа (не менее 3 суток), невозможность одновременного исследования большого количества проб, достаточно высокая себестоимость процедуры [1]. В связи с этим целесообразно провести поиск способа определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины на основе ОТ-ПЦР-РВ.

Задачей настоящего изобретения являлась разработка более чувствительного и специфичного экспресс-метода определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача была решена благодаря созданию нового способа определения концентрации 146S-компонента (C146S) вируса ящура в сырье для вакцины с применением метода ОТ-ПЦР-РВ, с помощью которого между значениями концентрации 146S-частиц и порогового цикла амплификации (Q) выявлена зависимость, отраженная в виде отрицательной линейной корреляции с высоким коэффициентом - 0,9959. Построенная отрицательная регрессионная модель вида C146S=-3,401(Ct)+99,333 позволяет оценивать концентрацию «полных» частиц вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины.

Сущность изобретения заключается в новом подходе по определению концентрации 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины с помощью метода ОТ-ПЦР-РВ и отрицательной регрессионной модели. Заявляемый способ основан на проведении ОТ-ПДР-РВ с учетом сигнала с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора. По итогам анализа оценивали интенсивность флуоресцентного сигнала, определяли значения порогового цикла амплификации. На основании выборки известных значений концентрации 146S-компонента вируса ящура разных типов и установленных показателей пороговых циклов амплификации разработали отрицательную регрессионную модель, позволяющую определять содержание 146S-компонента по результатам ОТ-ПЦР-РВ.

В настоящее время метод ОТ-ПЦР-РВ применяют исключительно для обнаружения вируса ящура в образцах афтозного патологического материала диких и домашних парнокопытных животных. Для оценки концентрации 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины используют РСК. По сравнению с РСК метод ОТ-ПЦР-РВ отличается высокой чувствительностью и специфичностью, является более экономичным, позволяет одновременно исследовать несколько десятков проб вируссодержащего материала для вакцины, а время проведения анализа сократить до 3-4 часов [5, 7, 11]. Исходя их этого, актуально применять данный метод и разработанную отрицательную регрессионную модель для определения концентрации 146S-частиц вируса ящура в сырье для вакцины. Ключевым элементом заявляемого способа является установление отрицательной линейной корреляционной зависимости между содержанием 146S-компонента разных типов вируса ящура в сырье для вакцины и пороговым циклом амплификации в виде регрессионной модели.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении метода ОТ-ПЦР-РВ и разработанной регрессионной модели для определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины.

Сведений о разработке предлагаемого способа определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины авторами не обнаружено.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - графике зависимости порогового цикла амплификации от концентрации 146S-компонента вируса ящура.

Подготавливают калибровочную панель контрольных положительных образцов с концентрациями РНК вируса ящура, эквивалентными концентрациям 146S-компонента: 0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 10,0, 20,0 мкг/мл. Выделяют РНК вируса ящура из вируссодержащего сырья для вакцины, а также из образцов отрицательного и положительных контролей. Элюаты РНК вируса ящура добавляют к смеси компонентов для проведения ОТ-ПЦР-РВ в соотношении 1:10. Проводят реакцию с последующей детекцией продуктов амплификации с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора, анализируют полученные данные для определения величины порогового цикла амплификации. Смесь для проведения ОТ-ПЦР-РВ включает в свой состав следующие компоненты: специфичные праймеры и TagMan флуоресцентномеченые зонды (каждый) - 10 пм, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP) - 10 мМ, MgCl2 - 5 мМ, Taq ДНК-полимераза - 1 ед., AMV-ревертаза - 2,5 ед.

ОТ-ПЦР-РВ проводят при следующих температурных и временных параметрах:

- обратная транскрипция: 42°С в течение 15-20 мин,

- предварительная денатурация: 94-95°С в течение 4-5 мин,

- полимеразная цепная реакция:

- денатурация: 94-95°С в течение 15-20 с,

- отжиг праймеров: 55-57°С в течение 15-20 с,

- элонгация: 60-65°С в течение 20 с.

Амплификацию проводят в течение 40-45 циклов.

Проводят постановку ОТ-ПЦР-РВ с определением величины порогового цикла амплификации, которая обратно пропорциональна концентрации РНК вируса ящура и, соответственно, 146S-компонента.

Устанавливают зависимость между пороговым циклом амплификации и концентрацией 146S-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины в процессе построения отрицательной регрессионной модели. Оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е), а также коэффициент детерминации (R2). На основе разработанной модели рассчитывают значение концентрации 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины.

Пример 1. Определение концентрации 146S-компонента вируса ящура топотипа «О/Саудовская Аравия/08» в сырье для моновалентной сорбированной вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ

Подготавливают калибровочную панель контрольных положительных образцов с концентрациями РНК вируса ящура, эквивалентными концентрациям 146S-компонента: 0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 10,0, 20,0 мкг/мл, а также отрицательный контроль, представляющий собой суспензию клеток линии ВНК-21/2-17, не инфицированную вирусом ящура. Стандартным методом выделяют РНК вируса ящура из вируссодержащего сырья для моновалентной сорбированной вакцины, образцов отрицательного и положительных контролей. Подготавливают смесь для проведения ОТ-ПЦР-РВ, которая включает в свой состав следующие компоненты: специфичные праймеры и TagMan флуоресцентномеченые зонды (каждый) - 10 пм, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP) - 10 мМ, MgCl2 - 5 мМ, Taq ДНК-полимераза - 1 ед., AMV-ревертаза - 2,5 ед. Элюаты РНК вируса ящура добавляют к смеси компонентов для проведения ОТ-ПЦР-РВ в соотношении 1:10. Общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл.

Постановку ОТ-ПЦР-РВ осуществляют на термоциклере BioRad CFX-96 при следующих температурных и временных режимах: обратная транскрипция: 42°С в течение 15-20 мин, предварительная денатурация: 94-95°С в течение 4-5 мин, полимеразная цепная реакция: денатурация: 94-95°С в течение 15-20 с, отжиг праймеров: 55-57°С в течение 15-20 с, элонгация: 60-65°С в течение 20 с. Амплификацию проводят в течение 40-45 циклов.

Полученные данные анализируют с помощью программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager, определяющего величину порогового цикла амплификации, которая обратно пропорциональна концентрации РНК вируса ящура топотипа «О/Саудовская Аравия/08» и, соответственно, 146S-компонента. Результаты эксперимента по представлению системы параллельной оценки величины порогового цикла амплификации (Ct) и концентрации 146S-компонента вируса ящура (C146S) в контрольных образцах отражены в таблице 1. Значения Ct для всех разведений 146S-компонента с концентрациями от 0,1 до 20,0 мкг/мл находятся в диапазоне от 29,2 до 23,1, соответственно. На основании полученных данных построена линейная регрессионная модель связи между фиксированным показателем Ct и зависимым параметром концентрации 146S-компонента: C146S=-3,401(Ct)+99,333 (график). Эффективность реакции амплификации (Е) составляет 96,70%. В отрицательном контроле геном вируса ящура не выявлен.

На графике видно, что между концентрацией 146S-компонента вируса ящура и пороговым циклом амплификации существует зависимость, которая отражена в виде отрицательной линейной корреляции. Фактический коэффициент детерминации (R2) стремится к 1 и составляет 0,9886, что подтверждает высокую достоверность полученных результатов. Параллельно исследуемые и контрольные пробы тестировали в РСК для определения концентрации 146S-компонента вируса ящура.

Как следует из таблицы 1 видно, что значение порогового цикла амплификации исследуемого сырья для производства моновалентной сорбированной вакцины против ящура топотипа «О/Саудовская Аравия/08» составило 28,64±0,04. Пользуясь разработанной регрессионной моделью, отраженной графиком C146S=-3,401 (Ct)+99,333 (график), значение концентрации 146S-компонента вируса ящура топотипа «О/Саудовская Аравия/08» составило 1,93 мкг/мл, что коррелирует с результатами РСК (1,90±0,05 мкг/мл). Отсюда следует, что разработанная модель с помощью результатов ОТ-ПЦР-РВ позволяет оценивать содержание 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины.

На следующем этапе работы по стандартной методике определяли и сравнивали иммуногенную активность моновалентной сорбированной вакцины против ящура «О/Саудовская Аравия/08» при разных способах определения 146S-компонента. Результаты исследования представлены в таблице 2, из которой следует, что при иммунизации крупного рогатого скота моновалентной сорбированной вакциной против ящура «О/Саудовская Аравия/08» с концентрацией 146S-компонента в сырье для вакцины 1,90±0,05 мкг/мл (по данным РСК) и 1,93 мкг/мл (по результатам ОТ-ПЦР-РВ) титр накопления специфических антител в организме животных составил 5,45±0,23 log2 и 5,55±0,10 log2, соответственно. Полученные средние значения титра антител коррелируют между собой, а также со значениями концентрации 146S-компонента, определенными в РСК и ОТ-ПЦР-РВ. Таким образом, разработанная регрессионная модель позволяет достоверно оценивать концентрацию 146S-компонента в сырье для моновалентной сорбированной вакцины против ящура топотипа «О/Саудовская Аравия/08».

Пример 2. Определение концентрации 146S-компонента вируса ящура топотипа «О/Саудовская Аравия/08» в сырье для моновалентной эмульгированной вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ

Подготовку и проведение анализа сырья для моновалентной эмульгированной вакцины против ящура в ОТ-ПЦР-РВ осуществляли так же, как указано в примере 1. Результаты исследования отражены в таблице 1, из которой видно, что значение порогового цикла амплификации исследуемого вируссодержащего сырья для производства моновалентной эмульгированной вакцины против ящура топотипа «О/Саудовская Аравия/08» составило 28,61±0,03. Пользуясь разработанной регрессионной моделью, отраженной графиком C146S=-3,401(Ct)+99,333, значение концентрации 146S-компонента вируса ящура типа «О/Саудовская Аравия/08» составило 2,03 мкг/мл, что коррелирует с результатами РСК (1,96±0,06 мкг/мл). Отсюда следует, что разработанная модель с помощью результатов ОТ-ПЦР-РВ позволяет оценивать содержание 146S-компонента вируса ящура топотипа «О/Саудовская Аравия/08» в сырье для вакцины.

Произведенную из полученного сырья вакцину стандартным методом оценивали на иммуногенность, проводя заражение крупного рогатого скота. Далее проводили сравнение иммуногенной активности моновалентной эмульгированной вакцины против ящура «О/Саудовская Аравия/08» при разных способах определения 146S-компонента. Результаты исследования представлены в таблице 3, из которой видно, что при иммунизации животных вакциной с концентрацией 146S-компонента 1,96±0,06 мкг/мл (по данным РСК) и 2,03 мкг/мл (по результатам ОТ-ПЦР-РВ) титр накопления специфических антител в организме животных составил 5,60±0,10 log2 и 5,85±0,13 log2, соответственно. Полученные средние значения титра антител коррелируют между собой, а также со значениями концентрации 146S-компонента, определенными в РСК и ОТ-ПЦР-РВ. Таким образом, разработанная регрессионная модель позволяет достоверно оценивать концентрацию 146S-компонента в сырье для моновалентной эмульгированной вакцины против ящура топотипа «О/Саудовская Аравия/08».

Пример 3. Определение концентрации 146S-компонента вируса ящура топотипа «АЛГурция/06» в сырье для моновалентной сорбированной вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ

Сырье для моновалентной сорбированной вакцины против ящура топотипа «А/Турция/06» исследовали методом ОТ-ПЦР-РВ так же, как описано в примере 1. Результаты анализа представлены в таблице 1, в которой указано, что значение порогового цикла амплификации исследуемого вируссодержащего сырья составило 28,59±0,02. Пользуясь разработанной регрессионной моделью, отраженной графиком функции C146S=-3,401(Ct)+99,333, значение концентрации 146S-компонента вируса ящура топотипа «А/Турция/06» составило 2,10 мкг/мл, что коррелирует с результатами РСК (1,97±0,06 мкг/мл). Следовательно, разработанная модель с помощью результатов ОТ-ПЦР-РВ дает возможность определять концентрацию 146S-компонента вируса ящура типа «А/Турция/06» в сырье для вакцины.

Моновалентную сорбированную вакцину против ящура топотипа «А/Турция/06» стандартным способом тестировали на иммуногенность в процессе заражения крупного рогатого скота. Определяли титр накопления специфичных антител и тем самым сравнивали иммуногенную активность вакцины при разных способах оценки содержания 146S-компонента. Результаты исследования продемонстрированы в таблице 4, из которой следует, что при иммунизации животных вакциной с концентрацией 146S-компонента 1,97±0,06 мкг/мл (по данным РСК) и 2,10 мкг/мл (по результатам ОТ-ПЦР-РВ) титр накопления антител составил 5,65±0,17 log2 и 6,10±0,10 log2, соответственно. Полученные средние значения титра близки друг к другу, а также коррелируют со значениями концентрации 146S-компонента, определенными в РСК и ОТ-ПЦР-РВ. Следовательно, разработанная регрессионная модель позволяет достоверно оценивать содержание 146S-компонента в сырье для моновалентной сорбированной вакцины против ящура топотипа «А/Турция/06».

Пример 4. Определение концентрации 146S-компонента вируса ящура топотипа «А/Турция/06» в сырье для моновалентной эмульгированной вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ

Постановку ОТ-ПЦР-РВ для анализа сырья для моновалентной эмульгированной вакцины против ящура топотипа «А/Турция/06» проводили, как указано в примере 1. Результаты исследования отражены в таблице 1, которая показывает, что значение порогового цикла амплификации исследуемого вируссодержащего сырья для производства моновалентной эмульгированной вакцины против ящура топотипа «А/Турция/06» составило 28,56±0,02. Пользуясь разработанной регрессионной моделью, отраженной графиком C146S=-3,401(Ct)+99,333, значение концентрации 146S-компонента вируса ящура топотипа «А/Турция/06» составило 2,20 мкг/мл, что коррелирует с результатами РСК (2,07±0,08 мкг/мл). Отсюда следует, что разработанная модель с помощью результатов ОТ-ПЦР-РВ позволяет определять концентрацию 146S-компонента вируса ящура топотипа «А/Турция/06» в сырье для вакцины.

На следующем этапе работы по стандартной методике определяли и сравнивали иммуногенную активность моновалентной эмульгированной вакцины против ящура топотипа «А/Турция/06» при разных способах определения концентрации 146S-компонента. Результаты анализа отражены в таблице 5, из которой следует, что при иммунизации крупного рогатого скота данной вакциной с концентрацией 146S-компонента в сырье 2,07±0,08 мкг/мл (по данным РСК) и 2,20 мкг/мл (по результатам ОТ-ПЦР-РВ) титр накопления специфических антител в организме животных составил 6,00±0,11 log2 и 6,35±0,10 log2, соответственно. Средние значения титра накопления антител близки друг к другу и значениям концентрации 146S-компонента, определенным в РСК и ОТ-ПЦР-РВ. Иными словами, разработанная регрессионная модель позволяет достоверно оценивать концентрацию 146S-компонента в сырье для моновалентной эмульгированной вакцины против ящура топотипа «А/Турция/06».

Пример 5. Определение концентрации 146S-компонента вируса ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89» в сырье для моновалентной сорбированной вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ

Сырье для моновалентной сорбированной вакцины против ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89» анализировали методом ОТ-ПЦР-РВ, как описано в примере 1. Результаты исследования представлены в таблице 1, в которой указано, что значение порогового цикла амплификации исследуемого вируссодержащего сырья составило 28,60±0,02. Применяя разработанную регрессионную модель, отраженную графиком функции Q46S=-3,401(Ct)+99,333, рассчитывали значение концентрации 146S-компонента вируса ящура типа «Asia-1/Shamir/3/89», которое составило 2,06 мкг/мл, что коррелирует с результатами РСК (1,92±0,09 мкг/мл). Таким образом, разработанная регрессионная модель с помощью результатов ОТ-ПЦР-РВ позволяет оценивать содержание 146S-компонента вируса ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89» в сырье для вакцины.

Произведенную из полученного сырья вакцину стандартным методом исследовали на иммуногенность, проводя заражение крупного рогатого скота. Далее проводили сравнение иммуногенной активности моновалентной сорбированной вакцины против ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89» при разных способах определения концентрации 146S-компонента. Результаты сравнительного анализа представлены в таблице 6, из которой видно, что при иммунизации животных вакциной с концентрацией 146S-компонента 1,92±0,09 мкг/мл (по данным РСК) и 2,06 мкг/мл (по результатам ОТ-ПЦР-РВ) титр накопления специфических антител в организме иммунизированных животных составил 5,50±0,18 log2 и 6,00±0,25 log2, соответственно. Полученные средние значения титра антител коррелируют между собой, а также со значениями концентрации 146S-частиц, определенными в РСК и ОТ-ПЦР-РВ. Следовательно, разработанная регрессионная модель позволяет достоверно определять концентрацию 146S-компонента в сырье для моновалентной сорбированной вакцины против ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89».

Пример 6. Определение концентрации 146S-компонента вируса ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89» в сырье для моновалентной эмульгированной вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ

Исследование сырья для моновалентной эмульгированной вакцины против ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89» в ОТ-ПЦР-РВ проводили, как указано в примере 1. Результаты исследования отражены в таблице 1, из которой видно, что значение порогового цикла амплификации анализируемого вируссодержащего сырья для производства моновалентной эмульгированной вакцины против ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89» составило 28,54±0,03. Пользуясь разработанной регрессионной моделью, отраженной графиком C146S=-3,401(Ct)+99,333, значение концентрации 146S-компонента вируса ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89» составило 2,27 мкг/мл, что коррелирует с результатами РСК (2,00±0,11 мкг/мл). Таким образом, что разработанная модель с помощью результатов ОТ-ПЦР-РВ дает возможность определять концентрацию 146S-компонента вируса ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89» в сырье для вакцины.

На следующем этапе работы стандартным методом определяли и сравнивали иммуногенную активность моновалентной эмульгированной вакцины против ящура «Asia-1/Shamir/3/89» при разных способах определения содержания 146S-компонента. Результаты анализа представлены в таблице 7, из которой видно, что при иммунизации крупного рогатого скота данной вакциной с концентрацией 146S-компонента в сырье 2,00±0,11 мкг/мл (по данным РСК) и 2,27 мкг/мл (по результатам ОТ-ПЦР-РВ) титр накопления специфических антител в организме животных составил 6,00±0,22 log2 и 6,25±0,22 log2, соответственно. Средние значения титра коррелируют между собой и значениям концентрации 146S-компонента, определенным в РСК и ОТ-ПЦР-РВ. Иными словами, разработанная регрессионная модель позволяет достоверно оценивать концентрацию 146S-компонента в сырье для моновалентной эмульгированной вакцины против ящура топотипа «Asia-1/Shamir/3/89».

Основным преимуществом предлагаемого изобретения является возможность одновременного исследования большого количества проб для определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины в течение 3-4 часов. В предлагаемом изобретении между концентрацией 146S-частиц и пороговым циклом амплификации установлена зависимость, отраженная в виде отрицательной линейной корреляции с высоким коэффициентом - 0,9959. Разработанная математическая регрессионная модель вида C146S=-3,401(Ct)+99,333 позволяет оценивать концентрацию 146-компонента вируса ящура разных топотипов в сырье для производства вакцины.

Предлагаемое изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности определять концентрацию 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины на основе ОТ-ПЦР-РВ с последующим применением разработанной регрессионной модели.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в режиме реального времени»:

1. Бондаренко А.Ф. Качественный и количественный иммунохимический анализ вирусных белков. - Суздаль, 1994. - 92 с.

2. Пономарев А.П., Узюмов В.Л., Груздев К.Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

3. Alexandersen, S., Zhang, Z., Donaldson, A.L. and Garland, A.J.M. (2003) The pathogenesis and diagnosis of foot and mouth disease. J. Compr. Pathol., V. 129. - p. 268-282.

4. Annual OIE/FAO FMD Reference Laboratory Network Report / N. Ferris, N. Knowles [et al.]. - Pirbright, 2007. - URL: http://www. wrlfmd.org/ref_labs/fmd_ref_lab_reporst.htm

5. Enhanced laboratory diagnosis of foot-and-mouth disease by real-time polymerase chain reaction / A.E. Shaw, S.M. Reid, D.P. King [et al.] // Rev. Sci. Techn. OIE. - 2004. - Vol. 23, №3. - P. 1003-1009.

6. Gartwright, В., Brown, F. and Chapman, W.G. (1980) Serological and immunological relationships between the 146S and 12S particles of foot-and-mouth disease virus. Journal of General Virology. - V. 50. - p. 369-375.

7. Implementation of a one-step real-time RT-PCR protocol for diagnosis of foot-and-mouth disease / A. Shaw, S. M. Reid, K. Ebert [et al.] // J. Virol. Methods. - 2007. - Vol. 143, N 1. - C. 81-85.

8. Lubroth, J., Rodri'guez, L. and Dekker, A. (2006) Vesicular diseases. In: Straw, B.E., Zimmerman, J.J., D'Allaire, S. and Taylor, D.J., editors. Diseases of Swine. 9th ed. Blackwell Publishing Professional, Ames, Iowa, USA. p. 517-536.

9. OIE. (2008) Foot and mouth disease. In: Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 6th ed., Ch. 2/1/5/ World Organisation for Animal Health (OIE), Paris, France.

10. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - 7th ed. - Paris, 2012. - Vol. 1, Chap. 2.1.5. - p. 166-169.

11. Rapid detection of foot-and-mouth disease virus, influenza A virus and classical swine fever virus by high-speed real-time RT-PCR / K. Wernike, M. Beer, B. Hoffmann // Journal of Virological Methods. - 2013. - Vol. 193, №l. - P. 50-54.

1. Способ определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в сырье для производства вакцины с помощью обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ), включающий следующие стадии:

- подготавливают калибровочную панель контрольных положительных образцов с концентрациями РНК вируса ящура, эквивалентными концентрациям 146S-компонента: 0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 10,0, 20,0 мкг/мл;

- выделяют РНК вируса ящура из сырья для вакцины, образцов отрицательного и положительных контролей;

- элюаты РНК вируса ящура добавляют к смеси компонентов для проведения ОТ-ПЦР-РВ в соотношении 1:10;

- проводят ОТ-ПЦР-РВ с последующей детекцией продуктов амплификации с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора, анализируют полученные данные для определения величины порогового цикла амплификации;

- определяют величину порогового цикла амплификации, обратно пропорциональную концентрации РНК вируса ящура и, соответственно, 146S-компонента;

- устанавливают зависимость между пороговым циклом амплификации и концентрацией 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины в процессе построения отрицательной регрессионной модели;

- оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е), а также коэффициент детерминации (R2);

- рассчитывают значение концентрации 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины на основе разработанной регрессионной модели.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на основании установленной в ОТ-ПЦР-РВ величины порогового цикла амплификации (Ct) рассчитывают значение концентрации 146S-компонента (C146S) вируса ящура разных типов с применением разработанной регрессионной модели:

C146S=-3,401(Ct)+99,333.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что смесь компонентов для проведения ОТ-ПЦР-РВ включает в свой состав следующие компоненты: специфичные праймеры и TagMan флуоресцентномеченые зонды (каждый) - 10 пм, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP) - 10 мМ, MgCl2 - 5 мМ, Taq ДНК-полимераза - 1 ед., AMV-ревертаза - 2,5 ед.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ОТ-ПЦР-РВ проводят с соблюдением следующих режимов:

- обратная транскрипция: 42°C в течение 15-20 мин,

- предварительная денатурация: 94-95°C в течение 4-5 мин,

- полимеразная цепная реакция:

- денатурация: 94-95°C в течение 15-20 с,

- отжиг праймеров: 55-57°C в течение 15-20 с,

- элонгация: 60-65°C в течение 20 с.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины и предназначено для определения риска развития артериальной гипертензии. Осуществляют забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени и определение инсерции/делеции (I- и D-аллели) Alu-фрагмента гена ангиотензинпревращающего фермента.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики острого лимфобластного лейкоза у пациента, включающий выявление признаков лейкоза, тестирование клеток крови на лейкоз, инкубирование клеток крови фактором, идуцирующим лейкоз, с тем, чтобы индуцировать экспрессию клеточных поверхностных маркеров, которые являются признаком лейкоза, где фактор, индуцирующий лейкоз - это супернатант Aspergillus flavus, EBV-инфицированный CCL87 супернатант, очищенная EBV культура или их комбинации.

Изобретение относится к биологи и медицине, а именно к иммуноанализу, в частности к электрохимическим способам определения содержания вирусов/антигенов вирусов кори.

Изобретение относится к медицине и описывает способ идентификации модуляторов активности фермента катехол-O-метилтрансферазы (СОМТ), включающий а) получение 4-нитрокатехола, ковалентно связанного с Alexa Fluor® 488, б) приведение в контакт молекулы из этапа а) с ферментом катехол-O-метилтрансферазой (COMT), S-аденозилметионином (SAM) и соединением-кандидатом и в) измерение показателей флуоресценции смеси из этапа б), в котором измененные показатели флуоресценции в присутствии соединения-кандидата по сравнению с контролем являются признаком наличия модулятора фермента катехол-O-метилтрансферазы (COMT).

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины и предназначено для обнаружения модифицированных нуклеотидов в составе РНК. Осуществляют подбор подходящей для исследуемой области РНК пары олигонуклеотидных зондов, подбор пары донора и тушителя флуоресценции с подходящими оптическими свойствами.

Изобретение относится к способам определения эффективности лиганда ионного канала. Ex vivo способ определения эффективности лиганда ионного канала in vivo в зависимости от присутствия плазмы, включает стадии: a) приведение клетки, экспрессирующей ионный канал, в контакт с i) плазмой животного и ii) лигандом ионного канала и b) определение эффекта лиганда ионного канала на клетку, или a) приведение клетки, экспрессирующей ионный канал, в контакт с i) плазмой животного и ii) соединением, которое определяют как лиганд ионного канала, и b) определение эффекта соединения на клетку, или a) приведение клетки, экспрессирующей ионный канал, в контакт с плазмой животного, которому был введен лиганд ионного канала, и b) определение эффекта лиганда ионного канала на клетку.

Изобретение относится к способу маркировки парных спиральных филаментов (PHF), включающему взаимодействие PHF с соединением и детектирование присутствия указанного соединения, где соединение имеет формулу , в которой -R- означает , -Q- выбран из: -NHC(O)-, -N=N-, -CH=CH-; -P выбран из: ; -T выбран из: ; X представляет собой N или CH; -W1-6, -G1-4, -Р1-5 являются такими, как указано в формуле изобретения.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицинской диагностики. Предложен способ детекции белков в амилоидном состоянии, в котором получают образец лизата культуры дрожжей или ткани млекопитающего, добавляют к образцу ионный детергент, концентрируют белки в амилоидной форме на ацетатцеллюлозной мембране и детектируют их с использованием аптамеров, их конъюгатов или антител, специфичных к амилоидной форме белков.

Изобретение относится к визуализирующим агентам, подходящим для оптической визуализации in vivo организма млекопитающего. .

Изобретение относится к области медицины и предназначено для оценки индивидуального риска формирования избыточной массы тела и ожирения у детей, потребляющих питьевую воду с повышенным содержанием хлороформа и тетрахлорметана.

Изобретение относится к области медицины и касается способа прогнозирования риска развития хронической ртутной интоксикации. Сущность способа заключается в том, что выделяют ДНК из периферической венозной крови, проводят полимеразную цепную реакцию и рестрикцию продуктов амплификации для анализа полиморфного локуса 1267A/G гена HSPA1B, принадлежащего к семейству генов белков теплового шока 70.

Изобретение относится к области ветеринарии. Предложен способ профилактики нодулярного дерматита крупного рогатого скота (КРС), включающий выявление животных с инфекционным заболеванием на начальной стадии развития, убой больных и дальнейшее обследование остальных животных.
Группа изобретений относится к области медицины и представляет собой способ определения устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину и изониазиду в биологическом образце, отличающийся тем, что способ включает одновременную детекцию мутаций в ДНК микобактерий биологического образца в участках гена rpoB, гена katG и промоторной области гена inhA, где указанные участки выбраны из группы, включающей кодоны 430, 445, 450 и 452 гена rpoB, кодон 315 гена katG, -15 или -17 позицию промоторной области гена inhA или их комбинации, посредством мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием зондов детекции, которые комплементарны указанным участкам генов, не содержащим мутацию.

Настоящее изобретение относится к медицине. Предложен способ диагностики локального иммунного статуса пародонта.

Изобретение относится к клинико-лабораторной диагностики. В частности, к определению степени устойчивости пародонта к инфекции патогенными бактериями Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia и Tannerella forsythensis за счет наличия бактерии-пародонтопротектора Veillonella parvula.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу определения наличия абберации в хромосомной ДНК, и может быть использовано в медицине. Настоящее изобретение позволяет исключить использование формамида или уменьшить зависимость от формамида при гибридизации двунитевых нуклеиновых последовательностей.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен нагревательный блок, чип и устройство для полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу идентификации растения, включающего последовательность ДНК, вносящую вклад в устойчивость к заболеванию килой крестоцветных у Brassica napus.

Изобретение относится к биохимии. Заявлен способ повышения экспрессии полинуклеотида PTEN в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий контактирование указанных клеток или тканей с по меньшей мере одним антисмысловым олигонуклеотидом длиной от 10-30 нуклеотида, мишенью которого является природный антисмысловой полинуклеотид PTEN, выбранный из SEQ ID NOs: 14 и 15; посредством чего осуществляется повышение экспрессии полинуклеотида PTEN в клетках или тканях пациента in vivo.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к методам поиска антибактериальных веществ природного и синтетического происхождения с одновременным анализом механизма их действия, и может быть использовано для идентификации соединений, ингибирующих биосинтез белка и/или вызывающих SOS-ответ у бактерий. Генетическая конструкция содержит гены двух флюоресцентных белков с различимыми спектрами флюоресценции. Экспрессия одного из генов флюоресцентных белков активируется при остановке трансляции предшествующего ему генетически модифицированного аттенюатора триптофанового оперона Escherichia coli. Экспрессия второго гена активируется при дерепрессии предшествующего ему промотора гена sulA Escherichia coli. Генетическая конструкция представляет собой плазмиду, которой трансформируют клетки бактерий Е. coli для получения штамма-репортера Е. coli ΔtolC. Полученный штамм Е. coli ΔtolC позволяет проводить высокопроизводительный анализ (скрининг) большого количества веществ или смесей для поиска среди них антибактериальных веществ, с одновременным выявлением тех из них, которые ингибируют биосинтез белка и/или вызывают SOS-ответ на повреждения ДНК. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и производству противоящурных вакцин и предназначено для определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в сырье. Подготавливают калибровочную панель контрольных положительных образцов с концентрациями РНК вируса ящура. Выделяют РНК вируса ящура из сырья для вакцины. Элюаты добавляют к смеси компонентов для проведения ОТ-ПЦР-РВ. Проводят ОТ-ПЦР-РВ с последующей детекцией продуктов амплификации с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора. Определяют величину порогового цикла амплификации. Устанавливают зависимость между пороговым циклом амплификации и концентрацией 146S-компонента вируса ящура в сырье. Изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности определять концентрацию 146S-компонента вируса ящура в сырье для вакцины на основе ОТ-ПЦР-РВ с последующим применением разработанной отрицательной регрессионной модели. 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл., 6 пр.

Наверх