Способ выращивания факультативно-анаэробных микроорганизмов

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ выращивания факультативно-анаэробных микроорганизмов. Способ включает приготовление питательной среды с содержанием 0,3±0,1% агарозы и питательной среды с содержанием 1±0,1% агарозы, фильтрацию каждой среды через слой толщиной 0,4-0,5 см смеси порошкового древесного и животного угля, размещение питательной среды с содержанием 1±0,1% агарозы слоем в 2 мм на поверхности чипа, заполнение пор микропористой мембраны питательной средой с содержанием 0,3±0,1% агарозы и размещение мембраны на поверхности чипа. Далее на поверхность чипа наносят факультативно-анаэробные микроорганизмы и чип помещают в термостат. Изобретение обеспечивает сокращение времени выращивания факультативно-анаэробных микроорганизмов. 2 ил.

 

Изобретение относится к области профилактической медицины и может быть использовано для улучшения бактериологических исследований в чиповых микробиологических анализаторах.

Классическим методом изучения при бактериальных инфекциях является выращивание бактерий на питательных средах с последующим изучением их биологических свойств [Современная микробиология. Под ред. Й. Ленгерера, Г. Древса, г. Шлегеля. М. - 2005. - 288 с., Пиневич А.В. Микробиология. Биология прокариотов: Учебник. В 3 т. Том 2. СПб: Изд-во С.-Петерб. Ун-та. - 2007. - 331 с.], в том числе - чувствительность к антибиотикам. При этом посев биологического материала осуществляют на плотные и жидкие питательные среды [Методические указания. М: ФБУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора. - 2008. - 67 с., 6. Справочник бактериолога. 2-е издание, исправленное и дополненное. Москва - 2015. - 196 с.].

Использование плотных питательных сред, разлитых в чашки Петри, объясняется возможностью получения «чистой культуры» при пересевах изолированных колоний с первичных чашек [Приказ Роспотребнадзора от 17.03.08 №88 «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней»]. Видимый рост большинства факультативно-анаэробных микроорганизмов наблюдается на первичных чашках через 1-2 суток роста в условиях термостата [Гусев М.В., Минсеева Л.А. Метаболизм бактерий. М. - 1992. - 384 с.].

Использование для этого этапа чиповых технологий позволяет сократить время получения предварительного результата о росте бактерий до 6-8 часов. Однако универсальные питательные среды, используемые для посева биологического материала, имеют низкую прозрачность. При изучении бактерий, выросших в чашках Петри, этот показатель не имеет столь существенного значения, как при выращивании их в лунках пористой мембраны на чипе ростового модуля с последующим изучением формирующихся колоний под микроскопом [Шепелин А.П. Сравнительная оценка качества основных питательных сред отечественного и импортного производства. Астраханский медицинский журнал. - 2013. - №1. - С. 21-24, Шепелин А.П., Дятлов И.А. Роль и место микробиологии в решении вопросов модернизации здравоохранения. Аналитический обзор. - Протвино: А-принт ЗАО. - 2012. - 112 с.]. Более того, для успешного выращивания бактерий в порах мембраны из оксида алюминия в течение 6-8 часов необходимо обеспечить качественное заполнение мембранных пор питательной средой и возможность предотвратить высыхание верхней и нижней поверхностей мембраны, расположенных на чипе для выращивания.

Наиболее близким к заявляемому способу выращивания факультативно-анаэробных микроорганизмов является выращивание в чашках Петри с использованием плотных питательных сред (1,3-1,7% агарозы) [Шепелин И.А., Миронов А.Ю., Шепелин К.А. Питательные среды. МУК 4.2.2316-08 Методы контроля бактериологических питательных сред, NCCLS National consensus standard. Quolity control for commercially prepared microbiological culture media; Approved Standard M 22-A, v., 24, 3-rd ed., 1995. - 318 р.]. При этом результаты роста бактерий оцениваются через 16-24 часа визуальным способом, когда формируются уже зрелые колонии микроорганизмов и прозрачность питательной среды не имеет такого первостепенного значения, как при изучении на малой площади питательной среды ювенильных колоний (через 6-8 часов) при увеличении.

Изобретение направлено на разработку способа выращивания факультативно-анаэробных микроорганизмов с использованием питательных сред повышенной прозрачности, позволяющих получать в элементах чипа четкие результаты уже через 6-8 часов, т.е. сокращается время выращивания бактерий и повышается точность получаемого результата о виде бактерии.

По мнению авторов, существующие проблемы можно решить с помощью следующих шагов:

1) Для выращивания бактерий в мембранных порах питательную среду необходимо сделать прозрачной, чтобы при регистрации в проходящем свете с помощью микроскопа растущих колоний их очертания имели четкий контур, а цвет среды не искажал фон объекта микроскопии.

Содержание агарозы в среде для мембраны должно быть около 0,3±0,1% по агарозе, т.к. более плотная среда не успеет заполнить поры мембраны до ее загустения. Нижний слой агара (под мембраной) должен быть также с пониженным содержанием (около 1%), т.к. более плотная среда имеет меньшие прозрачность и скольжение по ней мембраны с биопробой.

Наилучшие результаты получены при использовании в качестве фильтра смеси порошкового древесного угля (производитель «Silcarbon» с размерами частиц порошкового активированного угля не более 0,18 мм) и животного угля (Производитель «Вектор» ГНЦ вирусологии и биотехнологии (Россия)) в соотношении 1:1 с толщиной слоя 0,4-0,5 см, размещенного на поверхности микрокрепированной крафт-бумаги (Performance white SE 80 g/m2, Billerud (Швеция)). При этом, помимо увеличения прозрачности среды, фильтрат освобождается от примеси токсичных для большинства видов бактерий жирных кислот.

2) Во избежание высыхания питательной среды в порах мембраны и для дополнительной подпитки бактерий мембрана с заполненными полужидкой средой (содержание 0,3±0,1% агарозы) порами диаметром 5 или 10 мкм накладывается на чип, покрытый слоем 2 мм питательной среды с содержанием 1±0,1% агарозы. При этом путем скольжения мембраны по поверхности чипа со средой достигается тесный контакт двух поверхностей: среды на чипе и мембраны с заполненными средой порами. После нанесения на верхнюю поверхность мембраны жидкой биологической пробы чип закрывается пластиковой крышкой, что способствует поддержанию влажности в ростовой камере и препятствует высыханию среды в порах мембраны до окончания инкубации в термостате при +37°С в течение 6-8 часов, а также создает условия для микроаэрации ростового блока.

Сущность предложенного изобретения сводится к следующему. Для выращивания факультативно-анаэробных микроорганизмов в термостате при +37°С готовят в двух вариантах питательную среду с содержанием 0,3±0,1% агарозы и с содержанием 1±0,1% агарозы для факультативно-анаэробных микроорганизмов. После приготовления среды фильтруют через слой смеси порошкового древесного и животного угля, размещенного на поверхности микрокрепированной крафт-бумаги. В качестве фильтра смеси используют смесь порошкового древесного угля и животного угля. Компоненты берут в соотношении 1:1 с толщиной слоя 0,4-0,5 см. Поры микропористой мембраны заполняют средой с содержанием 0,3±0,1% агарозы. Среду с содержанием 1±0,1% агарозы наливают на чип, на котором после застывания среды размещают пористую мембрану с диаметром пор 5 или 10 мкм, на поверхность которой наносят взвесь бактерий для проведения исследований.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фиг. 1 показан мясопептонный агар для выращивания бактерий разной степени прозрачности.

Лунка А1 - питательная среда, приготовленная по способу заявителя;

Лунка А2 - среда типа АГВ производства ГНЦПМБ г. Оболенск;

Лунка A3 - среда АГВ производства ЗАО НИЦФ;

Лунка А4 - среда АГВ производства г. Махачкала;

Лунка А5 - среда АГВ, приготовленная в лаборатории из отдельных ингредиентов по прописи.

Изобретение реализуется следующим образом.

Питательную среду для определения чувствительности к антибиотикам (среда АГВ производства г. Махачкала или среда типа АГВ производства ГНЦПМБ г. Оболенск) готовят в двух вариантах: для достижения плотности 0,3±0,1% и 1±0,1% агарозы. После закипания среды фильтруют через смеси порошкового древесного угля (производитель «Silcarbon» с размерами частиц порошкового активированного угля не более 0,18 мм) и животного угля (Производитель «Вектор» ГНЦ вирусологии и биотехнологии (Россия)) в соотношении 1:1 с толщиной слоя 0,4-0,5 см, размещенного на поверхности микрокрепированной крафт-бумаги (Performance white SE 80 g/m2, Billerud (Швеция)). После чего среды автоклавируют согласно инструкции к питательной среде. После остывания сред до 45°С к ним добавляют 10% очищенной сыворотки крупного рогатого скота. Среду с содержанием 1±0,1% агарозы наливают на поверхность чипа площадью 1 см2 слоем 2 мм, находящейся в стерильном ростовом модуле или стерильной пустой чашке Петри. Дают среде застыть. Тем временем в полужидкую среду с 0,3±0,1% агарозы в условиях ламинара опускают стерильный фрагмент пористой мембраны квадратной формы со стороной 0,5 см с соблюдением стерильности всех проводимых манипуляций. После заполнения мембранных пор (5-10 секунд) стерильным пинцетом достают мембрану, укладывают ее на поверхность чипа с плотной питательной средой. На поверхность мембраны наносят подготовленный жидкий образец изучаемой биопробы. Излишки жидкости отсасывают, используя стерильный наконечник на автоматическом дозаторе. Ростовой модуль закрывают пластиковой крышкой и помещают в термостат на 6-8 часов при 37°С.

Просмотр формирующихся колоний микроорганизмов осуществляют при открытой крышке ростового модуля под микроскопом при увеличении в 630 раз с использованием объектива для работы с объемным изображением. При этом на прозрачном фоне питательной среды четко видны контуры и внутреннее строение сформированных колоний микроорганизмов, имеющих отличительные особенности для представителей разных родов и семейств.

Примеры, подтверждающие результат от реализации способа, представлены в таблице на Фиг. 2.

Как видно из таблицы, представленной на Фиг. 2, среда №1 более прозрачна, чем среда №2 и №3. Поэтому на ее поверхности отчетливо просматриваются формирующиеся колонии бактерий, в которых можно определить, кроме размеров и формы, ее внутреннюю структуру, вплоть до единичных микроорганизмов. Использование более жидкой среды (0,3±0,13% агарозы) для заполнения пор мембраны позволяет заполнить их до момента остывания питательной среды, что дает возможность выращивать бактерии в образовавшихся лунках. При использовании более плотных сред поры мембран не успевают заполниться питательной средой до момента ее загустения, вследствие чего бактерии не могут расти на ее поверхности без питательных веществ. Комбинация двух сред позволяет выращивать колонии бактерий на плоскости в отдельных лунках в течение 6-8 часов.

Способ выращивания факультативно-анаэробных микроорганизмов в термостате при +37°С, отличающийся тем, что готовят в двух вариантах питательную среду с содержанием 0,3±0,1% агарозы и с содержанием 1±0,1% агарозы для факультативно-анаэробных микроорганизмов, после каждую указанную питательную среду фильтруют через слой смеси порошкового древесного и животного угля, размещенного на поверхности микрокрепированной крафт-бумаги, причем толщина слоя составляет 0,4-0,5 см, а соотношение в слое древесного угля и животного угля составляет 1:1, затем указанную питательную среду с содержанием 1±0,1% агарозы наливают слоем в 2 мм на поверхность чипа, при этом в питательную среду с содержанием 0,3±0,1% агарозы в условиях ламинара опускают стерильную микропористую мембрану для заполнения мембранных пор указанной средой, далее указанную мембрану после застывания питательной среды с содержанием 1±0,1% агарозы размещают на поверхности указанного чипа, на поверхность чипа наносят факультативно-анаэробные микроорганизмы и чип помещают в термостат.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ стимуляции активности грибов-биодеструкторов полимерных отходов.

Группа изобретений относится к бактериальным штаммам Clostridium ghonii, способным подавлять рост солидной злокачественной опухоли, вызывать регрессию и разрушение солидной злокачественной опухоли, а также их применению.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к рекомбинантной плазмидной ДНК pET31b-pHLIP. Указанная плазмидная ДНК кодирует аминокислотную последовательность рекомбинантного рН-зависимого встраивающегося пептида и обеспечивает его синтез в составе белка-слияния с кетостероидизомеразой.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в спиртовой промышленности. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, обладающий способностью продуцировать этанол, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ Y-4280.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены штаммы молочнокислых бактерий, обладающие антимикробной активностью (варианты); применение одного или более штаммов бактерий; композиция для лечения или предотвращения диареи у новорожденного млекопитающего, не являющегося человеком.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в спиртовой промышленности. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, обладающий способностью продуцировать этанол, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ Y-4281.

Группа изобретений включает: способ лечения бактериальной инфекции у ребенка, включающий пероральное введение эффективного количества композиции, содержащей пищевой продукт, матери указанного ребенка, в котором пищевой продукт был ферментирован посредством пробиотической бактерии Lactobacillus paracasei СВА L74, регистрационный номер в международном депозитарии LMG Р-24778, соответствующий способ профилактики или снижения тяжести бактериальной инфекции у ребенка; применение указанной пробиотической бактерии для получения пищевого продукта для лечения бактериальной инфекции у ребенка и применение указанной пробиотической бактерии для получения пищевого продукта для профилактики или снижения тяжести бактериальной инфекции у ребенка.

Изобретение относится к прикладной микробиологии, биотехнологии и микробиологической промышленности. Способ биосинтеза нуклеазы бактерий Serratia marcescens предусматривает добавление митомицина С в количестве 0,01-1,0 мг/л культуральной жидкости в период экспоненциального роста бактерий Serratia marcescens на среде LB.

Предложена группа изобретений: бесклеточная культуральная жидкость штамма бактерий Bacillus subtilis 3Н ВКПМ В-12758 и применение ее в качестве полифункционального средства для растений и консерванта для силоса.

Предложен штамм Pantoea agglomerans SGI-003-H11, депонированный как NRRL B-50483 и предназначенный для усиления роста и/или урожайности зернового культурного растения. Предложена также культура, предназначенная для получения растения с усиленным ростом и/или урожайностью и содержащая эффективное количество указанного штамма.

Изобретение относится к биохимии и вирусологии и касается способов и системы для упаковки репортерных молекул нуклеиновых кислот в нерепликативные трансдукторные частицы для использования в качестве репортерных молекул.

Изобретение относится к области микробиологии. Предложен способ получения трехмерных структур, используемых для детекции, выделения или подсчета микроорганизмов.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии. Способ получения питательной среды для транспортировки патологического материала, содержащего возбудитель некробактериоза животных, предусматривает получение фильтрата золотистого стафилококка путем высева суточной культуры золотистого стафилококка в мясопептонном бульоне с добавлением 10% хлорида натрия и культивирования в термостате при температуре 37°С в течение 8-10 дней с последующим инактивированием в водяной бане в течение 30 мин при температуре 90-95°С.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Способ получения питательной среды для выявления возбудителя некробактериоза животных предусматривает получение фильтрата культур стафиококка путем выращивания культур стафилокока на мясопептонном агаре с последующим культивированием в термостате при 37оС в течение 8-10 дней.

Группа изобретений относится к культуральной среде и способу для скрининга метициллин-резистентных Staphylococcus aureus (MRSA) в культуральной среде. Культуральная среда содержит комбинацию цефалоспоринов, выбранную из группы, состоящей из цефотетана (СТТ) и цефтриаксона (CRO); цефотетана (СТТ) и цефподоксима (CPD); цефсулодина (CFS) и цефтриаксона (CRO); цефсулодина (CFS) и цефепима (FEP); и цефотетана (СТТ) и цефтиофура (XLN).

Изобретение относится к области клинической микробиологии. Исследуемую культуру стафилококков выращивают в условиях постоянного встряхивания, в качестве контроля используют смесь бульона и культуры без лизоцима, проводят двукратное измерение оптической плотности опытных и контрольных лунок через 2 и 4 часа инкубации и об уровне антилизоцимной активности судят по степени выраженности признака у определенного штамма стафилококков, которую рассчитывают по формуле: где K - коэффициент антилизоцимной активности стафилококков; VК - объем бульонной культуры исследуемого штамма; VЛ - объем раствора лизоцима исходной концентрации; CЛ - концентрация лизоцима; MО4 - среднее значение оптической плотности опытных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма с лизоцимом через 4 часа инкубации, ед.

Изобретение относится к области биохимии и клинической микробиологии. Проводят выращивание золотистого стафилококка Staphylococcus aureus на питательной среде, содержащей желточно-солевой агар.
Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для определения адгезии золотистого стафилококка. Для этого исследуют чистую культуру золотистого стафилококка в концентрации 1 млрд/мл.
Изобретение относится к области микробиологии. .

Настоящее изобретение относится к биохимии и представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую основанный на FRET дальне-красный флуоресцентный биосенсор для измерения активности каспазы 3 внутри клеток, где аналитический сигнал флуоресцентного биосенсора представляет собой флуоресценцию в дальне-красной области спектра и в качестве акцептора выступает белок iRFP, а в качестве донора - дальне-красный флуоресцентный белок семейства GFP, где аминокислотная последовательность дальне-красного флуоресцентного биосенсора выбрана из группы SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ выращивания факультативно-анаэробных микроорганизмов. Способ включает приготовление питательной среды с содержанием 0,3±0,1 агарозы и питательной среды с содержанием 1±0,1 агарозы, фильтрацию каждой среды через слой толщиной 0,4-0,5 см смеси порошкового древесного и животного угля, размещение питательной среды с содержанием 1±0,1 агарозы слоем в 2 мм на поверхности чипа, заполнение пор микропористой мембраны питательной средой с содержанием 0,3±0,1 агарозы и размещение мембраны на поверхности чипа. Далее на поверхность чипа наносят факультативно-анаэробные микроорганизмы и чип помещают в термостат. Изобретение обеспечивает сокращение времени выращивания факультативно-анаэробных микроорганизмов. 2 ил.

Наверх