Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток


 

A01N1/02 - Консервирование тел людей или животных, или растений или их частей; биоциды, например дезинфектанты, пестициды, гербициды (препараты для медицинских,стоматологических или гигиенических целей A61K; способы или устройства для дезинфекции или стерилизации вообще, или для дезодорации воздуха A61L); репелленты или аттрактанты (приманки A01M 31/06; лекарственные препараты A61K); регуляторы роста растений (соединения вообще C01,C07,C08; удобрения C05; вещества, улучшающие или стабилизирующие состояние почвы C09K 17/00)

Владельцы патента RU 2624214:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" (RU)

Изобретение относится к медицине. Криоконсервирование ГСК крови проводят поэтапно. Первоначально проводят смешивание криозащитного 10% раствора криопротектора ДМСО с концентратом ядросодержащих клеток в эластичной упаковке и холодовую адаптацию приготовленной клеточной взвеси в течение 10 мин при температуре 4±1°С, замораживание биообъекта от +4±1°С до -80÷-196°С осуществляют в режиме быстрой двухступенчатой программы. На первом этапе замораживания осуществляют холодовую адаптацию при температуре -26÷-30°С с продолжительностью выдерживания 25 мин, при втором этапе биообъект быстро переносят в хранилище с температурой -80÷-196°С. Хладагентом на этапах смешивания клеточной взвеси с криоконсервантом и холодовой адаптации гемопоэтических стволовых клеток является гранулированный теплоноситель из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±1°С и -28±2°С соответственно. Предлагаемый способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток обеспечивает повышение стерильности и количества морфологически сохранных ядерных клеток. 1 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к технологии криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) человека, и может быть использовано в гематологических, онкологических, хирургических и других центрах для лечения больных с депрессией кроветворения различного происхождения. Принцип изобретения заключается в следующем: проводят смешивание криозащитного 10% раствора ДМСО с концентратом ядросодержащих клеток в эластичной упаковке, холодовую адаптацию при температуре +4±1°С в течение 10 мин, замораживание клеточной взвеси от +4±1°С до -80÷-196°С в режиме быстрой двухступенчатой программы, при которой на первом этапе замораживания осуществляют холодовую адаптацию при температуре -26÷-30°С с продолжительностью выдерживания 25 мин, при втором этапе биообъект быстро переносят в хранилище с температурой -80÷-196°С, при этом хладагентом на этапах смешивания клеточной взвеси с криоконсервантом и холодовой адаптации гемопоэтических стволовых клеток является гранулированный теплоноситель из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±1°С и -28±2°С соответственно.

Изобретение позволяет повысить технологичность способа криоконсервирования клеток, его безопасность для здоровья персонала, приготовить гарантированно максимальное количество стерильных и полноценных криоконсервированных ядросодержащих клеток с ГСК за счет замены токсичного жидкого хладагента в виде раствора этилового спирта 42-45 об.% на нетоксичный сухой теплоноситель в виде обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±1°С или -28±2°С.

В технологии консервирования ГСК известны способы их криоконсервирования, например, см. пат. РФ №2569834, A01N 1/02, «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток», опубл. 27.11.2015 г., Бюл. №33 и пат. РФ №2195111, A01N 1/02, «Способ криоконсервирования клеточных суспензий», опубл. 27.12.2002 г., Бюл. №36, который взят за прототип, предусматривает смешивание криозащитного 10% раствора ДМСО с концентратом ядросодержащих клеток в эластичной упаковке, поэтапное замораживание до -80°С с выдерживанием в морозильной камере в хладагенте в виде раствора этилового спирта 42-45 об.% с фиксированной температурой холодовой адаптации от -26 до -30°С в течение 25 мин, перемещение для замораживания в хранилище и последующее размораживание в водяной бане при 38-42°С до температуры клеточной взвеси 2-4°С.

Недостатками такого способа криоконервирования ГСК являются: использование раствора этилового спирта 42÷45 об.% в качестве хладагента консервируемых клеток нежелательно из-за высокого токсического воздействия на клетки и организм человека в целом, а также профессиональная и бытовая вредность химического соединения.

Цель изобретения: заменить раствор этилового спирта 42÷45 об.% на нетоксичный, сухой и стерильный хладагент, а также стандартизировать условия криоконсервирования ГСК человека.

Техническим результатом предложенного решения является повышение технологичности и эффективности криоконсервирования клеточной взвеси с использованием современных технических средств.

Этот результат достигается за счет смешивания криозащитного 10% раствора ДМСО с концентратом ядросодержащих клеток в эластичной упаковке и холодовой адаптации в течение 10 мин при температуре +4±1°С, последующего замораживания клеточной взвеси в режиме быстрой двухступенчатой программы, при которой на первом этапе замораживания осуществляют холодовую адаптацию при температуре -26÷-30°С с продолжительностью выдерживания 25 мин, при втором этапе биообъект быстро переносят в хранилище с температурой -80÷-196°С, при этом хладагентом на этапах смешивания клеточной взвеси с криоконсервантом и холодовой адаптации гемопоэтических стволовых клеток является гранулированный теплоноситель из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±1°С и -28±2°С соответственно.

После отогревания в водяной бане все пробы консервированных ядросодержащих клеток были стерильны, количество морфологически сохранных ядерных клеток при этих условиях составляло 87,3±11,2%, устойчивостью к витальному красителю обладали 83,1±10,3 ядерных клеток крови.

Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.

Существенными признаками предложенного способа, совпадающего с известными признаками, являются: А - приготовление взвеси ядросодержащих клеток с ГСК в эластичной упаковке; Б - поэтапное замораживание приготовленной взвеси в морозильной камере с выдерживанием упаковок в хладагенте при -26÷-30°С - фиксированной температуре холодовой адаптации продолжительностью 25 мин; В - замораживание и консервирование биообъекта в хранилище при температуре -80÷-196°C; Г - отогревание ГСК при +38-42°С.

Существенными отличительными признаками способа криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток являются: Д - использование для холодовой адаптации взвеси ядросодержащих клеток с ГСК в качестве хладагента гранулированного теплоносителя сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±1°С и -28±2°С; Е - подготовка гранулированного теплоносителя Lab Armor к работе включает сборку устройства для холодовой адаптации ГСК, состоящего из «Термоконтейнера ТМ-20», хладоэлементов МХД-2 с охлажденным раствором антифриза, обеспечивающих температуру +4°С или -28±2°С термогранулам Lab Armor массой 4 кг и консервируемым клеткам.

Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови заключается в следующем (пример выполнения):

- производят заготовку концентратов ядросодержащих клеток периферической крови с ГСК. Концентраты ядросодержащих клеток крови с ГСК получают методом сепарации на аппарате Amicus в объеме от 38,0 до 81,0 (56,3±7,3) мл в стандартную эластичную полимерную упаковку, откуда закрытым способом переводят в пластиковые криопакеты и герметизируют, после чего помещают в устройство для холодовой адаптации клеточной взвеси. Для холодовой адаптации ГСК поэтапно используют электрический морозильник на +4±1°С и «Термоконтейнер ТМ-20», выложенный изнутри в виде прямоугольной ячейки хладоэлементами МХД-2 с раствором антифриза, гарантированно обеспечивающих температуру +4±1°С и -28±2°С вложенным в нее теплоносителю в виде сухих обеззараженных термогранул Lab Armor и консервируемому биообъекту;

- производят сборку устройства для холодовой адаптации клеточной взвеси. Для этого используют «Термоконтейнер ТМ-20» для временного хранения и транспортирования термонеустойчивых медицинских и других препаратов, который выкладывают изнутри в виде прямоугольной ячейки хладоэлементами МХД-2 с раствором антифриза, предварительно охлажденных в электроморозильнике до +4±1°С или -28±2°С и гарантированно обеспечивающих заданную температуру в течение всего цикла холодовой адаптации биообъектов. Техническим носителем указанных температурных режимов являются сухие обеззараженные термогранулы Lab Armor массой до 4 кг, которые помещают в ячейку устройства и покрывают эластичную упаковку с консервируемыми клетками слоем охлажденного теплоносителя толщиной от 3 до 5 см;

- готовят 10% раствор ДМСО и помещают его для охлаждения в бытовой электрический холодильник до температуры +4±1°С;

- производят подготовку полученной клеточной взвеси к замораживанию. Для этого клеточную взвесь в эластичном пластиковом криопакете погружают в слой теплоносителя толщиной от 3 до 5 см с заданной температурой +4±1°С, затем к ней порционно добавляют охлажденный до +4±1°С 10% раствор ДМСО, криопакет герметизируют, после чего клеточную взвесь подвергают холодовой адаптации при +4±1°С в течение 10 мин.

Далее взвесь ядросодержащих клеток с ГСК замораживают в режиме быстрой двухступенчатой программы. На первом этапе клеточную взвесь в эластичном пакете погружают в слой теплоносителя толщиной от 3 до 5 см с заданной температурой -28±2°С и выдерживают при ней в течение 25 мин. На втором этапе биообъект быстро переносят в хранилище с температурой -80÷-196°С и в последующем взвесь клеток отогревают при +38-42°С до 2-4°С.

После отогревания в водяной бане все пробы суспензии ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками были стерильными, количество морфологически сохранных ядерных клеток при этих условиях составляло 87,3±11,2%, устойчивостью к витальному красителю обладали 83,1±10,3% ядерных клеток крови.

Сравнительный анализ используемых критериев при оценке заявляемого и известного способов криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови представлен в таблице 1.

Таблица 1 - Сравнительный анализ способов криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови

Предлагаемый «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток» крови по сравнению с прототипом:

а) обладает повышенной технологичностью;

б) обеспечивает стерильность криоконсервированной клеточной суспензии;

в) обеспечивает морфологическую сохранность большего количества ядерных клеток;

г) обеспечивает гарантированно высокую устойчивость к витальному красителю мембран большего количества криоконсервированных ядерных клеток.

При использовании фондов научно-технической литературы эквивалентных решений не обнаружено, что подтверждает новизну предлагаемого способа криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови.

Использование простых приемов и доступного оборудования подтверждает промышленную применимость.

Неочевидность и оригинальный подход к решению проблемы подтверждает изобретательский уровень.

Исследования выполнены на базе лаборатории консервирования крови и тканей, ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России».

Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток, включающий смешивание криозащитного 10% раствора ДМСО с концентратом ядросодержащих клеток в эластичной упаковке, холодовую адаптацию при температуре +4±1°С в течение 10 мин, замораживание клеточной взвеси от +4±1°С до -80÷-196°С в режиме быстрой двухступенчатой программы, при которой на первом этапе замораживания осуществляют холодовую адаптацию при температуре -26÷-30°С с продолжительностью выдерживания 25 мин, при втором этапе биообъект быстро переносят в хранилище с температурой -80÷-196°С, при этом хладагентом на этапах смешивания клеточной взвеси с криоконсервантом и холодовой адаптации гемопоэтических стволовых клеток является гранулированный теплоноситель из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±1°С и -28±2°С соответственно.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, а именно производственной и клинической трансфузиологии, и предназначено для заготовки тромбоцитов длительного хранения, пригодных к трансфузии.

Изобретение относится к области медицины, а именно к трансфузиологии, и предназначено для заготовки замороженных тромбоцитов. Для замораживания тромбоцитов осуществляют отбор исходного тромбоцитного концентрата (ТК) с концентрацией тромбоцитов от 1×109/мл до 1,5×109/мл, содержащего функционально активные тромбоциты.

Изобретение относится к области медицины, а именно к трансфузиологии, и предназначено для заготовки тромбоцитов длительного хранения. Осуществляют отбор исходного тромбоцитного концентрата (ТК) с концентрацией 1×109/мл-1,5×109/мл, содержащих 40-70% тромбоцитов с гранулами и тромбоциты с адгезивной активностью 40-70%.

Изобретение относится к физиологии, криобиологии и медицине, а именно к созданию раствора для консервирования клеточных взвесей. Раствор для консервирования клеточных взвесей содержит пектин каллуса раувольфии змеиной, глицерин, трилон Б и воду для инъекций.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Композиция гербицида содержит водный настой натуральной хны в концентрации от 14 до 18% мас.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к способу консервирования биологических материалов. Способ консервации биологических материалов включает иммобилизацию их на сухом носителе с последующим высушиванием.

Изобретение относится к средству для борьбы с грибковыми заболеваниями растений формулы где R1=Me, R2=Ph; R1=R2=Ph; R1=R2=OMe. 1 табл..

Изобретение относится к способу получения 3-[(фенилсульфанил)метил]пентан-2,4-диона формулы (1) Сущность способа заключается во взаимодействии смеси формальдегида и тиофенола с 2,4-пентандиом с участием катализатора NiCl2⋅6H2O при мольном соотношении формальдегид:тиофенол:2,4-пентандион:NiCl2⋅6H2O=1:1:1:(0,03-0,07) в смеси растворителей CHCl3-С2Н5ОН (1:1, об.), при комнатной температуре (~20°C) и атмосферном давлении в течение 6-8 ч.

Изобретение относится к устройствам для витрификации биообъектов. Автономное устройство для витрификации биообъектов с использованием криогенного хладагента имеет коаксиальную конструкцию, включающую цилиндрический корпус, внутри которого установлена цилиндрическая аксиально удлиняемая опора, конец которой соединен с цанговым зажимом, обеспечивающим фиксацию трубки контейнера с биообъектами, пусковую пружину, которая взаимодействует с цилиндрической опорой и обеспечивает перемещение контейнера с биообъектами в сосуд с криогенным хладагентом через его горловину, цилиндрический теплоизоляционный экран с подвижной крышкой, защитный дисковый экран, фиксируемый на наружных выступах цилиндрического корпуса, и расположенную в верхней части устройства управляющую кнопку.

Изобретение относится к криобиологии и медицине. Для получения мультипотентных стромальных клеток (МСК) из криозамороженных тканей фетоплацентарного комплекса (пуповины, плодной части плаценты, амниона) пуповину и плаценту, полученные в ходе операции кесарева сечения, в течение не более 24 часов транспортируют в культуральную лабораторию, где их нарезают на фрагменты толщиной не более 10 мм и выдерживают в течение 20-25 минут в криопротекторной среде на основе аутоплазмы, полученной из пуповинной крови, либо фосфатно-солевого буфера рН=7,4, дополненного тестированным человеческим альбумином до 15 г/л, содержащей 1,5 моль/л пропандиола и 0,1 моль/л сахарозы.

Изобретение относится к консервации клеток биологических образцов при помощи криогенного охлаждения. Устройство сверхбыстрого охлаждения биологических образцов до криогенных температур с использованием линейного электропривода возвратно-поступательного движения включает расположенный в зоне с температурой окружающей среды линейный электропривод, содержащий коаксиально расположенные неподвижный индуктор и подвижный якорь, обеспечивающий при помощи направляющего штыря прерываемое паузами перемещение контейнера с биологическим образцом, выполненный из теплоизоляционного материала охлаждающий сосуд, на передней стенке которого выполнено проходное отверстие для контейнера, а внутри расположен патрубок с распылителем на конце, обеспечивающий направленный поток жидкого криогенного хладагента, струи которого воздействуют на контейнер с биологическим образцом, нагревательное устройство, смежно расположенное с охлаждающим сосудом, и герметизируемый сосуд с жидким криогенным хладагентом, в верхней части которого расположены вентиль, стравливающий избыточное давление, и соединенный с охлаждающим сосудом при помощи теплоизолированного патрубка. Изобретение позволяет повысить скорость охлаждения биологического образца. 7 з.п. ф-лы, 30 ил.
Наверх