Способ получения биологически активных веществ, содержащихся в дрожжевб1х клетках

 

В %Ф о k «я

teal .. -:т;. "хничесне.тт мстт fQ;-qv-1 . к - ю !

Й" -т

О П

ИЗОБРЕТЕНИЯ

275027

Союз Советских

Социалистических

Респтблик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Зависимое от авт. свидетельства М

Заявлено 02.1Х.1965 (№ 1025155/28-13) Кл. 6а, 22/05 с присоединением заявки № комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

МПК С 12k х ДК 663.14.038.9(088.8) Приоритет

Опубликовано 03М!.1970. Бюллетень ¹ 22

Дата опубликования описания 19.Х.1970

Авторы изобретения P. П. Евстигнеева, В. Н. Гурышев, М. E. Гальперин и Л. Н. Волосевич

Заявитель Московский институт тонкой химической технологии им. Ломоносова

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ, СОДЕРЖАЩИХСЯ В ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТКАХ

Известен способ получения биологически активных веществ (например, ферментов, витаминов), содержащихся в дрожжевых клетках. Согласно этому способу клетки дрожжей разрушают этилацетатом, полученную суспензию разделяют одним из известных способов, например фильтрацией, получая при этом жидкую и .твердую фазу. Из твердой фазы высаливают растворимые вещества раствором сульфата аммония. Жидкую фазу разделяют фильтрацией на фильтрат и белковый осадок.

Предлагаемый способ обеспечивает получение более широкого комплекса содержащихся в дрожжах биологически активных веществ, на пример ферментных препаратов — цитохрома С, рибонуклеазы, рибонуклеиновой кислоты, эргостерина — источника витамина D, С этой целью цитохром С выделяют из фильтрата путем пропуска последнего через ионообменные колонки с последующим элюированием уловленного на них цитохрома. С. Рибопуклеазу выделяют из раствора, прошедшего через колонки, осаждением риванолом с последующим получением ее из осадка в кристаллическом виде.

Рибонуклеи новую кислоту получают путем обработки белкового осадка цтелочью, а эргостерин — путем воздействия на белковый осадок спиртом.

Согласно предлагаемому способу колонки заряжают смолами СГ-1, КБ-1, КБ-4 и КБ-2.

Высалпванпе растворимых веществ пз осадка следует вести 50%-íûì раствором сульфата аммония при температуре 10 — 15 C.

Пример. К 10 г прессованных дрожжей

5 вида Sacharomyces сегелз)е добавляют 3.225л этплацетата и оставляют на. час.при 10 — 15 C.

Затем полученную суспензию фильтруют.

Осадок суспендируют в растворе сульфата аммония (3,225 кг сульфата аммония раство10 ренного в 15 л воды, 50% от степени насыщения). Экстракцп1о раствором сульфата аммония проводят в течение 48 <ас прп перемешиванпи и температуре 10 — 15 C.

Белковый осадок отдсляют, а фильтрат диа15 лизуют в течение Зб час.

Для получения цитохрома С фильтрат пропускают через колонку с ионообменной смолой при рН 7,0. Прп этом цитохром С выделяется на смоле, а рибонуклеаза в растворе

20 проходит через колонку. Колонку промывают

3 л 0,05 М раствора сульфата аммония, после чего элюпруют раствор цптохрома 1,5 л

0,2 М раствора сульфата аммония. Полученный раствор цитохрома С диализуют в тече25 ние 18 час, фильтруют, затем пропускают через колонку с ионообменной смолои при рН

7,0. Колонк1 !тром ывают 500 li.l 0,25 — 0,3 М аммонийно-ацетатного буфера, после этого элюпруют 0,5 М раствсром аммиака (б00—

30 800 л.т). Вначале элюируется восстановленная форма цитохрома С, потом окисленная, 2750i27

Предмет изооретения

Составитель Андреева

Редактор Торопова

Корректор Н. Л. Бронская

Заказ 30l3j6 Тираж 480 Подписно"

ЦНИИПИ Комитета по делам изоорстеиий и откры-ий при Совете Министров СССР

Москва, >К-35, Раушская паб., д. 4)5

Типография, пр. Сапунова, 2

Полученный раствор диализуют в течение

18 час и пропускают через колонку с ионообменной смолой (КБ-1, КБ-2, КБ-4, СГ-1) при рН 9,6 для концентрирования. Элюацию проводят 0,5 М водным раствором аммиака (100 — 150 ял) . Концентрированный раствор цитохрома С подвергают лиофильной сушке.

Для получения рибонуклеазы,к раствору, прошвдшему через первую колонку, объем которого составляет 15 л, доливают при перемешивании 5,6 л 1%-ного водного раствора риванола и оставляют при температуре .не выше

10 С на 2 час.

Образующийся комплекс рибонуклеаза —— рива нол выпадает в осадок, который отфильтровывают. Осадок (13 г) растворяют в 5 л

1 М раствора ацетата натрия, прибавляют 2 объема ацетона и держат на холоде в течение

24 час. Выпавшие кристаллы рибонуклеазы отфильтровывают (13 г) .

Осадок растворяют в 100 мл воды, раствор охлаждают и доливают к нему при перемешивании двойной объем апетона. Оставляют на

12 час при охлаждении, после чего фильтруют. Переосаждение повторяют еще раз. В результате получают 7 г кристаллической рибонуклеазы.

Для получения рибонуклеиновой кислоты белковый осадок, полученный после экстракции цитохрома С и рибонуклеазы сульфатом аммония, промывают 5 л воды на фильтре, затем суспендируют в 7 л 2 н. раствора едкого натра. Экстракцию рибонуклеиновой кислоты щелочью ведут при перемешивании в течение 1 час. Затем приливают 1100 ил ледяной уксусной кислоты, доводя рН смеси до

6,0, и фильтруют.

К полученному фильтрату приливают двойной объем .с пирта в количестве 4,5 л. Спустя

4 час осадок рибонуклеиновой кислоты отфильтровывают и получают 180 г ее. Затем рибонуклеиновую кислоту растворяют в

1600 ял воды, осаждают одинарным объемом спирта и фильтруют.

Для получения эргостерина фильтрат, полу5 ченный после удаления рибонуклеиновой кислоты, обрабатывают спиртом.

Выход цитох рома С 200 мг, рибонуклеазы

7 г, рибонуклеиновой кислоты 70 — 80 г, эргостерина 16 г.

1. Способ получения биологически актив15 ных веществ, содержащихся в дрожжевых клетках, путем разрушения их этилацетатом, отделения твердой фазы от жидкой одним из известн|ых способов, высаливания растворимых веществ из твердой фазы раствором

20 сульфата аммония, разделения жидкой фазы путем фильтрации на белковый осадок и фильтрат, отличающийся тем, что, с целью получения более широкого комплекса содержащихся в дрожжевых клетках биологически ак25 тивных веществ, например ферментных препаратов — цитохрома С, рибонуклеазы, рибонуклеиновой кислоты, эргостерина — источника витамина D, цитохром С выделяют из фильтрата при помощи ионообменных смол, н|апри30 мер КБ-1, КБ-2, КБ-4, СГ-1, рибонуклеазу получают из раствора, освобожденного от цитохрома С, осаждением риванолом с последующим получением ее в кристаллическом виде из осадка одним из известных способов, а рибо35 нуклеиновую кислоту и эргостерин получают путем последовательной обработки белкового осад ка щелочью и спиртом.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что высаливание растворимых веществ из осадка

40 ведут 50%-ным раствором сульфата аммония при температуре 10 — 15 С.