Набор реагентов для выявления днк chlamydia trachomatis и его применение



Набор реагентов для выявления днк chlamydia trachomatis и его применение
Набор реагентов для выявления днк chlamydia trachomatis и его применение
Набор реагентов для выявления днк chlamydia trachomatis и его применение
Набор реагентов для выявления днк chlamydia trachomatis и его применение
Набор реагентов для выявления днк chlamydia trachomatis и его применение
Набор реагентов для выявления днк chlamydia trachomatis и его применение
Набор реагентов для выявления днк chlamydia trachomatis и его применение
Набор реагентов для выявления днк chlamydia trachomatis и его применение
Набор реагентов для выявления днк chlamydia trachomatis и его применение
Набор реагентов для выявления днк chlamydia trachomatis и его применение
Набор реагентов для выявления днк chlamydia trachomatis и его применение

 


Владельцы патента RU 2621863:

ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ИНТЕРЛАБСЕРВИС" (RU)

Настоящая группа изобретений относится к медицине. Предложен набор реагентов для выявления Chlamydia trachomatis в образце, включающий два олигонуклеотидных праймера для полимеразной цепной реакции (ПЦР), и применение указанного набора для выявления ДНК Chlamydia trachomatis в образце. Предложенный набор включает первый олигонуклеотидный праймер с последовательностью SEQ ID NO:2, и второй олигонуклеотидный праймер с последовательностью SEQ ID NO:3, а также, при необходимости, включает олигонуклеотидный зонд, термостабильную ДНК-полимеразу, буферный раствор для ПЦР, дезоксинуклеозидтрифосфаты. Набор позволяет эффективно выявлять клинически значимые штаммы/генотипы/серовары урогенитального биовара Chlamydia trachomatis с помощью единственной мишени ПЦР при использовании двух олигонуклеотидных праймеров, позволяющих получить продукт амплификации, который имеет размер, входящий в диапазон 70-110 пар нуклеотидов, и обеспечивающих амплификацию фрагмента ДНК Chlamydia trachomatis, лежащего внутри участка критической плазмиды Chlamydia trachomatis с последовательностью SEQ ID NO:1. Группа изобретений может быть использована в лабораторной диагностике Chlamydia trachomatis. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 табл., 2 пр.

 

Область техники

Группа изобретений относится к медицине, более конкретно к лабораторной диагностике и может быть использована для выявления ДНК Chlamydia trachomatis в биологических образцах.

Уровень техники

Chlamydia trachomatis - облигатный внутриклеточный бактериальный патоген человека. Инфекция Chlamydia trachomatis (хламидиоз) является самой распространенной бактериальной инфекцией, передаваемой половым путем, инфицируя ежегодно свыше 90 миллионов человек [Lanjouw Ε. et al. European guideline for the management of Chlamydia trachomatis infections, 2010].

В настоящее время в пределах вида Chlamydia trachomatis выделяют 3 биовара и множество сероваров и генотипов: биовар трахома (серовары А-С), урогенитальный биовар (серовары D-K) и биовар венерическая лимфогранулема (ЛГВ, серовары L1-L3) [Lanjouw Ε. et al. European guideline for the management of Chlamydia trachomatis infections, 2010]. Представители урогенитального биовара Chlamydia trachomatis могут являться причиной воспалительных заболеваний урогенитального тракта у мужчин и женщин, таких как уретриты, цервициты, эпидидимиты. Однако до 90% случаев урогенитального хламидиоза у женщин и более 50% случаев урогенитального хламидиоза у мужчин имеют бессимптомное течение [Lanjouw Ε. et al. European guideline for the management of Chlamydia trachomatis infections, 2010]. Инфекции, протекающие бессимптомно, часто остаются не диагностированными и, следовательно, пациентам не назначается адекватная терапия в течение длительного периода времени. В отсутствие лечения хламидийная инфекция приводит к таким серьезным последствиям, как воспалительные заболевания органов малого таза у женщин, патология беременности, мужское и женское бесплодие, пневмония и конъюнктивит у новорожденных [Lanjouw Ε. et al. European guideline for the management of Chlamydia trachomatis infections, 2010; Jaton K. et al. A novel real-time PCR to detect Chlamydia trachomatis in first-void urine or genital swabs. J Med Microbiol. 2006 Dec; 55(Pt 12): 1667-1674].

В связи с затрудненной клинической диагностикой трудно переоценить важность надежной и эффективной лабораторной диагностики хламидийной инфекции.

Традиционные методы лабораторной диагностики бактериальных инфекций - бактериоскопический (микроскопический), бактериологический (культуральный) и иммунологический (серологический) - в настоящее время утратили свое доминирующее положение для диагностики Chlamydia trachomatis в развитых странах. Европейское руководство 2010 года по ведению больных с инфекциями, вызванными Chlamydia trachomatis, признает основными методами диагностики современные молекулярно-биологические методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) [Lanjouw Ε. et al. European guideline for the management of Chlamydia trachomatis infections, 2010]. Наибольшее распространение среди МАНК получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Существует большое количество «in house» («домашних») и серийно выпускаемых (коммерческих) наборов реагентов (тест-систем) для выявления ДНК Chlamydia trachomatis методом полимеразной цепной реакции. Наборы различаются генами-мишенями для ПЦР, способами детекции продуктов амплификации, размерами продуктов амплификации, количеством одновременно выявляемых патогенов - от одного до семи [Gimenes F. et al. Sensitive simultaneous detection of seven sexually transmitted agents in semen by multiplex-PCR and of HPV by single PCR. PLoS One. 2014 Jun 12; 9(6): e98862. doi: 10.1371/journal.pone.0098862. eCollection 2014].

Известен набор реагентов для обнаружения ДНК Chlamydia trachomatis методом полимеразной цепной реакции ПОЛИМИК-ХЛ производства ООО НПФ «ЛИТЕХ» [Регистрационное удостоверение №ФСР 2007/00382 от 16.07.2007]. Детекция продуктов амплификации осуществляется методом гель-электрофореза.

Известны наборы реагентов для выявления ДНК Chlamydia trachomatis методом полимеразной цепной реакции ХЛАМИ-ГЕН производства ООО «НПО ДНК-Технология» [Регистрационное удостоверение №ФСР 2008/03890 от 26.04.2010]. Наборы производятся в трех модификациях, различающихся способами детекции продуктов амплификации: детекция методом гель-электрофореза, флуоресцентная детекция по конечной точке и флуоресцентная детекция в режиме реального времени.

В исследовании, посвященном сравнительной оценке тест-систем отечественного производства для выявления ДНК Chlamydia trachomatis, сообщается, что в наборе реагентов производства ООО НПФ «ЛИТЕХ» в качестве мишени для ПЦР используется криптическая плазмида, а в наборах реагентов производства ООО «НПО ДНК-Технология» в зависимости от способа детекции используются различные мишени: в наборе с детекцией методом гель-электрофореза в качестве мишени используется криптическая плазмида, а в наборе с флуоресцентной детекцией по конечной точке и в режиме реального времени используется ген 16S rRNA [Shipitsyna Ε. et al. First evaluation of six nucleic acid amplification tests widely used in the diagnosis of Chlamydia trachomatis in Russia. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2009 Mar; 23(3): 268-276]. Однако более детальная информация, касающаяся конкретных фрагментов мишеней, размеров продуктов амплификации, нуклеотидных последовательностей используемых в наборах олигонуклеотидных праймеров и зондов, по сведениям авторов настоящих изобретений, не опубликована в общедоступных источниках информации.

На российском рынке присутствуют наборы реагентов (тест-системы) производства компании Roche Molecular Systems, Inc. серии COBAS® AMPLICOR: для выявления ДНК одного патогена - Набор реагентов для детекции ДНК Хламидии Трахоматис (Cobas Amplicor Chlamydia trachomatis Detection kit), для одновременного выявления двух патогенов - Набор реагентов для амплификации Хламидии Трахоматис и Нейссерии Гонореи (Amplicor CT/IMG Amplification kit) [Регистрационное удостоверение №ФСЗ 2011/09814 25.05.2011]. В наборах реализован принцип флуоресцентной детекции по конечной точке с использованием флуоресцентного интеркалирующего красителя SYBR GREEN. В данных наборах в качестве мишени для выявления Chlamydia trachomatis используется криптическая плазмида, и более конкретно фрагмент плазмиды в открытой рамке считывания ORF1 [ЕР 0420260 В1, ЕР 0630971 В1, ЕР 0875583 В1].

Данные тест-системы были одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (Food and Drug Administration) и были рекомендованы ВОЗ в качестве референсных тест-систем при валидации новых и модифицированных тест-систем [ПРОТОКОЛЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИИ ВЫЗВАННОЙ CHLAMYDIA TRACHOMATIS, (УРОГЕНИТАЛЬНОЙ ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ) В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (проект), www.cnikvi.ru/files/xlamidioz.doc], что свидетельствует об их надежности. Однако в 2007 году были обнаружены новые мутантные штаммы Chlamydia trachomatis (nvCT), содержащие делецию размером 377 пар нуклеотидов именно в том фрагменте ORF1 криптической плазмиды, который является мишенью полимеразной цепной реакции в данных диагностических наборах [Ripa Т. and Nilsson Р.Α. A Chlamydia trachomatis strain with a 377-bp deletion in the cryptic plasmid causing false-negative nucleic acid amplification tests. Sex Transm Dis. 2007 May; 34(5): 255-256]. Новые мутантные штаммы получили название «шведский вариант» по месту их обнаружения. Невозможность обнаружения данных штаммов наборами серии COBAS® AMPLICOR и другими наборами со сходной мишенью привело к тысячам ложноотрицательных результатов в диагностике хламидийной инфекции, что, вероятно, способствовало распространению мутантных штаммов [Steensels D. et al. Towards multitarget testing in molecular microbiology. Int J Microbiol. 2013; 2013:121057. doi: 10.1155/2013/121057. Epub 2013 Nov 25. Review].

Одним из путей решения проблемы «ухода» новых «шведских вариантов» Chlamydia trachomatis от обнаружения является введение дополнительной мишени для ПЦР в рамках одной тест-системы. Так, усовершенствованный набор реагентов для выявления Chlamydia trachomatis COBAS® TaqMan® CT Test, v2.0 [Регистрационное удостоверение №ФСЗ 2010/07038] компании Roche Molecular Systems, Inc. содержит реагенты для амплификации и детекции в режиме реального времени двух мишеней Chlamydia trachomatis: помимо вышеупомянутого фрагмента криптической плазмиды, также хромосомного гена оmр-1, кодирующего основной белок внешней мембраны (МОМР). Такой подход, несомненно, повышает надежность выявления Chlamydia trachomatis (снижает количество ложноотрицательных результатов), однако усложняет и удорожает анализ, повышая требования к лабораторному оборудованию (а именно к числу каналов детекции прибора). Кроме того, данный подход - увеличение количества мишеней для выявления одного патогена - снижает возможности одновременного выявления нескольких патогенов в одной пробирке на имеющемся в лаборатории оборудовании, что не вполне отвечает современным потребностям лабораторной диагностики урогенитальных заболеваний, часто протекающих по типу микст-инфекций.

Сущность группы изобретений.

Задачами настоящей группы изобретений являются: разработка и валидация набора реагентов, позволяющего выявлять все клинически значимые штаммы/генотипы/серовары урогенитального биовара Chlamydia trachomatis (в том числе nvCT) с помощью единственной мишени полимеразной цепной реакции, с возможностью как самостоятельного использования для выявления ДНК одного патогена - Chlamydia trachomatis, так и в составе мультиплексного набора для выявления ДНК нескольких патогенов, с возможностью количественного определения ДНК Chlamydia trachomatis; расширение арсенала тест-систем для выявления ДНК Chlamydia trachomatis.

В рамках настоящих изобретений в качестве мишени для полимеразной цепной реакции была выбрана криптическая плазмида Chlamydia trachomatis. Плазмида мультикопийна, то есть содержится в количестве 4-8 копий на клетку, что повышает аналитическую чувствительность тест-систем с данной мишенью по сравнению с тест-системами с однокопийными хромосомными мишенями. Кроме того, последовательность криптической плазмиды высококонсервативна: вариабельность среди представителей различных сероваров внутри одного биовара составляет менее 1% [Comanducci м. et al. Diversity of the Chlamydia trachomatis common plasmid in biovars with different pathogenicity. Plasmid. 1990 Mar; 23(2): 149-154], что делает эту мишень подходящей для выявления всех клинически значимых сероваров урогенитального биовара Chlamydia trachomatis при условии выбора фрагмента для амплификации с учетом данных о положении делеции в криптической плазмиде nvCT.

На основании анализа «выравниваний» нуклеотидных последовательностей криптических плазмид Chlamydia trachomatis из GenBank и имеющихся литературных данных о положении делеции в криптической плазмиде nvCT («шведских вариантов» Chlamydia trachomatis) был определен высококонсервативный участок внутри открытой рамки считывания 8 (ORF8) криптической плазмиды, имеющий последовательность SEQ ID NO:1, в качестве оптимальной «площадки» для дизайна олигонуклеотидных праймеров для специфической амплификации фрагмента ДНК внутри этой «площадки».

Помимо участка для дизайна олигонуклеотидных праймеров для специфической амплификации фрагмента ДНК криптической плазмиды Chlamydia trachomatis в рамках настоящих изобретений экспериментальным путем был определен оптимальный размер этого фрагмента (продукта амплификации) - от 70 до 110 пар нуклеотидов. Оказалось, что амплификация фрагментов такого размера обладает минимальной восприимчивостью как к примесям-ингибиторам ПЦР, так и к конкуренции со стороны других ПЦР мишеней. Последнее в свою очередь расширяет возможности мультиплексирования ПЦР, то есть одновременного выявления двух и более патогенов в одной реакции (в одной пробирке).

Таким образом поставленные задачи решены созданием набора реагентов для выявления ДНК Chlamydia trachomatis в образце методом полимеразной цепной реакции, включающего по меньшей мере два олигонуклеотидных праймера для полимеразной цепной реакции, отличающего тем, что указанные два олигонуклеотидных праймера обеспечивают специфическую амплификацию фрагмента ДНК Chlamydia trachomatis, лежащего внутри участка криптической плазмиды Chlamydia trachomatis последовательности SEQ ID NO:1, причем размер фрагмента составляет от 70 до 110 пар нуклеотидов.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что один олигонуклеотидный праймер имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO:2, второй олигонуклеотидный праймер имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO:3.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что один олигонуклеотидный праймер имеет последовательность SEQ ID NO:2, второй олигонуклеотидный праймер имеет последовательность SEQ ID NO:3.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что дополнительно содержит олигонуклеотидный зонд для детекции фрагмента ДНК Chlamydia trachomatis в режиме реального времени, где указанный зонд на 5'-конце содержит флуоресцентный краситель, на 3'-конце содержит гаситель флуоресценции.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что флуоресцентный краситель выбран из группы: JOE, FAM, R6G, ROX, Су5, Су5.5, HEX.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что гаситель флуоресценции выбран из группы: BHQ1, BHQ2, BHQ3, RTQ.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что олигонуклеотидный зонд имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO:4.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что олигонуклеотидный зонд имеет последовательность SEQ ID NO:4.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что олигонуклеотидный зонд представляет собой

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что олигонуклеотидный зонд представляет собой

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что дополнительно содержит термостабильную ДНК-полимеразу, буферный раствор для ПЦР, дезоксинуклеозидтрифосфаты.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что дополнительно содержит по меньшей мере один калибратор для количественной оценки содержания ДНК Chlamydia trachomatis в образце, содержащий известные концентрации фрагмента ДНК Chlamydia trachomatis, используемого для выявления ДНК Chlamydia trachomatis.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что дополнительно содержит реагенты для выявления в образце методом мультиплексной полимеразной цепной реакции ДНК по меньшей мере одного дополнительного микроорганизма, выбранного из группы: Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что биологический образец для проведения исследования выбран из группы: мазок из влагалища, моча, семенная жидкость, соскоб из уретры, соскоб из цервикального канала.

Объем притязаний включает также применение вышеописанных наборов реагентов для выявления ДНК Chlamydia trachomatis в биологических образцах.

Группа изобретений позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять все клинически значимые штаммы/генотипы/серовары урогенитального биовара Chlamydia trachomatis (в том числе nvCT) с помощью единственной мишени полимеразной цепной реакции. В частном случае выполнения группа изобретений позволяет определять ДНК Chlamydia trachomatis в количественном формате, что может быть полезно для уточнения диагноза при сомнительных/дискордантных результатах анализа. Кроме того, уровень бактериальной нагрузки может иметь патогенетическое и прогностическое значение и оказывать влияние на выбор тактики этиотропной терапии. В частном случае выполнения группа изобретений позволяет выявлять одновременно несколько возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, что может быть полезно для диагностики часто встречающихся микст-инфекций урогенитального тракта.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления группы изобретений

Пример 1. Выявление (качественное определение) ДНК Chlamydia trachomatis в биологических образцах.

В исследование были включены 127 пациентов мужского пола с жалобами на наличие зуда/жжения в области половых органов и/или дизурии. От каждого пациента получали по два биологических образца - соскоба из уретры. Взятые у пациентов уретральные образцы помещали в 1 мл сахарозо-фосфатного буфера. Первый образец исследовали методом полимеразной цепной реакции с использованием двух референсных наборов реагентов для выявления ДНК Chlamydia trachomatis - COBAS® AMPLICOR (Roche Molecular Systems, Inc., США) и Light-Mix 480 HT (TIB MOLBIOL, Германия). Второй образец исследовали методом полимеразной цепной реакции с использованием набора реагентов по изобретению. Далее проводилось сопоставление результатов, полученных тремя наборами реагентов для выявления ДНК Chlamydia trachomatis.

Исследование образцов с использованием двух референсных наборов реагентов.

Выделение ДНК из биологических образцов проводили с использованием набора реагентов MagNa Pure LC DNA Isolation kit I (Roche Molecular Biochemicals, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Объем элюции составил 100 мкл, далее образец разводили в 2 раза, добавляя еще 100 мкл буфера. Для амплификации ДНК методом полимеразной цепной реакции использовали 50 мкл полученного элюата. Постановку полимеразной цепной реакции и интерпретацию результатов исследования осуществляли в соответствии с инструкциями производителя.

Исследование образцов с использованием набора реагентов по изобретению.

Выделение ДНК из биологических образцов проводили с использованием набора реагентов ДНК-Сорб-АМ (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, кат. №102-22). До выделения ДНК в пробирки вносили по 10 мкл препарата внутреннего контрольного образца (ВКО). Для амплификации ДНК методом полимеразной цепной реакции использовали 10 мкл полученного элюата (объем полученного элюата после экстракции составлял 100 мкл).

Реакционную смесь для полимеразной цепной реакции готовили следующим образом. Сначала готовили ПЦР-смесь-1, содержащую олигонуклеотидные праймеры, олигонуклеотидные зонды для детекции и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты в буфере ТЕ. Состав ПЦР-смеси-1 приведен в таблице 1.

Затем в каждую реакционную пробирку вносили по 10 мкл ПЦР-смеси-1, по 5 мкл ПЦР-смеси-2 red (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, кат. №863), содержащей Taq-полимеразу, и по 10 мкл элюата, полученного при выделении ДНК из биологических образцов.

Амплификацию проводили на приборе «Rotor-Gene Q» (QIAGEN, Германия).

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам - анализировались с помощью программного обеспечения прибора «Rotor-Gene Q». Сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК Chlamydia trachomatis, детектировался по каналу Green, ДНК ВКО детектировался по каналу Yellow. Результаты интерпретировались на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы ДНК значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов.

Результаты интерпретировались следующим образом:

- ДНК Chlamydia trachomatis обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу Green определено значение порогового цикла Ct. При этом кривая флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.

- ДНК Chlamydia trachomatis не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу Green не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу Yellow определено значение порогового цикла Ct, не превышающее 33.

- Результат анализа невалидный, если для данной пробы не определено (отсутствует) или превышает 33 значение порогового цикла Ct по каналу для детекции Yellow и не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct по каналу Green.

Результаты исследования уретральных образцов от 127 пациентов приведены в таблице 2.

Было получено 100%-ное совпадение при тестировании набора по изобретению относительно двух референсных наборов реагентов. Таким образом, диагностическая чувствительность, диагностическая специфичность, прогностическое значение положительного результата и прогностическое значение отрицательного результата набора по изобретению составили 100%.

Также было продемонстрировано, что набор по изобретению позволяет достоверно выявлять наличие ДНК Chlamydia trachomatis в биологических образцах методом мультиплексной полимеразной цепной реакции одновременно с выявлением ДНК других возбудителей инфекций, передаваемых половым путем: Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium.

Пример 2. Количественное определение ДНК Chlamydia trachomatis в биологических образцах.

Проводили исследование биологических образцов, описанных в примере 1, с использованием дополнительного набора реагентов для выявления ДНК Chlamydia trachomatis ХЛАМИ-ГЕН (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).

Результаты исследования уретральных образцов от 127 пациентов приведены в таблице 3. При анализе результатов исследования выявлен дискордантный образец №84.

Далее все образцы, в которых была выявлена ДНК Chlamydia trachomatis, исследовали методом количественной полимеразной цепной реакции с применением набора по изобретению.

Количественное определение ДНК микроорганизма основывается на существовании линейной зависимости между циклом начала увеличения флуоресценции образца (пороговый цикл, Cycle threshold, Ct) и исходной концентрацией ДНК-мишени. Для реализации количественного определения в реакции амплификации параллельно используются ДНК-калибраторы - образцы с известной концентрацией ДНК Chlamydia trachomatis. По результатам амплификации ДНК-калибраторов выстраивается калибровочная прямая, по которой происходит определение концентрации ДНК Chlamydia trachomatis в образцах.

Калибраторы (К1 и К2) готовили путем разведения стандартного образца производства (СОП) №86 Chlamydia trachomatis ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, содержащего фрагмент криптической плазмиды Chlamydia trachomatis, клонированный по сайтам EcoRI в плечи фага λ - λgt10. Для разведения исходного СОП используется ДНК-буфер с poly(A). Конечная концентрация для калибратора К1 составляет 1*106 ГЭ/мл; для калибратора К2 - 1*104 ГЭ/мл.

Амплификацию проводили на приборе «Rotor-Gene Q» (QIAGEN, Германия). Значения пороговых циклов калибраторов и исследуемых образцов анализировались программой автоматического учета результатов. В соответствии с этими значениями автоматически была построена калибровочная прямая и рассчитаны концентрации ДНК Chlamydia trachomatis в исследованных уретральных образцах от 16 пациентов (таблица 4).

Установлено, что в дискордантном образце концентрация ДНК Chlamydia trachomatis самая низкая из всех исследованных образцов и составляет 6,52Е+02 ГЭ/мл. Данная концентрация ДНК С.trachomatis лежит ниже границы аналитической чувствительности набора реагентов ХЛАМИ-ГЕН, что и объясняет получение отрицательного результата при исследовании с использованием этого набора.

Количественное определение ДНК Chlamydia trachomatis может быть полезно для различных клинико-лабораторных и научно-исследовательских целей, таких как уточнение диагноза при сомнительных/дискордантных результатах анализа, определении чувствительности различных методов диагностики, мониторинга эффективности терапии. Наконец, количественное определение возбудителя может иметь большое значение в выборе тактики этиотропной терапии, поскольку существуют основания полагать [Horner P. The case for further treatment studies of uncomplicated genital Chlamydia trachomatis infection. Sex Transm Infect. 2006 Aug; 82(4): 340-343], что рецидив хламидийной инфекции, не связанный с повторным инфицированием после проведенной антибактериальной терапии, вызван развитием гетеротипической устойчивости в результате высокой бактериальной нагрузки до начала лечения.

1. Набор реагентов для выявления ДНК Chlamydia trachomatis в образце, включающий по меньшей мере два олигонуклеотидных праймера для полимеразной цепной реакции и, при необходимости, олигонуклеотидный зонд, термостабильную ДНК-полимеразу, буферный раствор для ПЦР, дезоксинуклеозидтрифосфаты, отличающийся тем, что первый олигонуклеотидный праймер имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, второй олигонуклеотидный праймер имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3.

2. Набор реагентов по п. 1, характеризующийся тем, что олигонуклеотидный зонд представляет собой олигонуклеотидный зонд для детекции ДНК Chlamydia trachomatis в режиме реального времени, где указанный зонд на 5'-конце содержит флуоресцентный краситель, на 3'-конце содержит гаситель флуоресценции.

3. Набор реагентов по п. 2, характеризующийся тем, что указанный флуоресцентный краситель выбран из группы: JOE, FAM, R6G, ROX, Су5, Су5.5, HEX.

4. Набор реагентов по п. 2, характеризующийся тем, что указанный гаситель флуоресценции выбран из группы: BHQ1, BHQ2, BHQ3, RTQ.

5. Набор реагентов по п. 2, характеризующийся тем, что указанный олигонуклеотидный зонд имеет последовательность SEQ ID NO: 4.

6. Набор реагентов по п. 2, характеризующийся тем, что указанный олигонуклеотидный зонд представляет собой (FAM)-CCCCGCACGTGCTTCGAGCAACCGCG-(BHQ1).

7. Набор реагентов по п. 2, характеризующийся тем, что указанный олигонуклеотидный зонд представляет собой (JOE)-CCCCGCACGTGCTTCGAGCAACCGCG-(BHQ1).

8. Набор реагентов по п. 1, характеризующийся тем, что указанный образец выбран из группы: мазок из влагалища, моча, семенная жидкость, соскоб из уретры, соскоб из цервикального канала.

9. Применение набора реагентов по любому из пп. 1-8 для выявления ДНК Chlamydia trachomatis в образце методом полимеразной цепной реакции.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и стоматологии и клинико-лабораторной диагностике. Описан способ оценки состояния пародонта человека на предмет устойчивости к развитию хронического генерализованного пародонтита, вызываемого Treponema denticola и/или Tannerella forsythensis.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) тяжелой или средней степени тяжести в программе ЭКО.

Изобретение относится к области медицины, в частности к гинекологии, и предназначено для прогнозирования развития ВПЧ-ассоциированных цервикальных интраэпителиальных неоплазий (CIN).
Изобретение относится к области медицины и предназначено для диагностики врожденного нефротического синдрома финского типа у детей с использованием технологии секвенирования нового поколения.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для диагностики гликогеновой болезни IXa типа у детей с использованием технологии секвенирования нового поколения.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу идентификации растения, включающему по крайней мере одну детерминанту устойчивости сорта растения сои к соевой цистообразующей нематоде (SCN), а также к способу получения SCN-устойчивого растения сои, представляющего собой интерес сорта, включающему стадии скрещивания растения сои, имеющего признак устойчивости к SCN, с растением сои SCN-неустойчивого сорта, представляющий интерес, применение маркер-вспомогательной селекции, а также размножение растений сои F1 с получением SCN-устойчивого растения сои.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан синтетический, необязательно модифицированный олигонуклеотид длиной 10-30 нуклеотидов или длиной 19-30 нуклеотидов, где модификация выбрана из модифицированного сахарного фрагмента; модифицированной межнуклеотидной связи; модифицированного нуклеотида, а также из их сочетаний.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу идентификации сортов малины Агавам, Атлант, Бабье лето II, Беглянка, Бриллиантовая, Брянское диво, Геракл, Желтый гигант, Золотая осень, Кумберленд, Логанберри, Лаутон, Оранжевое чудо, Пингвин, Солнышко, Тайберри, Торнфри, Элегантная на основе RAPD-маркеров, включающий отбор растительного материала, выделение ДНК из растительного материала, амплификацию ДНК в реакционной смеси с последовательным участием нескольких рандомных праймеров, разделение продуктов амплификации с помощью электрофореза, визуализацию продуктов амплификации под ультрафиолетовым светом и выявление среди продуктов амплификации уникальных сочетаний аллелей всех амплифицируемых зон (локусов) по всем используемым праймерам, присущих только для данного сорта профилей.

Изобретения относятся к области генетики и медицины и касаются способов неинвазивного пренатального установления отцовства. В способах применяются генетические измерения наличия однонуклеотидных полиморфизмов, делеций, дупликаций и инверсий нуклеотидных последовательностей, выполненные в плазме, взятой от беременной матери, вместе с аналогичными генетическими измерениями предполагаемого отца для определения того, является или не является предполагаемый отец биологическим отцом плода.

Изобретение относится к биохимии. Описаны способы детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения зондирующего и метящего олигонуклеотида (РТО)).

Изобретение относится к биохимии. Описан способ определения видовой принадлежности возбудителя бруцеллеза. Видовую принадлежность возбудителя бруцеллеза определяют методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени, которую ставят в один этап в двух реакционных смесях. Одна смесь содержит сочетание праймеров SEQ ID N 1, 3, 5 и зондов SEQ ID N 2, 4, 6 к генам bcsp31, BRA0541, BRA0420, другая смесь содержит праймеры SEQ ID N 7, 9, 11 и зонды SEQ ID N 8, 10, 12 к генам BMEI1426, BMEII0711, BMEI0994. По отсутствию сигнала флуоресценции с видоспецифичной ДНК-мишенью и его наличию с остальными используемыми ДНК-мишенями определяют принадлежность к видам В. abortus, В. melitensis, B. ovis, B. canis, В. neotomae, а по наличию сигнала флуоресценции со всеми ДНК-мишенями определяют принадлежность к виду B. suis. Изобретение позволяет повысить эффективность и сократить время идентификации 6 основных видов бруцелл. 1 ил., 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к биохимии и области медицинской микробиологии. Описан способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы Yersinia pestis. Способ предусматривает выделение ДНК исследуемого штамма, проведение полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени с праймерами SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 и зондами SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 на ДНК-мишени 45, 89, Caucasic(-91), His(-205), Alt(-90), Uleg(-88), Tal(-72). Подвидовую дифференциацию штаммов Yersinia pestis проводят по отсутствию сигнала флуоресценции по специфической для подвида ДНК-мишени и по его наличию по остальным используемым ДНК-мишеням. 1 ил., 6 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу обнаружения полинуклеотида в образце, содержащем ДНК сои. Изобретение позволяет обнаружить полинуклеотид с определенной последовательностью в образце ДНК сои. 4 ил., 9 табл., 8 пр.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ для идентификации субъекта с депрессией или имеющего риск развития депрессии, который имел бы положительный эффект от или ответил на режим лечения, включающий фолат-содержащее соединение, где указанный субъект идентифицируется таким, как указанно выше при условии детекции в генотипах двух локусов наличия аллеля с тимином Т в положении 677 (в гене MTHFR) и аллеля с гуанином G в положении SNP2756 (в гене MTR). Предложено применение фолат-содержащей композиции в комбинации с антидепрессантом при лечении депрессии у человека, который несет вышеуказанные однонуклеотидные полиморфизмы. Группа изобретений позволяет наиболее эффективно решить проблему назначения фолат-содержащего соединения пациентам с депрессией или риском ее развития за счет выбора оптимальной комбинации полиморфизмов генов фолатного пути для генотипирования, в результате чего пациенты с указанным заболеванием получают наибольшую пользу от приема фолат-содержащего соединения. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 24 ил., 42 табл., 4 пр.

Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии, и предназначено для прогнозирования риска снижения эффективности антиагрегантной терапии клопидогрелем и препаратами ацетилсалициловой кислоты (АСК) у больных ишемической болезнью сердца (ИБС), подвергшихся стентированию коронарных артерий. Из венозной крови пациентов выделяют ДНК. Полиморфные варианты Т-786С гена NOS3 определяют путем аллель-специфичной ПЦР. Детекцию продуктов ПЦР проводят электрофоретическим методом. Повышенный риск снижения эффективности антиагрегантной терапии клопидогрелем и препаратами ацетилсалициловой кислоты прогнозируют у носителей генотипа -786СС гена NOS3. Изобретение позволяет провести оценку риска формирования резистентности к антиагрегантным препаратам и своевременно скорректировать проводимую терапию и повысить качество лечения. 2 табл., 3 пр.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ получения оптимизированного твердого ген-активированного материала, включающего создание матрикса-носителя, связавшего как минимум одну молекулу нуклеиновой кислоты, с последующим размещением на его поверхности еще как минимум одной дополнительной молекулы нуклеиновой кислоты любым физическим методом, позволяющим осуществить такое размещение без образования химической связи между указанным матриксом-носителем и дополнительной нуклеиновой кислотой. Также представлен способ получения твердого матрикса-носителя, используемого в описанном способе, и предназначенного для связывания как минимум одной молекулы нуклеиновой кислоты, включающий введение в состав твердого матрикса-носителя на этапе его синтеза любого комплексообразователя за счет обработки исходного материала раствором, содержащим соль металла-комплексообразователя, способного связать как минимум одну молекулу нуклеиновой кислоты. Также представлены продукты, полученные указанными способами. Изобретение позволяет получать оптимизированные остеопластические материалы, отличающиеся точной дозой нуклеиновых кислот, более эффективной динамикой высвобождения генных конструкций из структуры матрикса-носителя и повышенным уровнем трансфекции клеток реципиентного ложа биологически активным веществом. 4 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к рекомбинантной молекуле ДНК, указывающей на присутствие трансгенного события, где репрезентативный образец семени, содержащий указанное трансгенное событие, депонирован как АТСС РТА-7899. Также раскрыт способ детекции присутствия молекулы ДНК из вышеуказанного трансгенного события в образце, который осуществляется путем использования зонда или пары молекул ДНК. Изобретение также относится к рекомбинантному растению маиса, устойчивому к глифосату, а также к способу борьбы с сорняками с его использованием, части указанного растения, его клетки и семени. Также раскрыт продукт потребления, содержащий вышеуказанное трансгенное событие, а также способ его изготовления. Изобретение позволяет эффективно получать растение маиса, устойчивое к глифосату. 12 н. и 16 з.п. ф-лы, 9 ил., 3 табл., 10 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к рекомбинантной молекуле ДНК, указывающей на присутствие трансгенного события, где репрезентативный образец семени, содержащий указанное трансгенное событие, депонирован как АТСС РТА-9670. Также раскрыт способ определения присутствия молекулы ДНК из вышеуказанного трансгенного события в образце, который осуществляется путем использования ДНК-зонда или пары молекул ДНК, а также набор для детекции вышеуказанного трансгенного события. Изобретение также относится к рекомбинантному растению сои, устойчивому к дикамбе, его части, клетке и семени. Также раскрыт способ борьбы с сорняками в поле, включающем посев растения, включающего трансгенное событие, где репрезентативный образец семени, содержащий указанное трансгенное событие, депонирован как АТСС РТА-9670, а также способ определения зиготности растения сои, содержащего вышеуказанное событие. Изобретение позволяет эффективно получать растение сои, устойчивое к дикамбе. 13 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 4 пр.

Изобретения относятся к способам обнаружения рака поджелудочной железы с применением новых маркеров опухоли. Представленные способы обнаружения рака поджелудочной железы включают измерение наличия или количества полипептида, обладающего реактивностью в форме специфического связывания с антителом против белка CAPRIN-1 через взаимодействие антиген-антитело, или наличия или количества нуклеиновой кислоты, кодирующей этот полипептид, в образце, взятом от индивидуума, где полипептид, подлежащий измерению, представляет собой белок CAPRIN-1, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей любой из SEQ ID NO: 2-30 с четным номером, и где наличие или количество нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, определяют путем определения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащийся в образце. Изобретения позволяют осуществлять простым способом обнаружение злокачественной опухоли рака поджелудочной железы. 9 н. и 18 з.п. ф-лы, 5 пр.

Изобретение относится к области медицинской диагностики. Предложен способ прогнозирования риска развития эссенциальной гипертензии у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови и анализ полиморфизмов генов. При выявлении сочетания генетических вариантов матриксных металлопротеиназ: генотипа АА rs1320632 MMР-8 и аллеля С rs11225395 MMР-8 прогнозируют высокий риск развития эссенциальной гипертензии. Изобретение позволяет на доклиническом этапе формировать среди индивидуумов группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития заболевания. 3 ил., 3 пр.
Наверх