Способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (phlojodicarpus sibiricus (steph.) к.-pol.) в условиях in vitro

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян вздутоплодника перекисью водорода в течение 5 мин, ополаскивание, трехкратное отмывание в течение 5 мин в дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава: NH4NO3 1650,000±2,0000 мг, KNO3 1900,000±2,0000 мг, MgSO4×7H2O 370,000±1,0000 мг, KH2PO4 170,000±0,1000 мг, CaCl2×2H2O 440,000±0,5000 мг, Н3ВО3 6,200±0,0100 мг, MnSO4×4H2O 22,300±0,0200 мг, ZnSO4×7H2O 8,600±0,0100 мг, KI 0,830±0,0010 мг, Na2MoO4×2H2O 0,250±0,0010 мг, CuSO4×5H2O 0,025±0,0001 мг, CoCl2×6H2O 0,025±0,0001 мг, FeSO4×7H2O 2,785±0,001 мг, Na-ЭДТА 3,725±0,001 мг, тиамин 0,100±0,0010 мг, пиридоксин 0,100±0,0010 мг, сахароза 30000,000±100,0000 мг, вода 1000 мл, агар 5000 мг, дальнейшее помещение растений, полученных in vitro, в аналогичную питательную среду с добавлением ауксина, при этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели, при пересеве используют 1/3 адвентивных корней, полученные адвентивные корни выращивают в течение более тридцати циклов. Изобретение позволяет получить адвентивные корни вздутоплодника сибирского в условиях in vitro с отсутствием сезонной зависимости их получения. 1 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, культивированию корней растения вздутоплодника сибирского, и может быть использовано для получения ценных биологически активных соединений – пиранокумаринов, которые широко используются в фармацевтической промышленности.

Вздутоплодник сибирский зарегистрирован в Государственном Реестре лекарственных средств РФ в качестве лекарственного растительного сырья. Его корневища и корни обладают вазодилатирующими (сосудорасширяющими), гипотензивными, адренолитическими и спазмолитическими свойствами. Используется при производстве препаратов спазмолитического действия «Димидин» и «Фловерин», а также комплексного препарата сердечно-сосудистого действия «Сафинор».

При этом известно, что вздутоплодник сибирский занесен в Красную книгу Якутии. Заготовка растения в природе может привести к уничтожению природных популяций.

Кроме того, корни растения вздутоплодника накапливают тяжелые металлы: цинк, никель, селен и молибден, соответственно использование растений, произрастающих на не контролируемых участках, несет большой риск для здоровья человека (см. Алексеева С.И. Перспективы получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского // Экспериментальная биология растений: фундаментальные и прикладные аспекты: Годичное собрание ОФР, науч. конф. и школа для мол. уч., 18-24 сент. 2017 г., Судак: сб. мат. докл. / Отв. ред. Вл.В. Кузнецов. – М: Изд-во АНО «Центр содействия научной, образовательной и просветительской деятельности «Соцветие», 2017. - 393 с).

Вздутоплодник сибирский растет по склонам сопок, в танацетовых степях и среди разнотравья лесостепей, в моховолишайниковой тундре и в сухих руслах рек (см. Макаров А.А. Лекарственные растения Якутии: 4-е изд. / А.А.Макаров. – Якутск: Бичик, 2001. – 128 с.). Ареал произрастания вздутоплодника сибирского делят на три фрагмента: селенгинский, даурский и забайкальский. Также существуют отдельные очаги произрастания растения в Красноярском крае, Читинской и Иркутской области, в Якутии и на западе Амурской области. Основные запасы лекарственного сырья вздутоплодника сибирского находятся в Читинской области.

Корни и корневища вздутоплодника сибирского содержат кумарины и пиранокумарины (винсадин и дигидросамидин, изофлоидикарпин, скополетин, умбеллиферон), эфирные масла, гликозиды (мениантин и мелиатин), флавоновые гликозиды (рутин, гиперозид), уксусная и изовалериановая кислота, крахмал. Эфирное масло вздутоплодника сибирского в качестве основных компонентов содержит: лимонен, у-терпинен, терпинолен, спатуленол, гермакрен D, виридифлорол, ß-барбатен, 5-кадинен и ß-акорадиен. Растение концентрирует железо, цинк, никель, селен и молибден (см. Макаров А.А. Лекарственные растения Якутии: 4-е изд. / А.А.Макаров. – Якутск: Бичик, 2001. – 128 с.).

Авторами не установлены данные о получении адвентивных корней in vitro вздутоплодника сибирского.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) с характерными морфологическими параметрами и отсутствием сезонной зависимости их получения.

Поставленная задача решена тем, что получен штамм адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) в условиях in vitro.

Анализ признаков заявленного решения свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна», штамм адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) впервые получен в условиях in vitro.

Предлагаемое решение состоит в том, что за основу взяты растения in vitro вздутоплодника сибирского, которые помещают в агаризованную питательную среду соответствующего гормонального состава в качестве экспланта. В результате был получен штамм адвентивных корней.

Причем, для получения растения in vitro в качестве эксплантов используют зрелые семена вздутоплодника. Семена стерилизуют перекисью водорода (H2O2) в течение 5 мин. После стерилизации материал ополаскивают, а затем трехкратно отмывают в течение 5 мин в дистиллированной стерильной воде. Стерильные семена помещают на твердую питательную среду без гормонов.

Для экспериментов используют твердую питательную среду следующего состава:

NH4NO3 1650,000 ±2,0000 мг
KNO3 1900,000 ±2,0000 мг
MgSO4x7H2O 370,000 ±1,0000 мг
KH2PO4 170,000 ±0,1000 мг
CaCl2x2H2O 440,000 ±0,5000 мг
H3BO3 6,200 ±0,0100 мг
MnSO4x4H2O 22,300 ±0,0200 мг
ZnSO4x7H2O 8,600 ±0,0100 мг
KI 0,830 ±0,0010 мг
Na2MoO4x2H2O 0,250 ±0,0010 мг
CuSO4x5H2O 0,025 ±0,0001 мг
CoCl2x6H2O 0,025 ±0,0001 мг
FeSO4x7H2O 2,785 ± 0,001 мг
Na-ЭДТА 3,725 ±0,001 мг
Тиамин 0,100 ±0,0010 мг
Пиридоксин 0,100 ±0,0010 мг
Сахароза 30000,000 ±100,0000 мг
Вода 1000 мл
Агар 5000 мг

Полученную в результате растение in vitro помещают в аналогичную питательную среду с добавлением ауксина.

Культивирование проводят в темноте, при 26±1°С, влажности помещения 70±5%, в чашках Петри с диаметром 90 мм. Цикл субкультивирования составляет 4 недели. При пересеве используют 1/3 адвентивных корней.

Полученные адвентивные корни выращивают в течение более тридцати циклов. В процессе культивирования определяют морфологические характеристики.

Штамм (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) ВС-1 идентифицирован и депонирован в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН, 127276, Москва, И-276, ул. Ботаническая, 35.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки: корни имеют одинаковые ответвления, темно-оранжевой окраски.

Индекс роста (кратность прироста биомассы за одно субкультивирование) определяют по сырому и сухому весу биомассы. Для определения веса сырой биомассы корней отделяют от среды культивирования на бумажных фильтрах на вакуумном насосе, промывают водой и взвешивают. Сухую биомассу корней получают после лиофильной сушки.

При анализе представленных кривых роста следует отметить замедление роста на 25 сутки культивирования, что позволяет использовать 4-недельный цикл выращивания. Ростовые параметры (кроме индекса роста) рассчитывали по сухому весу биомассы. Результаты представлены в таблице и свидетельствуют о наличии стабильных ростовых характеристик.

Таким образом, выявлен способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) из семян через растения in vitro, обладающие стабильными ростовыми параметрами и морфологическими характеристиками, причем, получение соединений может быть выполнено вне сезонной зависимости производства.

Таблица

Ростовые параметры адвентивных корней вздутоплодника сибирского

Показатели Значения
Индексы роста по:
весу сухой биомассы
весу сырой биомассы
5±0,5
5±0,5
Удельная скорость роста, сут-1 0,12 ±0,05
Время удвоения, сут. 12 ±2

Способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян вздутоплодника перекисью водорода в течение 5 мин, ополаскивание, трехкратное отмывание в течение 5 мин в дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава:

NH4NO3 1650,000±2,0000 мг,
KNO3 1900,000±2,0000 мг,
MgSO4×7H2O 370,000±1,0000 мг,
KH2PO4 170,000±0,1000 мг,
CaCl2×2H2O 440,000±0,5000 мг,
Н3ВО3 6,200±0,0100 мг,
MnSO4×4H2O 22,300±0,0200 мг,
ZnSO4×7H2O 8,600±0,0100 мг,
KI 0,830±0,0010 мг,
Na2MoO4×2H2O 0,250±0,0010 мг,
CuSO4×5H2O 0,025±0,0001 мг,
CoCl2×6H2O 0,025±0,0001 мг,
FeSO4×7H2O 2,785±0,001 мг,
Na-ЭДТА 3,725±0,001 мг,
тиамин 0,100±0,0010 мг,
пиридоксин 0,100±0,0010 мг,
сахароза 30000,000±100,0000 мг,
вода 1000 мл,
агар 5000 мг,

дальнейшее помещение растений, полученных in vitro, в аналогичную питательную среду с добавлением ауксина, при этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели, при пересеве используют 1/3 адвентивных корней, полученные адвентивные корни выращивают в течение более тридцати циклов.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения эндемика Маньчжурского флористического района Aristolochia manshuriensis Kom., включающий вычленение апикальных и латеральных почек, стерилизацию гипохлоритом натрия (экспозиция 7-10 мин), высаживание на питательные среды MS с добавлением 0,8 мг/л 6-ВАР и 0,05 мг/л ИУК, размножение микропобегов, их последующее укоренение на среде MS, содержащей 20 мг/л сахарозы и ИМК в концентрации 3-5 мг/л, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro посредством высаживания на смесь песка, торфа и дерновой листовой земли в соотношении 1:1:1, предварительно простерилизованной при 85-90°С в течение 1-2 ч.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения иван-чая узколистного Chamaenerion angustifolium L.Holub, включающий вычленение пазушных меристем, стерилизацию эксплантов 7%-ным гипохлоритом кальция в течение 7 минут, высаживание на питательные среды MS с добавлением 6-ВАР в количестве 0,5 мг/л и MS с добавлением FeSO4⋅7H2O в количестве 30 мл/л, 6-ВАР в количестве 0,5 мг/л, IAA в количестве 0,01 мг/л, размножение микропобегов, их последующее укоренение на среде MS, дополненной 1 мг/л IBA, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ сохранения ювенильного статуса культуры in vitro малины (Rubus idaeus), включающий перенос микрорастений малины на стадиях мультипликации или укоренения на питательные среды в условиях с пониженным уровнем освещенности и пониженной температурой, где смена освещенности и температуры происходит через 5 дней на стадии мультипликации и через 14 дней на стадии укоренения после начала очередного пассажа культивирования, при этом в качестве питательной среды на стадии мультипликации используют питательную среду MS с добавлением сахарозы 30 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, 6-БАП 0,8 мг/л и зеатина 0,1 мг/л, а на стадии укоренения в качестве питательной среды используют питательную среду 1/2 QL с добавлением сахарозы 20 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, индолилмасляной кислоты (ИМК) 0,1 мг/л, ИУК 0,1 мг/л, при этом уровень интенсивности освещенности снижается до 1000±200 люкс, а температура - до 4-8°С.

Изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано в питомниководстве для производства посадочного материала с помощью технологии клонального микроразмножения.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к картофелеводству. Способ включает получение оздоровленных растений картофеля для черенкования (промежуточный продукт), мини-клубней картофеля (промежуточный продукт), клубней супер – суперэлиты (промежуточный продукт), клубней суперэлиты (промежуточный продукт), клубней элиты (промежуточный продукт), клубней первой полевой репродукции (конечный продукт).

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения алычи in vitro, включающий культивирование микропобегов алычи на этапе мультипликации на среде QL с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, БАП 0,5-2 мг/л и зеатина 0,05-1 мг/л, укоренение микропобегов на половинной по макросолям среде QL с добавлением сахарозы 20 г/л, агар-агара 9 г/л, ИУК 0,1-1 мг/л и/или ИМК 0,1-1 мг/л, и/или НУК 0,1-1 мг/л, при этом этап мультипликации проводят в два пассажа по три недели каждый, причем на второй пассаж переносят целые конгломераты почек и побегов без разделения, а этап укоренения проводят в течение первых 2-7 суток в темноте, а затем - 1-2 недели на свету.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к кукурузному продукту, содержащему семя кукурузы от растения кукурузы, несущего генотип коричневой центральной жилки 3 (bm3) в гомозиготном состоянии и генотип мучнистости-2 (fl2) в гомозиготном состоянии.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ, включающий индукцию микропобегов непосредственно из апикальной недифференцированной ткани вегетативных почек экспланта на агаризованной среде, содержащей минеральную основу по Мурасиге-Скуга и дополнительно включающей 0,25-2,0 мг/л БАП, 20-30 г/л сахарозы, 6 г/л агара.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к биотехнологии. Способ включает высадку микрорастений на пластиковые поддоны, покрытые лутрасилом с предварительно выполненными в нем посадочными отверстиями, путем погружения корневой системы растений в водный антисептический раствор с последующим обеспечением проточной циркуляции воды в поддоне и верхнего мелкодисперсного увлажнения растений.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ микроклонального размножения картофеля, при котором выделяют апикальные этиолированные проростки (1-1,5 см), стерилизуют в 0,3%-ном растворе диацида в течение 3-5 минут с последующей трехкратной промывкой стерильной H2O, культивируют меристемы, получают оздоровленные растения, проводят микрочеренкование, черенки вносят в стеклянные банки с металлической крышкой.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского K.-Pol.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян вздутоплодника перекисью водорода в течение 5 мин, ополаскивание, трехкратное отмывание в течение 5 мин в дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава: NH4NO3 1650,000±2,0000 мг, KNO3 1900,000±2,0000 мг, MgSO4×7H2O 370,000±1,0000 мг, KH2PO4 170,000±0,1000 мг, CaCl2×2H2O 440,000±0,5000 мг, Н3ВО3 6,200±0,0100 мг, MnSO4×4H2O 22,300±0,0200 мг, ZnSO4×7H2O 8,600±0,0100 мг, KI 0,830±0,0010 мг, Na2MoO4×2H2O 0,250±0,0010 мг, CuSO4×5H2O 0,025±0,0001 мг, CoCl2×6H2O 0,025±0,0001 мг, FeSO4×7H2O 2,785±0,001 мг, Na-ЭДТА 3,725±0,001 мг, тиамин 0,100±0,0010 мг, пиридоксин 0,100±0,0010 мг, сахароза 30000,000±100,0000 мг, вода 1000 мл, агар 5000 мг, дальнейшее помещение растений, полученных in vitro, в аналогичную питательную среду с добавлением ауксина, при этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5, цикл субкультивирования составляет 4 недели, при пересеве используют 13 адвентивных корней, полученные адвентивные корни выращивают в течение более тридцати циклов. Изобретение позволяет получить адвентивные корни вздутоплодника сибирского в условиях in vitro с отсутствием сезонной зависимости их получения. 1 табл.

Наверх