Питательная среда для укоренения побегов винограда в культуре in vitro

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для укоренения побегов винограда in vitro, содержащую аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый, железо сернокислое, этилендиаминотетраацетат натрия, борную кислоту, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, миоинозит, тиамин, пиридоксин, ИУК или ИМК, сахарозу, агар, воду, где оптимизированы соотношения макроэлементов и дополнительно содержатся натрий фосфорнокислый и кальций азотнокислый. Изобретение позволяет повысить количество и качество укорененных побегов и преодолеть сортовую специфику виноградного растения на этапе укоренения. 1 ил., 1 табл.

 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к биотехнологии, и может быть использовано в питомниководстве при получении оздоровленного посадочного материала при помощи методов клонального микроразмножения.

Известны питательные среды различного минерального состава, предназначенные для укоренения ягодных и плодовых растений in vitro (Алексеенко Л.В. Подбор питательных сред для клонального микроразмножения нейтральнодневных и ремонтантных сортов земляники. / Алексеенко Л.В., Высоцкий В.А. / Плодоводство и ягодоводство России: Сб. науч. работ / ВСТИСП. - М., 1997. - Т. IV. - C. 77-82, Шипунова А.А. Подбор минеральной основы питательных сред для клонального микроразмножения жимолости в производственных условиях. / Шипунова А.А., Высоцкий В.А. / Плодоводство и ягодоводство России: Сб. науч. работ / ВСТИСП. - М, 2001. Т. VII. С. 158-163).

Наиболее часто для укоренения побегов, полученных в культуре in vitro, исследователи используют половину макро- и микросолей по прописи, разработанной Мурасиге и Скуга (MS ½), (Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - vol. 5, 95 - P. 473-497).

Для наиболее эффективного ее применения исследователи практически всегда оптимизируют ее состав, изменяя гормональный фон или вводя различные добавки в виде аминокислот, витаминов, препаратов нового поколения (Белошапкина О.О. Использование биопрепаратов при клональном микроразмножении земляники/ Белошапкина О.О., Жаркова И.В. // Докл. ТСХА. - 2001. - №273, ч. 2. - С. 284-289). Значительно реже исследователи изменяют минеральный состав и, как правило, незначительно.

При этом следует отметить, что минеральный состав среды Мурасиге и Скуга (MS) плохо подходит для укоренения побегов, полученных in vitro, так как среда разрабатывалась для культивирования каллусов и каллусных клеток и учитывает, прежде всего, условия для их развития. Соотношение и концентрации макроэлементов в среде неоптимальные относительно потребности в них микрорастений винограда, что в процессе культивирования приводит к дисбалансу минеральных солей, сдвигу pH питательной среды и как следствие ухудшает параметры развития микрорастений винограда.

Наиболее часто применяемая среда для укоренения (MS ½) содержит следующие компоненты мг/л: NH4NO3 - 825; KNO3 - 950; KH2PO4 - 85; MgSO4*7H2O - 185 мг/л, CaCl2 - 220; FeSO4*7H2O - 13,4-13,8; Na2 ЭДТА 2Н2O - 18,5-18,9; Н3ВO3 - 3,0-3,2; MnSO4*4H2O - 11,0-11,4; ZnSO4*7H2O - 4,1-4,5; KJ - 0,40-0,44; Na2MoO4 - 0,11-0,15; CuSO4*5H2O - 0,011-0,015; CoCl2⋅6H2O - 0,011-0,015; миоинозит - 40-60; тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота по 0,2-0,3; аскорбиновая кислота 0,4-0,6; ИМК - 0,5-1,5; сахароза - 14000-16000; агар - 6000-8000; остальное бидистиллированная вода до 1 л; pH -5,5-5,9.

Наиболее близким к предлагаемому решению является питательная среда - Н2, разработанная для укоренения побегов винограда, полученных на этапе пролиферации (Голодрига П.Я. Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда/ВНИИВиПП «Магарач» (П.Я. Голодрига, В.А. Зленко, Л.А. Чекмарев), ИФР АН СССР (Р.Г. Бутенко), ИФР АН УССР (Б.А. Левенко), и др. - Ялта: Издательская группа ВНИИ ВиПП «Магарач», 1986 - 56 с.).

Прототип питательной среды содержит следующие компоненты мг/л: NH4NO3 - 210; KNO3 - 717; KH2PO4 - 68; MgSO4*7H2O - 233 мг/л, CaCl2 - 356; FeSO4*7H2O - 7,0; Na2 ЭДТА2O - 9,3; Н3ВO3 - 1,6; MnSO4*4H2O - 6,0; ZnSO4*7H2O - 2,2; KJ - 0,21; Na2MoO4 - 0,06; CuSO4*5H2O - 0,006; CoCl2⋅6H2O - 0,006; миоинозит - 50; никотиновая кислота - 0,2; ИУК - 0,1; феруловая кислота - 1,0; сахароза - 1000; агар - 7500; остальное бидистиллированная вода до 1 л; pH -5,6-5,8.

Недостатками данной среды для укоренения являются высокое содержание хлора, несбалансированность элементов по магнию и фосфору, а также низкое содержание хелата железа и микроэлементов (1/4 прописи МС), что при укоренении побегов негативно сказывается на регенерации корней и последующем развитии побегов и листьев. Кроме того, несбалансированное содержание макроэлементов часто провоцирует рост каллусной ткани и преждевременное старение эксплантов.

Задача, на решение которой направлено изобретение, является повышение количества и качества укорененных побегов и преодоление сортовой специфики виноградного растения на этапе укоренения.

Задача, на решение которой направлено изобретение, решается оптимизацией концентрации и соотношением макросолей, входящих в состав питательной среды: NH4NO3 уменьшается до 150 мг/л; KNO3 - 750 мг/л; уровень содержания фосфора в среде возрастает в два раза, при этом KH2PO4 заменяется на NaH2PO4 -140 мг/л; MgSO4⋅7H2O - 220 мг/л, основным источником кальция в среде становиться Ca(NO3)2⋅4H2O - 400 мг/л; CaCl2 - 25 мг. Остальные компоненты питательной среды добавляются в следующем количестве мг/л: FeSO4⋅7H2O - 27,8÷30,0; Na2ЭДТА⋅2Н2O - 37,3÷40,0; Н3ВO3 - 6,0÷6,4; MnSO4⋅4H2O÷22,0-22,6; ZnSO4⋅7H2O - 8,0÷9,2; KJ 0,80÷0,90; Na2MoO4 - 0,2÷0,3; CuSO4⋅5H2O - 0,02÷0,03; CoCl2⋅6H2O - 0,02÷0,03; миоинозит - 50÷70; тиамин, пиридоксин, по 0,2÷0,5; в качестве ауксина добавляется ИМК или ИУК - 0,1÷0,2; сахароза - 10000; агар - 6000; остальное бидистиллированная вода до 1000; pH - 5,6÷5,8.

Заявленное решение отличается от прототипа и (1/2 МС) не только меньшим содержанием солей NH4NO3 и CaCl2, но и заменой фосфорнокислого калия на фосфорнокислый натрий. На Фиг. 1 представлены сравнительные характеристики разработанной питательной среды и прототипа по концентрации макроэлементов по действующему веществу (д.в.).

Заявленное решение отличается от прототипа и наиболее часто применяемой среды ½ МС тем, что: в 1,5 и 4,0 раза соответственно снижено содержание аммиачной формы азота, в 14,6 и 8,8 раза снижено содержание хлора, источник фосфора KH2PO4 заменен на NaH2PO4, при этом являясь источником Na, эта соль способствует повышению буферности питательной среды, предотвращая снижение ее pH. Изменен основной источник кальция в среде с CaCl2 на Ca(NO3)2*4H2O. Кроме того, хелат железа и микроэлементы в предлагаемой среде даны по прописи МС в полном объеме. Все это положительно влияет на укоренение побегов и рост образовавшихся микрорастений в культуре in vitro. Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявленного решения критерию "новизна".

Заявленное решение обладает изобретательским уровнем, так как не является очевидным для специалистов питомниководов и биотехнологов, а является продуктом творческой деятельности автора изобретения.

Заявленное техническое решение соответствует и другому требуемому критерию изобретения - промышленному применению, что подтверждено экспериментальными данными, полученными при реализации способа.

Пример осуществления способа

В питательную среду вносят следующие компоненты (концентрации в мг), макроэлементы: NH4NO3 - 150; KNO3 - 750; NaH2PO4⋅140; MgSO4⋅7H2O - 220, Ca(NO3)2⋅4H2O - 400; CaCl2 - 25; Мезоэлементы: FeSO4⋅7H2O - 27,8-30,0; Na2ЭДТА⋅2H2O - 37,3-40,0; микроэлементы: H3BO3 - 6,0-6,4; MnSO4⋅4H2O - 22,0-22,6; ZnSO4⋅7H2O - 8,0-9,2; KJ - 0,80-0,90; Na2MoO4 - 0,2-0,3; CuSO4⋅5H2O - 0,02-0,03; CoCl2⋅6H2O - 0,02-0,03; витамины: миоинозит - 50-70; тиамин и пиридоксин, по 0,2-0,5 мг/л; 6-бензиламинопурин 0,2-0,5; сахароза - 10000; агар - 6000; остальное бидистиллированная вода до 1000,0.

В начале объем раствора доводят до 0,5 л, устанавливают pH 5,6-5,8 и добавляют 0,5 л воды с агаром, предварительно нагретой до кипения, для полного расплавления и растворения агара. Питательную среду разливают по сосудам и автоклавируют при давлении 0,7-1,0 атм. (температура 119-121°C) в течение 20-25 мин. После остывания среды осуществляют высадку срезанных с этапа пролиферации побегов.

Испытание разработанной прописи питательной среды показало эффективность ее применения на всех сортах, учувствовавших в испытании. Влияние разработанной питательной среды, для укоренения срезанных с пролиферации побегов, на их рост и развитие через 70 дней, 2016 г. представлено в Табл. 1

Как видно из представленных данных в варианте, где для укоренения побегов примененяли разработанную пропись питательной среды, укореняемость микропобегов была лучше, стабильно улучшалось их развитие, а также снижалось число отбракованных эксплантов из-за некроза или отсутствия развития. При этом положительный эффект получен на всех подопытных сортах. Особенно заметный эффект был на сортах, которые при использовании прототипа регенерировали слабо, проявляя сортовую специфичность.

Таким образом, установлено, что заметное снижение концентраций некоторых макросолей (NH4NO3, CaCl2), с одновременной оптимизацией их соотношений в питательной среде с другими макросолями, замена соли KH2PO4 на NaH2PO4 на фоне применения стандартной (не уменьшенной) прописи микроэлементов и хелата железа по Мурасиге и Скуга, заметно повышает процессы регенерации и развития микрорастений на этапе укоренения побегов.

Использование предложенной питательной среды для укоренения микропобегов винограда в условиях in vitro обеспечивает по сравнению с существующей следующие преимущества:

1. Повышает количество укоренных побегов винограда in vitro, срезанных с этапа пролиферации, и соответственно выход укорененных микрорастений в среднем на 20,0-30,0%. Соответственно снижает количество отбракованных эксплантов из-за некроза и отсутствия развития.

2. Заметно улучшает развитие микрорастений винограда, ростовые процессы при этом ускоряются минимум в два раза.

3. В разработанной питательной среде для достижения значительного положительного эффекта предусмотрено использование стандартных и общепринятых (в клональном микроразмножении растений) компонентов и не требуется дополнительно применение редких или малоизученных физиологически активных веществ.

Питательная среда для укоренения побегов винограда in vitro, содержащая аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый, железо сернокислое, этилендиаминотетраацетат натрия, борную кислоту, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, миоинозит, тиамин, пиридоксин, ИУК или ИМК, сахарозу, агар, воду, отличающаяся оптимизированным соотношением макроэлементов, и дополнительным содержанием натрия фосфорнокислого и кальция азотнокислого, при следующем соотношении компонентов, мг/л:

Аммоний азотнокислый 100-150

Калий азотнокислый 700-750

Кальций азотнокислый 350-400

Кальций хлористый 50-70

Магний сернокислый 200-250

Натрий фосфорнокислый 100-150

Железо сернокислое 27,8-30,0

Этилендиаминотетраацетат натрия 37,3-40,0

Борная кислота 6,0-6,4

Марганец сернокислый 22,0-22,6

Цинк сернокислый 8,0-9,2

Калий йодистый 0,70-0,90

Натрий молибденовокислый 0,2-0,3

Медь сернокислая 0,02-0,03

Кобальт хлористый 0,02-0,03

Миоинозит 50-70

Тиамин 0,2-0,5

Пиридоксин 0,2-0,5

ИУК или ИМК - 0,1-0,2.

Сахароза 8000-12000

Агар 5500-6500

Вода Остальное до 1,0 л



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ стерилизации эксплантов осины in vitro, включающий заготовку одревесневших побегов взрослых деревьев в марте-апреле, выгонку молодых растущих побегов, их поэтапную экспозицию в хлорсодержащих агентах, таких как 2% раствор «Domestos» в течение 8 минут и 10% раствор «Аламинол» в течение 10 минут.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения микроклубней картофеля in vitro, включающий черенкование пробирочных растений и высадку одноузловых черенков на агаризованную питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы и витамины на основе прописи питательной среды Мурасиге и Скуга, Fe-хелат, агар-агар, сахарозу.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения иммунноустойчивых образцов картофеля in vitro на аэрогидропонике, включающий орошение оснований черенков регенерантов, где в качестве питательного раствора вводят водный препарат Флорон в концентрации 0,5% с добавлением пектина в концентрации 0,3-0,4% водного раствора Флорона, причем, пектин готовят из кортофельных очисток оздоровленных клубней того же сорта или гибрида размножаемых регенерантов.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения безвирусного посадочного материала картофеля ценных сортов, заключающийся в том, что проводят прививку поделенных на части микро- и мини-клубней картофеля ценного сорта после предварительного обеззараживания, подсушивания и удаления с клубня-няньки картофеля обычного сорта всех глазков, проводят прививку на клубень-няньку путем прижатия фрагментов микро- и мини-клубней к местам удаленных глазков с последующим подсушиванием, обеззараживанием среза вокруг прививки и дальнейшим культивированием в условиях in vivo.
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян вздутоплодника перекисью водорода в течение 5 мин, ополаскивание, трехкратное отмывание в течение 5 мин в дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава: NH4NO3 1650,000±2,0000 мг, KNO3 1900,000±2,0000 мг, MgSO4×7H2O 370,000±1,0000 мг, KH2PO4 170,000±0,1000 мг, CaCl2×2H2O 440,000±0,5000 мг, Н3ВО3 6,200±0,0100 мг, MnSO4×4H2O 22,300±0,0200 мг, ZnSO4×7H2O 8,600±0,0100 мг, KI 0,830±0,0010 мг, Na2MoO4×2H2O 0,250±0,0010 мг, CuSO4×5H2O 0,025±0,0001 мг, CoCl2×6H2O 0,025±0,0001 мг, FeSO4×7H2O 2,785±0,001 мг, Na-ЭДТА 3,725±0,001 мг, тиамин 0,100±0,0010 мг, пиридоксин 0,100±0,0010 мг, сахароза 30000,000±100,0000 мг, вода 1000 мл, агар 5000 мг, дальнейшее помещение растений, полученных in vitro, в аналогичную питательную среду с добавлением ауксина, при этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели, при пересеве используют 1/3 адвентивных корней, полученные адвентивные корни выращивают в течение более тридцати циклов.

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения эндемика Маньчжурского флористического района Aristolochia manshuriensis Kom., включающий вычленение апикальных и латеральных почек, стерилизацию гипохлоритом натрия (экспозиция 7-10 мин), высаживание на питательные среды MS с добавлением 0,8 мг/л 6-ВАР и 0,05 мг/л ИУК, размножение микропобегов, их последующее укоренение на среде MS, содержащей 20 мг/л сахарозы и ИМК в концентрации 3-5 мг/л, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro посредством высаживания на смесь песка, торфа и дерновой листовой земли в соотношении 1:1:1, предварительно простерилизованной при 85-90°С в течение 1-2 ч.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения иван-чая узколистного Chamaenerion angustifolium L.Holub, включающий вычленение пазушных меристем, стерилизацию эксплантов 7%-ным гипохлоритом кальция в течение 7 минут, высаживание на питательные среды MS с добавлением 6-ВАР в количестве 0,5 мг/л и MS с добавлением FeSO4⋅7H2O в количестве 30 мл/л, 6-ВАР в количестве 0,5 мг/л, IAA в количестве 0,01 мг/л, размножение микропобегов, их последующее укоренение на среде MS, дополненной 1 мг/л IBA, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ сохранения ювенильного статуса культуры in vitro малины (Rubus idaeus), включающий перенос микрорастений малины на стадиях мультипликации или укоренения на питательные среды в условиях с пониженным уровнем освещенности и пониженной температурой, где смена освещенности и температуры происходит через 5 дней на стадии мультипликации и через 14 дней на стадии укоренения после начала очередного пассажа культивирования, при этом в качестве питательной среды на стадии мультипликации используют питательную среду MS с добавлением сахарозы 30 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, 6-БАП 0,8 мг/л и зеатина 0,1 мг/л, а на стадии укоренения в качестве питательной среды используют питательную среду 1/2 QL с добавлением сахарозы 20 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, индолилмасляной кислоты (ИМК) 0,1 мг/л, ИУК 0,1 мг/л, при этом уровень интенсивности освещенности снижается до 1000±200 люкс, а температура - до 4-8°С.

Изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано в питомниководстве для производства посадочного материала с помощью технологии клонального микроразмножения.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к картофелеводству. Способ включает получение оздоровленных растений картофеля для черенкования (промежуточный продукт), мини-клубней картофеля (промежуточный продукт), клубней супер – суперэлиты (промежуточный продукт), клубней суперэлиты (промежуточный продукт), клубней элиты (промежуточный продукт), клубней первой полевой репродукции (конечный продукт).

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для укоренения побегов винограда in vitro, содержащую аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый, железо сернокислое, этилендиаминотетраацетат натрия, борную кислоту, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, миоинозит, тиамин, пиридоксин, ИУК или ИМК, сахарозу, агар, воду, где оптимизированы соотношения макроэлементов и дополнительно содержатся натрий фосфорнокислый и кальций азотнокислый. Изобретение позволяет повысить количество и качество укорененных побегов и преодолеть сортовую специфику виноградного растения на этапе укоренения. 1 ил., 1 табл.

Наверх