Способ количественного определения антиоксидантной активности пептидов

Изобретение относится к определениям и испытаниям, а именно к способу определения антиоксидантной активности пептидов животного происхождения. Способ количественного определения антиоксидантной активности пептидов животного происхождения включает спектрофотометрическое определение оптической плотности продукта реакции изучаемых пептидов с 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом (DPPH) в органическом растворителе, выбранном из группы, включающей метанол, этанол, изопропанол, ацетон и метилэтилкетон, определение оптической плотности продукта реакции референтного пептидного антиоксиданта природного происхождения L-глутатиона восстановленного (GSH) с 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом и расчет антиоксидантной активности изучаемых пептидов как глутатионэквивалентной антиоксидантной активности GSHEAC (GSH equivalent antioxidant capacity), представляющей собой отношение концентрации L-глутатиона, при которой прореагировало 50% DPPH, к концентрации изучаемой субстанции, при которой прореагировало 50% DPPH. 4 табл.

 

Заявляемое изобретение относится к определениям и испытаниям, а именно к способу определения антиоксидантной активности пептидов животного происхождения, и, в частности, комплекса биорегуляторных пептидов, выделяемых из простаты крупного рогатого скота. Указанные пептиды широко применяются при лечении, например, хронического абактериального простатита (ХАП), доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ) и сопутствующих нарушений сперматогенеза.

Изменения морфологического и функционального характера в предстательной железе, возникающие вследствие венозного застоя в малом тазу и задержки оттока секрета, способствуют активации процессов перекисного окисления липидов, это ведет к снижению собственного антиокислительного потенциала органа. В литературе имеются сообщения о снижении в предстательной железе больных ХАП активности каталазы и супероксиддиссмутазы, и, соответственно, повышении содержания продуктов свободнорадикального повреждения ДНК [R. Olinski, Т.Н. Zastawny, М. Foksinski, et al., Free Radic. Biol. Med., 18(4), 807-813 (1995)]. Использование препаратов антиоксидантной направленности в составе традиционной схемы лечения хронического простатита привело к снижению воспаления и улучшению количества и морфологии сперматозоидов.

Комплекс биорегуляторных пептидов, имеющих в своем составе аминокислоты с ароматическими боковыми радикалами, обладает антиоксидантной активностью. Исследование специфической активности этого препарата через оценку его антиоксидантной активности (АОА) находится в полном соответствии со способом его получения и составом. Одним из способов оценки АОА является колориметрия свободных радикалов, основанная на реакции DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (C18H12N5O6, M=394,33), растворенного в метаноле, с образцом антиоксиданта (АН) по схеме:

DPPH⋅+АН→DPPH-H+А⋅

Раствор DPPH в метаноле (или в другом органическом растворителе, таком как спирты этиловый и изопропиловый, ацетон, метилэтилкетон) имеет выраженную пурпурно-синюю окраску. В результате восстановления DPPH антиоксидантом пурпурно-синяя окраска исчезает; реакция контролируется спектрофотометрически по изменению оптической плотности при длине волны 515-517 нм.

Известен качественный способ идентификации пептидов, выделенных из растительных гидролизатов, и обладающих антиоксидантными свойствами [Zhang QX, Wu Н, Ling YF, Lu RR. J. Dairy Res. 2013 Aug; 80(3), pp. 367-73] с помощью DPPH. Однако в приведенной работе не предполагалось количественной оценки АОА указанных соединений.

Также известен способ оценки антиоксидантных свойств пептидов, выделенных из гидролизата овумуцина [Chang OK, На GE, Han GS, et al, J. Agric. Food Chem. 2013, 61(30), рр. 7294-7300]. Активность двух выделенных пептидов была оценена в % к активности DPPH, но количественная оценка активности не проводилась.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ определения антиоксидантной активности, описанный в работе [Xueqin Wang at al. Hindawi Pablishing Corporation BioMed Research International Volume 2017, Article ID 6837285]. Согласно этому способу, оценивают технологический процесс выделения биологически активных пептидов из морских рыб, причем антиоксидантную активность полупродуктов оценивают, связывая их 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом. Однако в указанном способе не различается и не исследуется взаимосвязь между количеством полученных биологически активных пептидов и их антирадикальной активностью.

Результатом, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, является разработка точной, достоверной, воспроизводимой и адекватной исследуемой патологии оценки антиоксидантной активности лекарственных средств на основе экстрактов из органов и тканей животных, содержащих водорастворимые пептиды.

Указанный результат достигается тем, что в способе количественного определения антиоксидантной активности пептидов животного происхождения путем спектрофотометрического определения оптической плотности продукта реакции изучаемых пептидов с 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом (DPPH) в органическом растворителе, выбранном из группы, включающей метанол, этанол, изопропанол, ацетон и метилэтилкетон, определяют оптическую плотность продукта реакции референтного пептидного антиоксиданта природного происхождения, предпочтительно L-глутатиона восстановленного, с 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом и рассчитывают антиоксидантную активность изучаемых пептидов как глутатионэквивалентную антиоксидантную активность GSHEAC (GSH equivalent antioxidant capacity), которая выражается как отношение IC₅₀, найденного для глутатиона, к IC_50(sub), найденное для субстанции:

где IC₅₀(GSH) - концентрация L-глутатиона, при которой прореагировало 50% DPPH, a IC₅₀(sub) - концентрация изучаемой субстанции, при которой прореагировало 50% DPPH.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

Для определения использовали 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (№ D9132 фирмы "Sigma"), растворенный в метаноле. Исходный 0,04%-ный раствор пригоден в течение двух суток при хранении во флаконе темного стекла с притертой пробкой, обернутой парафилмом, в защищенном от света месте при температуре 2-8°C. Для определения исходный раствор разбавляли в 10 раз.

В качестве референтного антиоксиданта использовали L-глутатион восстановленный (GSH) кат. G4251 фирмы «Sigma Aldrich». Возможно использование аналогичного реактива. L-глутатион растворяют в воде, 0,1%-ный раствор используют для определения свежеприготовленным.

В качестве раствора сравнения используется смесь метанола с водой в соотношении 3:1.

Анализ проводят в два этапа:

Первый этап - проведение реакции с растворами стандартного образца для построения калибровочного графика.

В пробирки вместимостью 10 мл с притертой пробкой помещают аликвоты стандартного раствора 1 или 2 и воды очищенной в соответствии с таблицами 1 и 2.

** - концентрацию рассчитывают в зависимости от количественного содержания и от навески СО восстановленного L-глутатиона.

В каждую пробирку прибавляют по 1 мл метанола, далее, с интервалом в 1 минуту, 2 мл реактива 1.

Оптическую плотность каждого раствора измеряют спустя 15 минут при длине волны 515-517 нм. Измерения проводят относительно раствора сравнения.

Для каждого раствора рассчитывают значение антиоксидантной активности по формуле:

где

D_DPPH - оптическая плотность раствора DPPH;

Dgiutathion - оптическая плотность раствора восстановленного глутатиона.

Строят график зависимости антиоксидантной активности от концентрации глутатиона в растворе в мкг/мл. На линейном участке зависимости проводят линию тренда. По полученному уравнению рассчитывают концентрацию глутатиона в растворе, при которой прореагировало 50% DPPH - IC₅₀.

Второй этап - проведение реакции с растворами субстанции для построения калибровочного графика.

В пробирки вместимостью 10 мл с притертой пробкой помещают аликвоты испытуемого раствора и воды очищенной в соответствии с таблицами 3 и 4.

В каждую пробирку прибавляют по 1 мл метанола, далее, с интервалом в 1 минуту 2 мл реактива 1.

Оптическую плотность каждого раствора измеряют спустя 15 минут при длине волны 515-517 нм. В качестве раствора сравнения используют раствор 1 мл воды очищенной и 3 мл метанола.

Для каждого раствора рассчитывают:

Значение антиоксидантной активности по формуле:

где

D_DPPH - оптическая плотность раствора DPPH;

D_sub - оптическая плотность испытуемого раствора.

Строят график зависимости антиоксидантной активности в % от концентрации водорастворимых пептидов в растворе в мкг/мл. На линейном участке зависимости проводят линию тренда. По полученному уравнению рассчитывают концентрацию водорастворимых пептидов в растворе, при которой прореагировало 50% DPPH - IC_50(sub).

Полученные значения IC₅₀ и IC_50(sub) позволяют рассчитать значение глутатионэквивалентной антиоксидантной активности GSHEAC (GSH equivalent antioxidant capacity) исследуемого пептида животного происхождения.

Заявляемый способ прошел валидацию в соответствии с протоколом валидации аналитической методики ВП 12-АМ-009-01. Проверка показала, что заявляемый способ отвечает установленным критериям специфичности, линейности, сходимости, внутрилабораторной прецизионности и правильности при определении антиоксидантной активности пептидов животного происхождения.

Заявляемый способ не слишком трудоемок, достаточно достоверен, не требует сложного оборудования и позволяет анализировать различные объекты в широком диапазоне величины антиоксидантной активности.

Способ количественного определения антиоксидантной активности пептидов животного происхождения путем спектрофотометрического определения оптической плотности продукта реакции изучаемых пептидов с 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом (DPPH) в органическом растворителе, выбранном из группы, включающей метанол, этанол, изопропанол, ацетон и метилэтилкетон, отличающийся тем, что определяют оптическую плотность продукта реакции референтного пептидного антиоксиданта природного происхождения L-глутатиона восстановленного (GSH) с 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом и рассчитывают антиоксидантную активность изучаемых пептидов как глутатионэквивалентную антиоксидантную активность GSHEAC (GSH equivalent antioxidant capacity), которая выражается как отношение IC₅₀, найденной для глутатиона, к IC_50(sub), найденной для субстанции:

где IC₅₀(GSH) - концентрация L-глутатиона, при которой прореагировало 50% DPPH, a IC₅₀(sub) - концентрация изучаемой субстанции, при которой прореагировало 50% DPPH.