Биопрепарат-нефтедеструктор и способ его получения

Группа изобретений относится к области промышленной биотехнологии. Предложены биопрепарат-нефтедеструктор и способ получения биопрепарата-нефтедеструктора. Биопрепарат-нефтедеструктор представляет собой ассоциацию нефтеокисляющих почвенных бактерий: Bacillus atrophaeus ВКМ B-3137D, Pseudomonas putida ВКМ B-3136D, Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2764D, Arthrobacter sp. ВКМ Ac-2765D, Bacillus megaterium BKM B-3138D. Способ включает раздельное культивирование штаммов, смешивание в одной емкости культуральных жидкостей штаммов в равных количествах до общего содержания бактерий 15-20×10⁹ кл/мл. Изобретения обеспечивают расширение арсенала биопрепаратов-нефтедеструкторов с повышенной нефтедеструктирующей активностью. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 3 табл., 3 пр.

 

Группа изобретений относится к области промышленной биотехнологии, экологии, охране окружающей среды, а именно, к микробиологическим методам очистки водоемов от нефтяных загрязнений, рекультивации почвы и утилизации нефтешламов, с одновременным восстановлением физико-химических свойств и естественного биоценоза почв и акваторий.

В настоящее время нефть является основным источником энергии в мире, добывается и перерабатывается в огромных объемах. Аварийные разливы нефти при добыче и транспортировке, а также накопление отходов при ее переработке наносят серьезный ущерб окружающей среде, что требует принятия специальных мер по их ликвидации. По экспертным оценкам, масштабы загрязнения почвы в результаты деятельности нефтедобывающих и транспортных предприятий на территории России достигает 800 тыс. гектаров. Ежегодные потери нефти по разным оценкам составляют от 1 до 8 млн тонн.

В настоящее время разработаны и применяются различные физико-химические методы для очистки от нефтяных загрязнений, но их применение не позволяет полностью очистить почву от нефтепродуктов. Поэтому, в конечной стадии очистки рекомендуют использовать биологические методы (Позднышев Г.Н., Манырин В.Н., Савельев А.Г. Перспективные способы добычи нефти и ликвидации нефтяных загрязнений / Самара, Изд. Дом «БАРАХ-М» - 2004, С. 440). Следует подчеркнуть, что биоценоз в почве регулируется природными микроорганизмами, которые способны утилизировать нефтепродукты. Однако при аварийных разливах нефти (например, при степени загрязнения до 3-5%) для восстановления почвы естественными микроорганизмами требуется не менее 20-30 лет.

К биодеградации нефтепродуктов способны многие микроорганизмы, на основе которых разработаны разнообразные коммерческие биопрепараты (Прикладная экобиотехнология: Т. 1 / А.Е. Кузнецов и др. - 2изд. - М: Бином - 2012. С. 562-597), в частности такие, как «Деворойл», «Дестройл», «Путидойл», «Родер», «Нафтокос», «Авалон» и другие. Препараты получают методом глубинного культивирования. Для приготовления сухой формы культуральную жидкость обезвоживают методом лиофильной или распылительной сушки. Применение сложного оборудования существенно повышает себестоимость сухих форм препаратов. При распылительной сушке происходит высокая инактивация (до 80%) вегетативных форм микроорганизмов, входящих в состав биопрепарата.

Известен биопрепарат для очистки водоемов, загрязненных нефтью продуктами его переработки, в котором в качестве нефтедеструктора использован штамм Pseudomonasflourescens ВКПМ-6864, искусственно иммобилизованный на сорбенте-носителе на частицах цеолита диаметром 30-350 мкм (патент РФ №2393215). Недостатком данного биопрепарата является низкая эффективность при рекультивации нефтешламов, и для приготовления сухой формы после иммобилизации клеток на носитель, требуется досушивание, а также наличие в составе препарата частиц (размером до 350 мкм), забивающих форсунки распылителей.

Известен также биопрепарат для очистки нефтяных загрязнений «Эконефтосил», на основе ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов рода Bacillussubtilis, Pseudomonasspp., Rhodococcus, Mykobacteriumflavescens, концентрируемых до 2×10¹¹ кл/мл. Для получения сухой формы его смешивают с цеолитом (патент РФ №2516412). Недостатком данного препарата является то, что простое смешивание суспензии клеток с цеолитом в указанном в патенте соотношении не позволяет обезвоживать биомассу до оптимальной влажности. Технически сложным является получение концентрированной суспензии с содержанием 2×10¹¹ кл/мл.

Известен препарат «Деворойл», в состав которого входят 6 штаммов микроорганизмов, обладающих широким спектром действия на углеводороды (патент РФ №2023686, заявка WO 93/00045). «Деворойл» получают глубинным культивированием и высушиванием методом распылительной сушки. Недостатком данного препарата является высокая его стоимость и большая инактивация микроорганизмов в процессе сушки.

Известен способ очистки от нефтяных загрязнений, предусматривающий нанесение препарата на нефтесубстрат загрязненного участка, при котором микроорганизмы предварительно культивируют в среде, содержащей нефтесубстрат загрязненного участка (патент РФ №2104248). Его недостатком является то, что в условиях реального нефтяного загрязнения нет возможности предварительно культивировать микробы в среде, содержащий нефтесубстрат.

Наиболее близкими аналогами заявляемых биопрепарата-нефтедеструктора и способа его получения являются соответственно препарат «Биоионит» и способ его получения по патенту РФ №2571219, опубл. 27.12.2014, Бюл. №36. Известный способ включает в себя раздельное культивирование пяти штаммов микроорганизмов-нефтедеструкторов с последующим напылением на глауконитсодержащий сорбент и дальнейшим обезвоживанием путем подачи подогретого воздуха. Недостатком данного препарата и способа его получения является то, что культивирование штаммов в ферментерах до концентрации 10¹¹-10¹² кл/мл представляет сложную техническую задачу, напыление суспензии клеток на поверхность глауконитсодержащего сорбента не позволяет осуществить равномерное распыление жидкости по всему объему сорбента, что не позволяет провести обезвоживание биомассы культур до оптимальной величины активности воды. При этом дополнительно предусмотрено обезвоживание смеси путем подачи подогретого воздуха, что приводит к потере биологической активности препарата. Препарат обладает относительно низкой нефтедеструктирующей активностью.

Задачей, решаемой группой изобретений, является создание универсального и высокоэффективного биопрепарата для рекультивации почв, очистки водоемов и утилизации нефтешламов.

Техническим результатом биопрепарата-нефтедеструктора является повышение его нефтедеструктирующей способности.

Техническим результатом способа получения биопрепарата-нефтедеструктора является расширение арсенала применяемых биопрепаратов.

Техническим результатом, достигаемым способом получения сухой формы препарата (пункты 3 и 4 патентной формулы), является повышение сохраняемости биологических свойств препарата.

Указанный технический результат, присущий биопрепарату при его использовании, достигается тем, что биопрепарат-нефтедеструктор, представляющий собой ассоциацию нефтеокисляющих почвенных микроорганизмов, согласно изобретению, содержит в качестве нефтеокисляющих почвенных микроорганизмов бактерии рода BacillusatrophaeusARK-81, PseudomonasputidaARK-1301, Rhodococcussp.ARK-66, Artrobactersp.ARK-950, BacillusmegateriumARK-396, выращенные при раздельном культивировании и смешанные до общего содержания бактерий 15-20×10⁹ кл/мл.

Указанный технический результат для способа получения биопрепарата-нефтедеструктора достигается тем, что в способе, включающем раздельное культивирование штаммов и приготовление микробной ассоциации смешиванием в одной емкости культуральных жидкостей штаммов, согласно изобретению, в качестве микроорганизмов используют бактерии рода BacillusatrophaeusARK-81, PseudomonasputidaARK-1301, Rhodococcussp.ARK-66, Artrobactersp.ARK-950 и BacillusmegateriumARK-396.

Кроме того, для приготовления сухой формы биопрепарата смешанную суспензию бактерий концентрируют на микрофильтрационной установке до общего содержания бактерий 50-65×10⁹ кл/мл.

Сухую форму биопрепарата получают преимущественно методом контактно-сорбционного обезвоживания путем импульсного распыла концентрированной суспензии в смесителе на поверхность сухого минерала Глауконит с влажностью не более 2%, предварительно опудренной Аэросилом АМ-300 - 1.5-2% в соотношении, обеспечивающем обезвоживание биомассы культур до оптимальной величины активности воды A_w=0.2-0.3.

Указанный технический результат, присущий биопрепарату, достигается созданием уникальной ассоциации бактерий-нефтедеструкторов: BacillusatrophaeusARK-81, PseudomonasputidaARK-1301, Rhodococcussp.ARK-66, Artrobactersp.ARK-950, BacillusmegateriumARK-396, обладающих нефтеокисляющими свойствами в отношении широкого спектра углеводородов.

Все штаммы депонированы в коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН г. Пущино.

Способ получения сухой формы препарата методом контактно-сорбционного обезвоживания обеспечивает обезвоживание биомассы до оптимальной величины активности воды, что обеспечивает максимальную сохраняемость биологических свойств препарата, при этом данный способ исключает дополнительное досушивание при помощи нагретого воздуха.

Группа изобретений, охарактеризованных указанными выше совокупностями существенных признаков, на дату подачи заявки не известна в Российской Федерации и за границей и отвечает требованиям критерия «новизна».

Группа изобретений может быть реализована промышленным способом с использованием известных технических средств и соответствует требованиям критерия «промышленная применимость».

Заявителем не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с совокупностями отличительных признаков предлагаемых изобретений и обеспечивающие достижение заявляемых технических результатов, в связи с чем можно сделать вывод о соответствии изобретений условию патентоспособности «изобретательский уровень».

Сущность изобретений поясняется следующими примерами.

Пример №1. Препарат получают следующим образом:

Микроорганизмы биопрепарата культивируют раздельно в промышленных ферментерах 100-350 л.

Состав среды: г/л

(NH4)2SO4	3,3
Глюкоза	10
MgSO4	0,5
KH2PO4	1,3
K2HPO4	3,3
Патока	10

Техническая солярка 0,5 до начала культивирования и 0,5 через 6 часов.

Ферментер и питательную среду стерилизуют при температуре 120°C в течение 20 минут.

pH в диапазоне 6,8-7,2 поддерживается автоматически 30%-м раствором щелочи, культивирование проводят при температуре 34±2°C. Обороты мешалки 150-180 об./мин. Время культивирования-18-25 часов.

Для приготовления жидкой формы препарата все микроорганизмы смешиваются в отдельной емкости в равных соотношениях. Общее количество контролируется методом высева на плотной питательной среде (ГРМ-агар). Количество живых клеток составляет 15±3×10⁹ клеток/мл.

Жидкую форму препарата расфасовывают в полиэтиленовые емкости объемом 50 л.

Для получения сухой формы препарата смесь штаммов концентрируют на микрофильтрационной установке до 70×10⁹ клеток/мл.

Сухую форму препарата получают методом контактно-сорбционного обезвоживания концентрированной суспензии на опытно-промышленной установке УКС-50, которая обеспечивает равномерное обезвоживание биомассы до оптимальной активности воды A_w=0,2-0,3. Концентрация живых клеток в сухой форме препарата составляет 5×10⁹ клеток/г, выживаемость - 90%.

Модельные образцы готовятся следующим образом:

Готовят 3 емкости объемом 5 л каждая, одна из которых является контрольной, с содержанием нефти 2-2,5%. В опытные емкости с таким же содержанием нефти вносят 5 мл смеси культур и 30 г сухой формы. Образцы хранят при среднесуточной температуре 18°C.

Общее содержание нефтепродуктов измеряют согласно утвержденной методике для аппарата КН-2М. Результаты анализа представлены в Таблице №1.

Как видно из Таблицы №1, препарат обладает высокой способностью к утилизации нефтепродуктов в водной среде.

Пример №2. Сухую и жидкую форму препарата готовят согласно примеру №1.

Опытно-промышленные испытания препарата проводились на нефтеперерабатывающих заводах - МНПЗ г. Москва, ОНПЗ г. Омск.

Нефтешлам вывозится на специально подготовленный полигон в объеме 2500 м³. Весь объем нефтешлама равномерно распределяют по площадке слоем толщиной 20-25 см. В качестве разрыхлителя вносят 3-5% опилок.

Жидкую форму препарата объемом 100 л вносят в 10-кубовую емкость с водой. Распыляют на поверхность нефтешлама и проводят рыхление. Повторную обработку производят через 15 суток.

Вторую половину поля обрабатывают сухой формой препарата, которую готовят следующим образом.

В емкость с водой (10 м³) вносят 150 кг сухой формы препарата и барботируют в течение 10-15 часов, после чего распыляют по поверхности нефтешлама. Повторную обработку проводят через 10-15 суток.

Работы проводились в летнее время, суточное колебание температуры составило 15-33°C, влажность поддерживают на уровне 65-70%. В течение всего процесса рекультивации проводят двукратное разрыхление.

Из Таблицы №2 видно, что сухая и жидкая формы биопрепарата при опытно-промышленных испытаниях по утилизации нефтешламов показывают свою высокую эффективность.

Пример №3.

Сухую и жидкую форму биопрепарата готовят согласно примеру №1.

Опытно-промышленные испытания проводили на нефтеперерабатывающем заводе ОНПЗ «Газпром нефть» (г. Омск).

Нефтешлам вывозится на специально подготовленный полигон в объеме 2000 м³. Весь объем нефтешлама равномерно распределяют по площадке толщиной слоя 20-25 см в качестве разрыхлителя используют опилки.

Жидкую форму препарата объемом 100 л вносят в 10-кубовую емкость с водой.

Распыляют по поверхности нефтешлама и проводят рыхление. Повторную обработку производят через 15 суток.

Вторую половину поля обрабатывают сухой формой препарата, которую готовят к употреблению следующим образом. В емкость с водой (10 м³) вносят 150 кг сухой формы препарата и барботируют в течение 10-15 часов, после чего распыляют по поверхности нефтешлама. Повторную обработку проводят через 10-15 суток.

Работы проводились в летнее время, суточное колебание температуры составило 15-33°C, влажность поддерживалась на уровне 65-70%.

В течение всего процесса рекультивации проводят двукратное разрыхление.

Из Таблицы №3 видно, что сухая и жидкая формы биопрепарата при испытаниях по утилизации нефтешлама показывают высокую активность.

Из данных, приведенных в Таблицах №1, 2, 3, видно, что эффективность сухой формы препарата выше, чем жидкой формы. Данный факт объясняется тем, что глауконит используется в качестве сорбента для очистки нефтяных загрязнений.

Таким образом, создан эффективный препарат для очистки почв и водоемов от загрязнения нефтью и нефтепродуктами в объектах окружающей среды, а также переработки нефтешламов, и разработан способ его получения в жидкой и сухой формах.

Основным преимуществом предлагаемого препарата является его высокая эффективность при утилизации нефтешламов в опытно-промышленных масштабах.

В 2014-2015 годах в МНПЗ (Капотня) было успешно утилизовано более 250 тыс.тонн нефтешлама. В 2016 году препарат был успешно применен при рекультивации нефтезагрязненной почвы площадью более 200 га в районе города Нижневартовск.

1. Биопрепарат-нефтедеструктор, представляющий собой ассоциацию нефтеокисляющих почвенных микроорганизмов, отличающийся тем, что в качестве нефтеокисляющих почвенных микроорганизмов он содержит бактерии рода Bacillus atrophaeus ВКМ B-3137D, Pseudomonas putida ВКМ B-3136D, Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2764D, Arthrobacter sp.ВКМ Ac-2765D, Bacillus megaterium ВКМ B-3138D, выращенные при раздельном культивировании и смешанные в равном соотношении до общего содержания бактерий 15-20×10⁹ кл/мл.

2. Способ получения биопрепарата-нефтедеструктора по п. 1, включающий раздельное культивирование штаммов и приготовление микробной ассоциации смешиванием в одной емкости культуральных жидкостей штаммов, отличающийся тем, что в качестве микроорганизмов используют бактерии рода Bacillus atrophaeus ВКМ B-3137D, Pseudomonas putida ВКМ В-3136D, Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2764D, Arthrobacter sp. ВКМ Ac-2765D, Bacillus megaterium ВКМ B-3138D, смешанные в равном соотношении до общего содержания бактерий 15-20×10⁹ кл/мл, жидкую форму биопрепарата расфасовывают в полиэтиленовые емкости; для получения сухой формы биопрепарат концентрируют на микрофильтрационной установке до общего содержания бактерий 50-65×10⁹ кл/мл.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что сухую форму биопрепарата-нефтедеструктора получают методом контактно-сорбционного обезвоживания путем импульсного распыла концентрированной суспензии в смесителе на поверхность сухого минерала Глауконит с влажностью не более 2%, предварительно опудренной Аэросилом АМ-300 - 1.5-2% в соотношении, обеспечивающем обезвоживание биомассы культур до оптимальной величины активности воды A_w=0.2-0.3.