Аминоалкилдезоксипроизводное целлюлозы, способ его получения и средство, обладающее антитромбоцитарной активностью
Владельцы патента RU 2694342:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр гематологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр "Коми научный центр Уральского отделения Российской академии наук" (RU)
Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности, а именно касается создания на основе целлюлозы аминобутилдезоксисодержащего производного в форме гидрохлорида, к способу его получения и применения в качестве антиагрегантного средства, обладающего высокой ингибиторной активностью по отношению к агрегации тромбоцитов человека. Аминобутилдезоксипроизводное целлюлозы в виде гидрохлорида с общей структурной формулой
,
где Z= OH (степень замещения 2,1±0,1) или (C4H9)NH·HCl (степень замещения 0,9±0,1) или CH3(C6H4)SO3 (степень замещения <0,1); n – количество повторяющихся звеньев равное 200±20. Способ получения аминобутилдезоксипроизводного целлюлозы в виде гидрохлорида включает синтез целевого продукта двухстадийным процессом, при этом на первой стадии осуществляют синтез промежуточного соединения – тозилата целлюлозы этерификацией целлюлозы п-толуолсульфохлоридом в растворе ДМАА/LiCl, а на второй стадии проводят обработку тозилата целлюлозы аминобутилом при температуре 80°С в ДМСО и выделение производного целлюлозы, при этом выделение производного целлюлозы осуществляют путем получения гидрохлорида аминобутилдезоксипроизводного целлюлозы нейтрализацией синтезированного поликатиона раствором соляной кислоты, его очисткой и высушиванием. 3 н.п. ф-лы, 4 табл.
Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности, а именно касается создания на основе целлюлозы аминобутилдезоксисодержащего производного в форме гидрохлорида, формула которого соответствует общей структуре (III), к способу его получения и применения, в качестве антиагрегантного средства, обладающего высокой ингибиторной активностью по отношению к агрегации тромбоцитов человека.
Предшествующий уровень техники.
В норме, многокомпонентная система гемостаза (сосудистая стенка, в основном интима, тромбоциты и другие форменные элементы крови, плазменные ферментные системы - свертывающая, антикоагулянтная и фибринолитическая - с их сложной нейрогуморальной регуляцией) у людей обеспечивает текучесть крови и препятствует развитию тромбоза или кровотечения [Hemostasis and Thrombosis: Practical Guidelines in Clinical managemaent // Edited by Saba HI, Roberts HR. John, Wiley & Sons, 2014, 344 p, ISBN 978-0-470-67050-7]. Последовательная активация на фосфолипидных поверхностях (тканевый фактор на клетках или активированные тромбоциты) факторов свертывания крови, сопровождающаяся включением механизмов положительной и отрицательной обратной связи, приводит к образованию тромбина, при этом, антикоагулянтная система ингибирует избыточную генерацию тромбина, а система фибринолиза обеспечивает лизис сгустка. Нарушение баланса про- и антикоагулянтных механизмов может привести к тромбозам или кровотечениям [Raskob GE, Anqchaisuksiri P., Blanco AN, Buller H., Gallus A., Hunt BJ, Hylek EM, Kakkar A., Konstantinides SV, McCumber M., Ozaki Y., Wendelboe A., Weitz JI. Thrombosis: A major contributor to global disease burden. ISTH Steering Committee for World Thrombosis Day // Thromb Res. 2014; 134: 931-938].
Для борьбы с тромбозами, наряду с антикоагулянтами и фибринолитиками, используют лекарственные средства, ингибирующие агрегацию тромбоцитов (антиагреганты или антитромбоцитарные средства) [Sibbing D., Angiolillo DJ, Huber K. Antithrombotic therapy for acute coronary syndrome: Past, present and future. // Thromb Haemost 2017; 117 (7): 1240-1248], [Gesheff Т., Barbour C. Oral antiplatelet agents for the management of acute coronary syndromes: A review for nurses and allied healthcare professionals // J Am Assoc Nurse Pract. 2017; 29 (2):104-115]. Тромбоциты (небольшие, 2-4 мкм, безъядерные плоские бесцветные форменные элементы крови, присутствующие только у млекопитающих) играют ключевую роль при нарушении целостности стенки сосуда [Mancuso ME, Santagostino Е. Platelets: much more than bricks in a breached wall. // Br J Haematol 2017; 178(2): 209-19]. На стадии адгезии тромбоциты связываются посредством мембранного рецептора гликопротеина (ГП) VI с экспонированным на поврежденной стенке сосуда коллагеном и посредством ГП комплекса Ib-IX-V на тромбоцитарной мембране с циркулирующим в кровяном русле фактором Виллебранда [Koltai K, Kesmarky G, Feher G, Tibold A, Toth K. Platelet Aggregometry Testing: Molecular Mechanisms, Techniques and Clinical Implications // Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 1803: 1-21], [Son E, Kim S-H, Yang W-K, Kim D-S, Cha J / Antiplatelet mechanism of an herbal mixture prepared from the extracts of Phyllostachys pubescens leaves and Prunus mume fruits // BMC Complementary and Alternative Medicine, 2017, 17:541; 1-11], [Gryglewski RJ. Prostacyclin among prostanoids. Pharmacol Rep. 2008; 60:3-11]. В результате из гранул тромбоцитов высвобождается ряд соединений медиаторов с проагрегантной активностью [Nieswandt B, Watson SP. Platelet-collagen interaction: is GPVI the central receptor. Blood. 2003; 102(2):449-61]. Высвобожденное содержание гранул активирует другие тромбоциты, что приводит к внутриклеточному увеличению концентрации ионов кальция [Ruggeri ZM, Mendolicchio GL. Adhesion mechanisms in platelet function. Circ Res. 2007; 100:1673-85], [Rumbaut RE, Thiagarajan P: Platelet-vessel wall interactions in hemostasis and thrombosis, Chapter 4. San Rafael (CA): Morgan & Claypool Life Sciences, 2010. ISBN 10: 1615040390] и последующим структурным/функциональным изменениям - форма тромбоцитов меняется с гладкого диска на сфероидальную с мембранными выростами [Pallister CJ, Watson MS: Haematology, Second edition, pp 334-336. Scion Publishing Ltd, 2010. ISBN 10: 1904842399]. После ряда сложных механизмов сигнальной трансдукции активируются ГП IIb/IIIa рецепторы мембраны тромбоцитов, обеспечивающие связь с фибриногеном, и образуются агрегаты [Joo SJ, Lee JW, Park YS. Increased activation of platelet glycoprotein IIb/IIIa in hypercholesterolemic patients. Korean Circ J 1998;28:2030-41], [Jackson S.P. The growing complexity of platelet aggregation//Blood 2007; 109(12):5087-95]. Кроме этого, на отрицательно заряженных поверхностях активированных тромбоцитов формируются протромбиназный (Xa-Va)/теназный (IXa-VIIIa) комплексы и генерируется огромное количество тромбина [Rubens C. Costa-Filho, Fernando A. Bozza. Platelets: an outlook from biology through evidence-based achievements in critical care // Ann Transl Med 2017;5(22):449], [Hoffman M, Monroe DM 3rd. A cell-based model of hemostasis. Thromb Haemost 2001;85:958-65], [Hoffman M, Monroe DM. Coagulation 2006: a modern view of hemostasis. Hematol Oncol Clin North Am 2007;21:1-11].
Тромбоциты участвуют во всех трех волнах тромбообразования [Wang Y, Ni H. Fibronectin maintains the balance between hemostasis and thrombosis//Cell Mol Life Sci 2016;73:3265-77]: (I) протеиновая волна; (II) срастание (accretion) тромбоцитов; (III) коагуляция крови. Для индукторов (агонистов) агрегации тромбоцитов на поверхности тромбоцитов есть специфические рецепторы, активация которых приводит к генерации сигнала и передаче его в клетку. Важнейший физиологический метаболит АДФ активирует пуринергические G protein связанные рецепторы тромбоцитов [Biology of Platelet Purinergic Receptors and Implications for Platelet Heterogeneity//M. Koupenova, K. Ravid//Frontiers in Pharmacology January 2018, 9, Article 37; 1-9]. Активность других агонистов тромбоцитов в некоторой степени зависит от высвобождения АДФ [Offermanns S., Toombs C, Hu Y, Simon M. Defective platelet activation in G alpha(q)-deficient mice//Nature. 1997; 389:183-186]. На поверхности каждого тромбоцита присутствует около 75000 ГП рецепторов Ilb/IIIa. Антагонисты этих рецепторов блокируют финальные этапы агрегации тромбоцитов - присоединение фибриногена к ГП [Rubens C. Costa-Filho, Fernando A. Bozza. Platelets: an outlook from biology through evidence-based achievements in critical care//Ann Transl Med 2017;5(22):449]. Блокада этих рецепторов предотвращает агрегацию тромбоцитов, индуцированную тромбином, тромбоксаном А2, АДФ, коллагеном и катехоламинами, а также активацию тромбоцитов при повреждении стенки. Для активации трех групп рецепторов тромбоцитов необходимы петли положительных обратных связей [Wang Y, Ni H. Fibronectin maintains the balance between hemostasis and thrombosis//Cell Mol Life Sci 2016;73:3265-77]: (I) Пуринергические рецепторы P2Y1 и P2Y12 активируются АДФ, высвобожденной из плотных гранул тромбоцитов; (II) Рецепторы 2-5-гидрокситриптамина 2A (5HT2A) активируются серотонином, высвобожденным из плотных гранул тромбоцитов; (III) Рецепторы тромбоксана стимулируются тромбоксаном А2 (TXA2), который синтезируется по тромбоцитарному циклооксигеназа 1 (COX1) - зависимому сигнальному пути.
Современная антиагрегантная терапия направлена на: подавление синтеза TXA2, что снижает избыточную активацию (аспирин и triflusal); противодействие функции пуринергических рецепторов тромбоцитов P2Y (клопидогрел, прасугрел и тикагрелор); подавление активности αIIbβ3 интегрина (ГП рецептор IIb/IIIa) тромбоцитов, что сдерживает агрегацию тромбоцитов (абциксимаб, ламифибана и тирофибан, эптифибатид); ингибирование фосфодиэстеразы, что увеличивает внутренний уровень cAMP/cGMP (дипиридамол, цилостазол); ингибирование PAR-1 рецепторов тромбоцитов, что блокирует активацию тромбином (voraxapar) [Metharom P, Berndt MC, Baker RI, et al. Current state and novel approaches of antiplatelet therapy. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2015;35:1327-38]. Антитромботическая терапия, направленная на основные пути активации тромбоцитов, включающие синтез TxA2, АДФ-опосредованную сигнализацию, интегрин aIIbβ3 (GPIIb-IIIa) сигнализацию и другие механизмы, признана основой в лечении сердечно-сосудистых заболеваний [Fanaroff A, Rao S. Antiplatelet therapy in PCI // Interv Cardiol Clin. 2016; 5(2): 221-237].
Однако современные антитромбоцитарные лекарственные средства для профилактики и лечения инфаркта миокарда, ишемического инсульта и для лечения острого коронарного синдрома обладают рядом побочных эффектов [Capodanno D, Ferreiro JL, Angiolillo DJ. Antiplatelet therapy: new pharmacological agents and changing paradigms.//J Thromb Haemost. 2013; 111(Suppl):316-329], [Levi M, Eerenberg E, Kamphuisen PW. Bleeding risk and reversal strategies for old and new anticoagulants and antiplatelet agents//J Thromb Haemost. 2011; 9:1705-1712], [Tantry US, Gesheff M, Liu F, Bliden KP, Gurbel PA. Resistance to antiplatelet drugs: what progress has been made?//Expert Opin Pharmacother. 2014; 15:2553-2564], [Hochtl T, Pachinger L, Unger G, Geppert A, Wojta J, Harenberg J, Huber K. Antiplatelet drug induced isolated profound thrombocytopenia in interventional cardiology: a review based on individual case reports//J Thromb Thrombolysis. 2007; 24:59-64]. А к аспирину и клопидогрелю наблюдаются случаи резистентности [Le Quellec S., Bordet J, Neqrier C, Darqaud Y. Comparison of current platelet functional tests for the assessment of aspirin and clopidogrel response. A review of the literature//Thromb. Haemost. 2016; 116(4):638-50]. Эти обстоятельства ставят перед исследователями актуальную задачу поиска новых и безопасных средств, предназначенных для лечения и предупреждения тромботических поражений сосудов.
Некоторые полисахариды (их производные) как полусинтетические (микробного, растительного, животного происхождения), так и синтетические (в основном олигосахариды) ингибируют коагуляцию плазмы человека или агрегацию тромбоцитов. Как правило это полисахариды ионогенного, прежде всего анионного типа. Наиболее исследованными в этом отношении являются сульфатированные полисахариды. Вместе с тем существенный интерес в качестве антиагрегантных средств представляют аминосодержащие биополимеры. Например, известны данные об антитромоцитарной активности производных хитозана [Skorik Y. A. Kritchenkov A. S., Moskalenko Y. E., Golyshev A. A., Raik S. V., Whaley A. K., Vasina L. V., Sonin D. L. Synthesis of N-succinyl- and N-glutaryl-chitosan derivatives and their antioxidant, antiplatelet, and anticoagulant activity//Carbohydrate Polymers 2017, 166; 166-172]. Другим привлекательным полисахаридом для использования в этих целях является целлюлоза. Многие аминосодержащие производные целлюлозы водорастворимы, являясь типичными катионными полимерами, проявляют различные виды биологической активности, сохраняя вместе с тем положительные качества исходного полисахарида - линейную структуру, низкую токсичность, способность к безопасному выведению из организма.
Синтез на основе целлюлозы производных, содержащих аминогруппы может быть осуществлен несколькими путями. Использование для этой цели реакций нуклеофильного замещения открывает возможность синтезировать дезоксипроизводные целлюлозы. Промежуточным соединениями в этом случае обычно являются галогендезоксипроизводные целлюлозы [Takano T., Ishikawa J., Kamitakahara H., Nakatsubo F. The application of microwave heating to the synthesis of 6-amino-6-deoxycellulose//Carbohydrate Research 2007, 342, 2456-2460], [Carter Fox S., Edgar K. J. Staudinger Reduction Chemistry of Cellulose: Synthesis of Selectively O-Acylated 6-Amino-6-deoxy-cellulose//Biomacromolecules 2012, 13, 992-1001] или, что более практически целесообразно, эфиры арилсульфокислот, прежде всего п-толуолсульфокислоты (тозилаты целлюлозы).
Известно несколько способов синтеза тозилатов целлюлозы в водных средах или средах органических растворителей, с дальнейшим преобразованием аминов дезоксиполисахаридов. Описано получение аминометилдезоксицеллюлозы [Knaus S., Mais U., Binder W. H. Synthesis, characterization and properties of methylaminocellulose//Cellulose 2003. 10: 139-150], 6-аминоэтил-6-дезокси целлюлозы [Schmidt S., Liebert T., Heinze T. Synthesis of soluble cellulose tosylates in an eco-friendly medium//Green Chem., 2014,16, 1941-1946], 6-фенилэтиламино-6-дезокси производных целлюлозы [Heinze Th., Koschella A., Magdaleno-Maiza L., Ulrich A. S. Nucleophilic displacement reactions on tosyl cellulose by chiral amines//Polymer Bulletin 2001, 46, 7-13].
В настоящем изобретении представлено водорастворимое аминобутилдезоксипроизводное целлюлозы в виде гидрохлорида (АБЦ-HCl) с общей структурой III (см. рисунок) со свойством ингибирования агрегации тромбоцитов человека, индуцированной АДФ или коллагеном и способ его получения.
Известен сульфатированный олигосахарид (маннопентаозофосфат - SO4) с антитромботической активностью. Этот сахарид Cowden W. и Parish C. выделяли из дрожжей Pichia holstii [Patent US 6271215 B1 Aug.7 2001; Int. Cl. A 61K 31/715; Sulfated oligosaccharides having anticoagulant/antithrombotic activity//Inventor W.B. Cowden, C.R. Parish//Appl. No.: US 09/380,899 Mar 11 1997; Assignee The Australian National University]. С помощью описанного в патенте метода авторы получили сульфатированный олигосахарид (общая формула олигосахарида может быть представлена как: R1-(Rx)n-R2, где R1, R2 и каждая Rx единица может быть представлена одним и тем же моносахаридным звеном либо различными, а соседние моносахаридные звенья связанными 1→2, 1→3, 1→4 и/или 1→6 гликозидными связями и число «n» может составлять от 1 до 6). В концентрациях 21, 210, 2100 мкг/мл маннопентаозофосфат - SO4 снижал АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека до 74, 72 и 56 (контроль - 81 отн. скорость агрегации), соответственно, а коллаген-индуцированную - до 97, 86, 79 (контроль - 114 отн. скорость агрегации), соответственно.
Недостаток данного изобретения обусловлен невысокой величиной ингибиторной активности в отношении АДФ- и коллаген - индуцированной агрегации тромбоцитов (снижалась только в 1.5 раза). Кроме этого, структура олигосахарида, отвечающая общей формуле, может быть представлена огромным набором олигосахаридов и разобраться какая из них ответственна за проявляемый биологический эффект является сложной задачей.
Наиболее близким к изобретению по структуре соединения (АБЦ-HCl) и способу его получения является аминометилдезоксицеллюлоза и ее синтез, описанный в работе [Knaus S., Mais U., Binder W.H. Synthesis, characterization and properties of methylaminocellulose // Cellulose 2003. 10: 139-150], по которому синтезируют промежуточный арилсульфоэфир этерификацией целлюлозы в растворе N,N-диметилацетамид (ДМАА)/LiCl в присутствии триэтиламина при температуре 8°С в течение 24 ч, с последующим выделением и очисткой тозилата целлюлозы. Далее тозилат целлюлозы обрабатывают водным раствором метиламина в ДМАА при температуре 60°С в течении 48 ч. Полученную в результате реакции нуклеофильного замещения 6-дезокси-6-аминометилцеллюлозу выделяют из реакционной среды осаждением в изопропиловом спирте, после чего промывают водой и сушат.
Недостатком данного способа является то, что синтез 6-аминометил-6-дезоксицеллюлозы требует больших избытков алкиламина. Использованный метиламин является соединением с низкой (-6°С) температурой кипения, что предполагает специальные условия реакции. В прототипе не описана водорастворимость получаемого дезоксиаминоалкилпроизводного целлюлозы и его антиагрегантные свойства.
Технический результат состоит в том, что предлагаемое в нашей заявке производное целлюлозы (АБЦ-HCl) - водорастворимо в виде фармакологически приемлемой солевой формы гидрохлорида, включает в свою структуру бутильный радикал, связанный с аминогруппой, обладает поликатионной природой, проявляет более эффективные антиагрегантные свойства. Для достижения одинакового с сульфатом маннопентаозофосфата эффекта предлагаемого производного целлюлозы требуется в 40 раз меньше.
Синтез АБЦ-HCl по сравнению с прототипом - 6-аминометил-6-дезоксицеллюлозой - менее затратен и вдвое менее продолжителен, токсичные растворители на последних стадиях синтеза и очистки заменены на безопасные растворители - диметилсульфоксид (ДМСО) и воду, исключено использование легкокипящего амина, такого как метиламин, что упрощает аппаратурное оформление.
Полученное соединение расширяет ассортимента антитромбоцитарных средств, имеет свойства ингибитора АДФ индуцированной или коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов. Выявлена высокая способность АБЦ-HCl ингибировать АДФ индуцированную агрегацию тромбоцитов человека в диапазоне плазменных концентраций от 0.0198 мг/мл до 1.9800 мг/мл и коллаген индуцированную агрегацию тромбоцитов человека в диапазоне плазменных концентраций от 0.02 мг/мл до 2 мг/мл.
Предложено антитромбоцитарное средство на основе водорастворимого гидрохлорида аминобутилдезокси целлюлозы со степенью замещения (содержание аминогрупп) - 0.9±0.1; молекулярной массой 50⋅103 в качестве средства для профилактики тромбозов.
Технический результат достигается тем, что получено аминобутилдезоксипроизводное целлюлозы в виде гидрохлорида с общей структурной формулой
где Z=OH (степень замещения 2.1±0.1) или (C4H9)NH⋅HCl (степень замещения 0.9±0.1) или CH3(C6H4)SO3 (степень замещения <0.1).
Технический результат достигается тем, что способ получения аминобутилдезоксипроизводного целлюлозы в виде гидрохлорида, включающий синтез целевого продукта двухстадийным процессом, согласно изобретению, на первой стадии осуществляют синтез промежуточного соединения - тозилата целлюлозы этерификацией целлюлозы п-толуолсульфохлоридом в растворе ДМАА/LiCl, а на второй стадии проводят обработку тозилата целлюлозы аминобутилом при температуре 80°С в ДМСО и выделение производного целлюлозы, при этом выделение производного целлюлозы осуществляют путем получения гидрохлорида аминобутилдезоксипроизводного целлюлозы нейтрализацией синтезированного поликатиона раствором соляной кислоты, его очисткой и высушиванием.
Технический результат достигается тем, что применение аминобутилдезоксипроизводного целлюлозы в виде гидрохлорида в качестве средства обладающего ингибиторной активностью по отношению к агрегации тромбоцитов.
Способ осуществляется следующим образом.
Синтез проиллюстрирован схемой, включающую исходную, промежуточную и активную структуры в виде усредненных элементарных звеньев полимера, а также основные условия синтеза.
Схема. Способ синтеза АБЦ-HCl (схема). В скобах рядом с расшифровкой буквы, обозначающей данный радикал (R, Z) указана степень замещения в статистическом звене.
I: целлюлоза, где n=200±20.
II: тозилат целлюлозы, где R=H (2.05±0.05) или CH3(C6H4)SO2 (0.95±0.05);
III: АБЦ-HCl, где Z=OH (2.1±0.1) или (C4H9)NH⋅HCl (0.9±0.1) или CH3(C6H4)SO3 (<0.1).
Условия: i-ДМАА/LiCl, CH3(C6H4)SO2Cl, N(C2H5)3, 6°C, 24 ч; ii-(C4H9)NH2, ДМСО, 80°C, 21 ч.
На первой стадии осуществляется синтез промежуточного соединения - тозилата целлюлозы (структура II). Для этого целлюлозу (I, степень полимеризации 200±20) растворяют в смеси ДМАА/LiCl, этерифицируют п-толуолсульфохлоридом в присутствии триэтиламина. Процесс этерификации осуществляют при мольном соотношении ангидроглюкозная единица целлюлозы/п-толуолсульфохлорид 1:1.8. Продолжительность этерификации 24 ч при температуре 6°С. Тозилат целлюлозы выделяют из реакционной смеси осаждением в изопропиловом спирте, затем промывают и сушат.
На второй стадии осуществляют обработку тозилата целлюлозы бутиламином. Для этого тозилат целлюлозы растворяют в ДМСО, прибавляют бутиламин до 4-х кратного мольного избытка по отношению к сульфоэфирным группировкам тозилата целлюлозы и выдерживают полученный раствор при температуре 80°С в атмосфере инертного газа при перемешивании в течение 21 ч. Полимер выделяют из реакционной смеси осаждением в изопропиловом спирте, последовательно промывают изопропиловым спиртом, затем водой, после чего растворяют в воде, подкисляемой прибавлением порциями 0.5 М раствора соляной кислоты, так, что бы после полного растворения производного целлюлозы рН раствора составлял 3.5±0.2. Полученный водный раствор АБЦ-HCl фильтруют, дополнительно очищают методом диализа и лиофилизируют. АБЦ-HCl представляет собой белый, хорошо растворимый в воде порошок. Степень замещения (аминобутильные группы) 0.9±0.1, средняя молекулярная масса 50⋅103. Содержание серы не более 0.7 мас %. Контроль структуры и чистоты промежуточных и целевых продуктов осуществляют методами элементного анализа, гель-хроматографии, ИК и ЯМР-спектроскопии.
Эксперименты по исследованию антиагрегационной способности соединений были выполнены с использованием венозной крови здоровых доноров, которую получали путем пункции кубитальной вены и стабилизировали 3.8%-ным раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. Для приготовления богатой тромбоцитами плазмы кровь центрифугировали в течение 10 минут при 1000 об./мин, после чего верхний слой плазмы переносили в другую пробирку, а остаток повторно центрифугировали в течение 20 минут при 3000 об./мин для получения плазмы, бедной тромбоцитами. Агрегацию тромбоцитов исследовали на агрегометре фирмы Chrono-Log (Pensilvania, USA, Model 500) по методу G.Born [Born G.V. Aggregation of blood platelets by adernosine diphosphate and its reversal//Nature. 1962. V.194. №5. P. 927-929]. С этой целью в кювету прибора помещали 300 мкл богатой тромбоцитами плазмы. В качестве индуктора агрегации использовали раствор динатриевой соли аденозин-5'-дифосфата (АДФ; «Sigma-Aldrich»). Богатую тромбоцитами плазму человека инкубировали с исследуемым соединением или с буфером (0.05 М трис-HCl буфером, рН 7.4, содержащим 0.175 М NaCl), затем вносили АДФ (конечная концентрация 10-5 М) или коллаген (конечная концентрация 0.1 и 0.2 мг/мл). Агрегацию тромбоцитов определяли для АДФ в течение 5 мин, для коллагена за 15 мин. Оптическим контролем служил такой же объем плазмы, не содержащей тромбоцитов (пропускание света бедной тромбоцитами плазмы принимали за 100%). О степени агрегации судили по максимальной величине пропускания света в кювете с богатой тромбоцитами плазмой после окончания реакции агрегации тромбоцитов. На агрегатограмме (кривой агрегации тромбоцитов) определяли максимальную амплитуду кривой агрегации (в %) и угол наклона кривой агрегации (отн. ед. / мин.), отражающий скорость развития агрегации тромбоцитов. Статистический анализ полученных данных проводили в соответствии с общепринятыми методами вариационной статистики с использованием критерия Манна - Уитни и программы Биостатистика.
Изобретение поясняется следующими примерами:
Пример 1. Синтез аминосодержащего производного целлюлозы (АБЦ-HCl).
На первой стадии синтезировали тозилат целлюлозы. Для этого сухую порошковую целлюлозу массой 5.0 г (30.9 ммоль) растворяли в смеси состоящей из 200 мл ДМАА и 20.0 г LiCl. После получения гомогенного раствора его остужали до температуры 6°С, прибавляли к нему при перемешивании 10.6 г (55.6 ммоль) п-толуолсульфохлорида и 20.0 мл триэтиламина. Полученную реакционную смесь при этой температуре оставляли на 24 ч при перемешивании в атмосфере инертного газа. Эфир целлюлозы выделяли из реакционной смеси осаждением в изо-пропиловый спирт, затем промывали и сушили в вакууме.
Получено 9.4 г (96%) светло-желтого порошка. Содержание серы 9.89±0.03%, что соответствует степени замещения 0.95±0.05 (тозильные группы).
ИК (KBr, см−1): 3508 (OH), 2887 (CH2), 1597 (ν Ar), 1363 (νас.SO2), 1186 (νсSO2), 837 (ν SO-C).
ЯМР 13C (75 МГц, DMSO-d6, δ, м.д.): 145.9, 132.7, 130.6, 128.5 (C ароматич.), 102.8-101.8 (C1), 78.6 (С4), 75.0 (С5), 73.5-73.4 (С2, C3), 68.7 (C6 тозил), 21.6 (CH3 ароматич.). С1-С6 углеродные атомы ангидроглюкозной единицы. По данным ЯМР этерификации подвергаются в основном гидроксильные группы при С6 атоме элементарного звена: сигнал незамещенного С6 атома ангидроглюкозной единицы отсутствует.
На второй стадии осуществляли реакцию нуклеофильного замещения тозилатных групп.Для этого обрабатывали полученный на предыдущей стадии тозилат целлюлозы н-бутиламином. Реакцию проводили следующим образом: 5.0 г (15.8 ммоль) тозилата целлюлозы растворяли в 80 мл ДМСО, прибавляли 4.6 г (63.2 ммоль) н-бутиламина и выдерживали полученный раствор при температуре 80°С в атмосфере инертного газа при перемешивании в течение 21 ч. Целевой аминодезоксиполисахарид выделяли из реакционной смеси осаждением в изо-пропиловый спирт, последовательно промывали изопропиловым спиртом, затем водой, после чего растворяли в воде, подкисляемой прибавлением 0.5 М раствора соляной кислоты, так, что бы после полного растворения производного целлюлозы рН раствора составлял 3.5±0.1. Полученный водный раствор АБЦ-HCl фильтровали, дополнительно очищали методом диализа (мембраны CtlluSep 4.5 кДа) и лиофилизировали.
Получали 3.4 г (85%) АБЦ-HCl в виде белого, хорошо растворимого в воде порошка. Элементный анализ: C 55.24±0.03, H 8.77±0.03, N 5.88±0.04, S 0.65±0.02, что соответствует степени замещения 0.90±0.1 (аминобутильные группы) и 0.03±0.01 для остаточных тозильных групп.
ИК-спектр (KBr, νmax, см-1): 2954, (νR2NH), 1597 (δNH), 816 (S-O), 1175 (SO2), сл.770 (δС-Н Ar).
ЯМР 13С (75 МГц, DMSO-d6, δ, м.д.): 14.15 (-NCH2CH2CH2CH3), 19.94 (-NCH2CH2 CH2CH3), 25.4 (-NCH2CH2CH2CH3), 54.0 (-NCH2CH2CH2CH3), 60.6 (C6), 69.3 (C4), 71.04 (C5), 73.8 (C2), 74.1-75.4 (C3), 103.4 (C1), 128.6 (ароматич.). С1-С6 углеродные атомы ангидроглюкозной единицы.
Пример 2. Оценка антиагрегантной активности при индукции АДФ.
Эксперименты проводили следующим образом: в кювету, содержащую 330 мкл богатой тромбоцитами плазмы, добавляли 33 мкл раствора (растворитель - 0.05 М трис-HCl буфер, рН 7.4, содержащий 0.175 М NaCl) исследуемого соединения, конечная концентрация 0.00198-1.98000 мг/мл) и инкубировали полученную смесь в течение 5 мин при температуре 37°С. Процесс агрегации тромбоцитов индуцировали, добавляя 33 мкл раствора АДФ (Sigma) в конечной концентрации 10-5 М (проведение опыта в последовательности “образец+плазма>инкубация+АДФ). В контрольных опытах богатую тромбоцитами плазму предварительно инкубировали с растворителем для исследуемого образца (0.05 М трис-HCl буфером, рН 7.4, содержащим 0.175 М NaCl) и после этого вносили индуктор агрегации тромбоцитов (проведение опыта в последовательности «буфер+плазма>инкубация+АДФ»), либо предварительно инкубировали богатую тромбоцитами плазму с раствором образца, а затем, вместо АДФ добавляли буфер (проведение опыта в последовательности «образец+плазма>инкубация+буфер»).
Самостоятельно АДЦ в исследованных концентрациях не способствовал агрегации тромбоцитов человека (табл.1, примечание пункт 1). С увеличением концентрации АДЦ в богатой тромбоцитами плазме человека с 0.00198 до 1.98 мг/мл снижалась АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов (табл. 1). Достоверность различий с показаниями в контроле мы наблюдали, начиная с концентрации 0.01980 мг/мл. И в концентрации 0.19800 мг/мл падение агрегации тромбоцитов было в 5.6 раз ниже, чем в контроле. Для достижения 50% ингибирования агрегации тромбоцитов потребовалось 0.1 мг/мл АДЦ.
Достоверное снижение, в сравнении с контролем, при увеличении концентрации АДЦ наблюдали и в скорости развития процесса (табл.2) и в площади под кривой агрегации тромбоцитов (табл.3).
Таблица 1. Влияние АДЦ на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека (%)
| Концентрация АДЦ в плазме, мг/мл | ||||||||
| 0 | 0.00198 | 0.01980 | 0.19800 | 1.98000 | ||||
| К | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 |
| 81.43±3.28 | 1±1 | 74.36±1.25 | 0 | 63.5±2.46* | 0 | 14.5±4.45* | 0 | 0 |
Примечание: К – контроль, буфер+плазма+АДФ; 1 - АДЦ+плазма+буфер; 2 - АДЦ+плазма+АДФ; * - P<0.05, достоверность различий с показаниями в контроле.
Таблица 2. Влияние АДЦ на наклон кривой АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов человека (отн. ед./мин)
| Концентрация АДЦ в плазме, мг/мл | ||||||||
| 0 | 0.00198 | 0.0198 | 0.198 | 1.98 | ||||
| К | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 |
| 132.9±7.86 | 2.75±1.26 | 120.7±6 | 0 | 110.2±8.35 | 0 | 24.21±8.73* | 0 | 0 |
Примечание: К - контроль, буфер+плазма+АДФ; 1 - АДЦ+плазма+буфер; 2 - АДЦ+плазма+АДФ; * - P<0.05, достоверность различий с показаниями в контроле.
Таблица 3. Влияние АДЦ на площадь под кривой АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов человека (отн. ед./мин)
| Концентрация АДЦ в плазме, мг/мл | ||||||||
| 0 | 0.00198 | 0.0198 | 0.198 | 1.98 | ||||
| К | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 |
| 335.7±41 | 16.8±9.17 | 328.3±8.07 | 0 | 249.4±24.19* | 0 | 63.63±24.27* | 0 | 0 |
Примечание: К - контроль, буфер+плазма+АДФ; 1 - АДЦ+плазма+буфер; 2 - АДЦ+плазма+АДФ; * - P<0.05, достоверность различий с показаниями в контроле.
Пример 3. Оценка антиагрегантной активности при индукции коллагеном.
Процесс агрегации тромбоцитов индуцировали, добавляя 33 мкл раствора коллагена (НПО “Ренам”) в конечных концентрациях 0.1 и 0.2 мг/мл (проведение опыта в последовательности “образец+плазма>инкубация+коллаген). В контрольных опытах богатую тромбоцитами плазму предварительно инкубировали с растворителем для исследуемого образца (0.05 М трис-HCl буфером, рН 7.4, содержащим 0.175 М NaCl) и после этого вносили индуктор агрегации тромбоцитов (проведение опыта в последовательности «буфер+плазма>инкубация+коллаген»), либо предварительно инкубировали богатую тромбоцитами плазму с раствором образца, а затем, вместо коллагена добавляли буфер (проведение опыта в последовательности «образец+плазма>инкубация+буфер»).
Самостоятельно АДЦ в исследованных концентрациях не способствовал коллаген индуцированной агрегации тромбоцитов человека (табл.4, концентрация коллагена 0 мг/мл). С увеличением концентрации АДЦ в богатой тромбоцитами плазме человека с 0.002 до 2 мг/мл индуцированная коллагеном агрегация тромбоцитов снижалась (табл.4). Достоверность различий с показаниями в контроле наблюдали, начиная с концентрации 0.02 мг/мл. Для достижения 50% ингибирования агрегации тромбоцитов индуцированной коллагеном в концентрациях 0.1 и 0.2 мг/мл, потребовалось 0.066 и 0.1 мг/мл АДЦ, соответственно.
Таблица 4. Влияние АДЦ на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека (%)
| Образцы, мг/мл | Концентрация коллагена, мг/мл плазмы | ||||
| 0 | 0.2 | 0.1 | |||
| Lag, мин | Агрегация, % | Lag, мин | Агрегация, % | ||
| К, 0 | 4.83±1.05 | 3.57±0.23 | 72.54±1.94 | 3.17±0.36 | 68.15±0.94 |
| АДЦ 0.002 | н.о. | 3.35±0.25 | 70.0±1.65 | 4.4±0.54 | 58.92±3.77 |
| АДЦ 0.020 | н.о. | 3.45±0.3 | 57.1±4.16* | 4.2±0.43 | 44.3±4.02* |
| АДЦ 0.200 | 0±0 | 3.67±0.58 | 14.5±2.22* | 2.58±1.2 | 9.0±0.97* |
| АДЦ 2.000 | 0±0 | 0.42±0.42 | 4.42±0.33* | 0±0 | 2.58±0.57* |
Примечание: К - контроль, буфер; Lag - время до начала агрегации тромбоцитов, мин;
* - P<0.05, достоверность различий с показаниями в контроле; «н.о.» - не определяли
1. Аминобутилдезоксипроизводное целлюлозы в виде гидрохлорида с общей структурной формулой
,
где Z=ОН (степень замещения 2,1±0,1) или (C4H9)NH⋅HCl (степень замещения 0,9±0,1) или СН3(С6Н4)SO3 (степень замещения <0,1); n – количество повторяющихся звеньев равное 200±20.
2. Способ получения аминобутилдезоксипроизводного целлюлозы в виде гидрохлорида по п. 1, включающий синтез целевого продукта двухстадийным процессом, отличающийся тем, что на первой стадии осуществляют синтез промежуточного соединения - тозилата целлюлозы этерификацией целлюлозы п-толуолсульфохлоридом в растворе ДМАА/LiCl, а на второй стадии проводят обработку тозилата целлюлозы аминобутилом при температуре 80°С в ДМСО и выделение производного целлюлозы, при этом выделение производного целлюлозы осуществляют путем получения гидрохлорида аминобутилдезоксипроизводного целлюлозы нейтрализацией синтезированного поликатиона раствором соляной кислоты, его очисткой и высушиванием.
3. Применение аминобутилдезоксипроизводного целлюлозы в виде гидрохлорида по п. 1. в качестве средства, обладающего ингибиторной активностью по отношению к агрегации тромбоцитов.
