Способ раздельного определения органических и неорганических гидропероксидов при помощи хемилюминесценции с использованием каталазы



Способ раздельного определения органических и неорганических гидропероксидов при помощи хемилюминесценции с использованием каталазы
Способ раздельного определения органических и неорганических гидропероксидов при помощи хемилюминесценции с использованием каталазы

Владельцы патента RU 2700708:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный Медицинский Исследовательский Центр Кардиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ кардиологии" Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к клиническим и лабораторным методам исследования и может быть использовано для количественного определения органических и неорганических гидропероксидов в модельных системах и биологических жидкостях. Способ раздельного определения органических и неорганических гидропероксидов при помощи хемилюминесценции включает диспергирование органических гидропероксидов в водных средах и последующее добавление 0,25 ед./мл каталазы в пробу с общим содержанием гидропероксидов, после чего определяют уровень органических гидропероксидов. Затем путем вычитания концентрации органических гидропероксидов из общего содержания гидропероксидов в смеси вычисляют содержание пероксида водорода. Диспергирование органических гидропероксидов в водных средах осуществляется без использования спиртов, индуцирующих запуск артефактных реакций. Изобретение обеспечивает повышение специфичности и чувствительности способа за счет предварительного высокоспецифичного ферментативного восстановления Н2О2 с помощью каталазы. 1 ил., 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к клиническим и лабораторным методам исследования и может быть использовано для количественного определения органических и неорганических гидропероксидов в модельных системах и биологических жидкостях.

Свободнорадикальные процессы играют важную роль в этиологии и патогенезе целого ряда заболеваний, таких как атеросклероз, сахарный диабет и др. Увеличение генерирования активных форм кислорода, включая супероксидный анион-радикал, может приводить к окислительным повреждениям липид-белковых надмолекулярных комплексов (биомембран и липопротеидов). Супероксидный анион-радикал способен дисмутировать с образованием пероксида водорода, причем в организме этот процесс катализирует фермент супероксиддисмутаза. В процессе окислительного стресса происходит одновременное накопление первичных продуктов свободнорадикального окисления - органических гидропероксидов (в частности, липогидропероксидов различного строения - ROOH) и неорганических гидропероксидов (пероксида водорода - Н2О2). Вследствие этого, существует необходимость в разработке способа для раздельного определения этих продуктов. Тем не менее, в настоящее время нет сведений о возможности одновременного определения органических и неорганических гидропероксидов в одних и тех же пробах. В работе Nourooz-Zadeh J. et al., Anal Biochem. 1994, 220: 403-409 была описана возможность раздельного определения ROOH и Н2O2 колориметрическим методом (с использованием реагента Fe-ксиленолоранж) после предварительного восстановления ROOH трифенилфосфином (ТФФ), который восстанавливал ROOH, но не Н2O2 (определение Н2O2 производили путем вычитания показаний пробы с ТФФ из показаний пробы без ТФФ).

Тем не менее, в проведенном исследовании способом индуцированной хемилюминесценции эти данные не нашли подтверждения, поскольку было установлено, что трифенилфосфин специфичным действием не обладает и не может быть использован в качестве реагента при раздельном определении органических и неорганических гидропероксидов.

Известные способы определения содержания органических гидропероксидов (ROOH, включая липопероксиды) были основаны либо на цветных реакциях, либо на определении поглощения конъюгированных диенов. Следует отметить, что колориметрические способы, в частности с использованием реагента Fe-ксиленолоранж (Nourooz-Zadeh J. et al., Anal Biochem. 1994, 220: 403-409), высокой чувствительностью не обладают и их использование для анализа биологического материала возможно только в случае концентрирования ROOH (например, путем препаративного выделения липопротеидов плазмы крови - Lankin V.Z. et al., Mol Cell Biochem. 2003, 249: 129-40). Очевидно, что подобные подходы непригодны для серийных клинических анализов.

Что касается спектрофотометрического определения уровня конъюгированных диенов, то обычно используемый способ по анализу спектра поглощения не может использоваться при анализе биологического материала, так как вследствие малого содержания ROOH пик их поглощения при 233 нм, как правило, не разрешен и для корректного определения необходим обсчет первых или вторых производных спектра, что позволяет делать далеко не каждый даже импортный спектрофотометр (Corongiu F.P. et. al., Methods Enzymol. 1994, 233: 303-10). Кроме того, при спектрофотометрическом определении в области поглощения 233 нм в природных системах определяются не только гидроперокси-производные липидов, но и продукты их восстановления - соответствующие окси-кислоты (при восстановлении гидропероксидов максимум поглощения практически не изменяется).

Известны также хемилюминесцентные способы определения органических гидропероксидов, обладающие большими преимуществами по сравнению с другими способами, ввиду весьма высокой чувствительности. Впервые использование хемилюминесцентного способа для определения органических гидропероксидов (ROOH) предложил Yamamoto Y. (Yamamoto Y. et al. Anal. Biochem. 1987, 160: 7-13). При этом гомолиз ROOH индуцировали микропероксидазой, а их разделение осуществляли при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии. Количественное определение ROOH осуществлялось при помощи хемилюминесцентного детектора после их разделения. Модификацию этого способа осуществили с применением люминола в качестве агента, увеличивающего квантовый выход хемилюминесценции (ХЛ). (Теселкин Ю.О. и Бабенкова И.В., Вестник РГМУ, 2011, 5: 54-58). А также с использованием в качестве усиливающего ХЛ агента изолюминола, что оказалось более целесообразным ввиду лучшей воспроизводимости результатов. (Проскурниной Е.В. и др. Журнал аналитической химии. - 2017, 72: 1-6).

Тем не менее, как следует из вышеизложенного, ни один из существующих способов, включая колориметрические,

спектрофотометрические и хемилюминесцентные, не позволяет проводить одновременно раздельное определение содержания органических и неорганических гидропероксидов в анализируемых пробах.

В связи с вышеизложенным, существует потребность в способе, позволяющем с высокой специфичностью проводить одновременное определение содержания органических и неорганических гидропероксидов в одной и той же пробе. Учитывая тот факт, что подобный способ может быть использован для проведения анализов в пробах биологического материала, одним из основных требований к способу определения является его высокая чувствительность.

Задачей изобретения является разработка простого и быстрого способа раздельного определения органических и неорганических гидропероксидов при помощи хемилюминесценции, позволяющего применять его в качестве доступного лабораторного теста.

Технический результат изобретения заключается в повышении специфичности и чувствительности способа.

Это достигается тем, что в заявляемом способе селективность определения ROOH и Н2O2 основана на предварительном высокоспецифичном ферментативном восстановлении Н2O2 с помощью каталазы, причем содержание ROOH рассчитывается путем вычитания светосуммы пробы после инкубации с каталазой из светосуммы под пиком общей хемилюминесцентной кривой.

Осуществление способа:

Хемилюминесцентный реагент (ХЛ-реагент), который используют в день приготовления и предварительно выдерживают в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте до угасания собственной хемилюминесценции, содержит 200 нМ микропероксидазы-11 и 2 мкМ изолюминола в 20 мМ боратном буфере рН 10,0. Органический гидропероксид (ROOH - 13-гидропероксилинолеат) получают путем ферментативного окисления линолевой кислоты при катализе липоксигеназой-1 соевых бобов. Важно отметить, что липиды должны быть диспергированы без применения спиртовых растворов, поскольку в присутствии спиртов каталаза способна восстанавливать ROOM в ходе пероксидазной реакции. Далее, ROOH (13-гидропероксилинолеат) диспергируют в воде с помощью детергента дезоксихолата натрия (1/2; мкмоль/мкмоль).

Измерение ХЛ проводят на хемилюминометре Lum-100 (ДИсофт, Россия). Для проведения определения готовят две пробы.

Проба 1 (ROOH+H2O2): в хемилюминесцентную кювету помещают 25 мкл 1,2 мкМ дисперсии ROOH (13-гидропероксилинолеата) и 25 мкл 1,2 мкМ водного раствора H2O2.

Проба 2 (ROOH+H2O2 + каталаза) содержит те же ингредиенты, что и проба 1, но с добавлением 0,25 ед/мл каталазы и инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение 10 мин. Кювету с пробой 1 помещают в хемилюминометр и регистрируют собственную ХЛ образца в течение 60 сек, а затем впрыскивают через капиллярную трубку 950 мкл ХЛ-реагента и производят запись в течение 5 мин, после чего определяют площадь под ХЛ-кривой (светосумма ХЛ за 4 мин). По истечении времени инкубации проводят регистрацию ХЛ пробы 2. Количество органического гидропероксида определяют путем вычитания светосуммы ХЛ пробы 2 из светосуммы ХЛ пробы 1. Количественное определение 13-гидропероксилинолеата и H2O2 проводят с использованием соответствующих калибровочных графиков, построенных в координатах: по абсциссе - концентрация гидропероксидов в нМ; по ординате - светосумма ХЛ.

Пример 1 раздельного определения ROOH и H2O2 в смеси этих компонентов.

Раздельное хемилюминесцентное определение концентрации органического (13-гидропероксилинолеата) и неорганического (Н2О2) гидропероксидов в их смеси (1/1 в нмолях) предлагаемым способом показаны в таблице 1. Полученные ХЛ-кривые представлены на Фиг. 1, где ХЛ-кривые: 1 - смесь 13-гидропероксилинолеата и пероксида водорода (1/1), 2 - то же+каталаза (0,25 ед/мл), 3 - 13-гидропероксилинолеат (30 нМ), 4 - пероксид водорода (30 нМ). Результаты приведены в условных единицах ХЛ (светосумма за 4 мин в имп.х 10).

Экспериментально определенное содержание ROOH (13-гидропероксилинолеата) в пробе смеси эквимолярных количеств органического и неорганического (Н2O2) гидропероксидов после утилизации Н2O2 каталазой представляют данные пробы 2, причем расхождение с определенным тем же способом содержанием чистого ROOH - 13-гидропероксиксилинолеата (994±123) составляет 9,5%. Содержание Н2O2 в смеси эквимолярных количеств ROOH и Н2O2 определяется путем вычитания данных пробы 2 (после утилизации пероксида водорода каталазой) из данных пробы 1 (смесь 13-гидропероксилинолеата и Н2O2), причем расхождение с определенным тем же способом содержанием чистого Н2O2 (807±57) составляет 10%.

Следовательно, содержание органических гидропероксидов -ROOH (в данном примере - 13-гидроперокси линолеат) и неорганических гидропероксидов (Н2O2) по предлагаемому способу осуществляется по формулам:

1) [ROOH]=[ROOH+Н2O2+каталаза] или [ROOH]=показателю пробы 2;

2) [Н2O2]=[ROOH+Н2O2] - [ROOH] или

[Н2O2]=показатель пробы 1 минус показатель пробы 2, где [ROOH] и [Н2O2] - концентрации органического и неорганического гидропероксидов соответственно.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет с достаточно высокой точностью и чувствительностью (определяются наномолярные количества веществ, что почти на 3 порядка превышает чувствительность спектрофотометрических методов) с абсолютной специфичностью (исходя из абсолютной специфичности каталазной реакции) производить раздельное определение органических гидропероксидов и пероксида водорода в средах, содержащих смесь этих компонентов.

Способ раздельного определения органических и неорганических гидропероксидов при помощи хемилюминесценции, отличающийся тем, что осуществляют диспергирование органических гидропероксидов в водных средах, затем в пробу с общим содержанием гидропероксидов добавляют 0,25 ед./мл каталазы, после чего определяют уровень органических гидропероксидов, а путем вычитания их концентрации из общего содержания гидропероксидов в смеси вычисляют содержание пероксида водорода, причем диспергирование органических гидропероксидов в водных средах осуществляется без использования спиртов, индуцирующих запуск артефактных реакций.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для экспресс-оценки аспиринорезистентности. Для этого на пробу цельной крови в объеме 25 мкл, помещенную в измерительную камеру до приема аспирина и через 4 часа после его приема, воздействуют ультразвуковыми колебаниями с частотой 150-160 кГц.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и позволяет прогнозировать выживаемость больных светлоклеточным почечно-клеточным раком (скПКР).
Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике. Способ определения мальпозиции транспедикулярных стержней у пациентов с остеопорозом позвонков путем исследования спинномозговой жидкости лабораторным методом заключается в том, что в спинномозговой жидкости определяют концентрацию церулоплазмина, причем исследование проводят на любом этапе послеоперационного наблюдения после наложения устройства внешней фиксации и при уровне концентрации церулоплазмина в ликворе менее 0,2 г/л делают заключение о наличии мальпозиции, а при концентрации церулоплазмина 0,2 г/л и выше - о ее отсутствии.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике. Способ определения мальпозиции транспедикулярных стержней в интраоперационном периоде путем исследования спинномозговой жидкости лабораторным методом заключается в том, что после проведения стержней в тело позвонка в спинномозговой жидкости определяют концентрацию гаптоглобина и при уровне концентрации гаптоглобина в ликворе 0,1 г/л и выше делают заключение, о наличии мальпозиции транспедикулярных стержней, а при концентрации менее 0,1 г/л - об отсутствии мальпозиции.

Изобретение относится к медицине, а именно к неонатологии, педиатрии и гематологии, и представляет собой способ прогнозирования развития ранней анемии недоношенных в первый месяц жизни у глубоконедоношенных детей, родившихся с массой тела менее 1500 г.

Изобретение относится к медицине, а именно фармакологии и токсикологии, и может быть использовано для определения N-[3-(4-нитрофениламино)-индол-2-илметилен]аминогуанидина метансульфоната в плазме крови.

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ диагностики злокачественного плеврального выпота путем исследования кристаллической фации плевральной жидкости на предметном стекле, полученной методом клиновидной дегидратации, отличающийся тем, что фацию помещают под микроскоп, через который производят серию съемок ее полей зрения, полученные цифровые изображения запоминают в памяти ПК, который выбирает кадры для анализа, производит распознавание целевых фаций с помощью обучаемой нейронной сети путем анализа закрашенных и пустых пикселей, их расположения в фации и взаимного расположения, высчитывает процент вероятности наличия онкопатологии, и при распознавании более 80% диагностируют злокачественный плевральный выпот, при менее 80% вероятности наличия онкологической патологии злокачественный плеврит исключают.

Изобретение относится к области экологии и материаловедения, а именно нанотехнологии, и может быть использовано для количественного определения углеродных наноструктур (УН), в частности углеродных нанотрубок, в твердых и жидких образцах и различных средах.

Изобретение относится к диагностике, а именно к способу дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) у детей. Способ дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника у детей, предусматривает определение уровня aнти-GP2 IgA-антител и уровня секреторных sIgA-антител в копроэкстракте обследуемого методом иммуноферментного анализа, сопоставление полученного значения соотношения GP2 IgA/sIgA с уровнем порогового критерия, равного 0,784, и при значении соотношения GP2 IgA/sIgA ниже 0,784 у обследуемого диагностируют воспалительное заболевание кишечника, а если рассчитанное значение соотношения GP2 IgA/ sIgA выше 0,784, у обследуемого исключают диагноз воспалительного заболевания кишечника.
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии и неонатологии, и может быть использован при прогнозировании риска развития детского церебрального паралича (ДЦП) у детей, родившихся в сроке сверхранних преждевременных родов (СПР), на первом году жизни.

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и касается способа прижизненной дифференциальной диагностики туберкулеза и микобактериозов крупного рогатого скота.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ калибровки и измерения сигнала, а также устройство для обнаружения и/или идентификации целевых бактерий.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ экспресс-оценки жизнеспособности клеток в тканеинженерных конструкциях.

Изобретение относится к области медицины, ветеринарии и иммунологии. Способ прижизненной диагностики микобактериозов крупного рогатого скота включает определение индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции в сыворотке от положительно реагирующего на ППД-туберкулин крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств, при этом в качестве основного индуктора хемилюминесценции используют комплексный аллерген из атипичных микобактерий.

Изобретение относится к контролю загрязнений окружающей воздушной среды. Оптический биосенсор в воздухе включает: оптический детектор и активный компонент, состоящий из иммобилизованного флуоресцирующего комплекса холинэстеразы с обратимым ингибитором - флуорогеном, интенсивность флуоресценции которого снижается в присутствии необратимого ингибитора с образованием аналитического сигнала - снижения интенсивности флуоресценции активного компонента биосенсора.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу обнаружения присутствия гена aad-12 в трансгенном растении сои, содержащем событие pDAB4472-1606. Также раскрыт набор для использования в указанном способе обнаружения присутствия или отсутствия гена aad-12 в геноме растения сои.

Изобретение относится к области обнаружения микроконцентраций веществ в газовой среде, в частности к детектированию молекул взрывчатых веществ (нитросоединений) в воздухе.

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для раннего индивидуального прогнозирования развития осложнений при лечении внебольничной пневмонии.

Изобретение относится к медицине и касается способа быстрого количественного определения специфической активности лиофилизированной БЦЖ-вакцины, включающего реконструкцию лиофилизированной вакцины, удаление внеклеточного АТФ с использованием апиразы, экстракцию внутриклеточного АТФ, определение содержания внутриклеточного АТФ биолюминесцентным методом и расчет специфической активности.

Изобретение относится к области нанотехнологий, а также может быть использовано в биологии, медицине, гетерогенном катализе. Способ определения концентрации адсорбатов наночастиц (НЧ) серебра на поверхности нанопористого кремнезема включает приготовление раствора исследуемого вещества, извлечение исследуемого вещества из раствора сорбентом, измерение интенсивности флуоресценции органолюминофора в присутствии исследуемого вещества, определение неизвестной поверхностной концентрации исследуемого вещества по градуировочному графику, где в качестве сорбента используют немодифицированный кремнезем, в качестве адсорбата - монодисперсные наночастицы серебра и молекулы органолюминофора - Родамина 6Ж, интенсивность флуоресценции измеряют при возбуждении на плазмонной длине волны 420 нм, измерение проводят при комнатной температуре.

Группа изобретений относится к определению коэффициента вязкости жидкости малого объема с помощью электрофореза. Способ включает подготовку исследуемой и эталонной жидкостей, погружение лакмусовой бумаги в вещество, размещение электродов. При этом лакмусовую бумагу заправляют под шайбы клемм, к которым прикручены электроды, по центру лакмусовой бумаги помещают нить, смоченную гидроксидом натрия, задают напряжение в электрической цепи постоянного тока не более 80 В и подключается электрический ток, исследование проводят сначала с эталонной жидкостью, затем с исследуемой жидкостью, по изменению цвета лакмусовой бумаги определяется расстояние, пройденное ионом ОН-, фиксируется время, затем вязкость исследуемого вещества определяется с использованием заданного соотношения. Также представлен прибор для определения вязкости вещества малого объема при помощи электрофореза. Достигается возможность исследования жидкостей различной степени вязкости в малых объемах от 0,2 до 1 мл. 2 н.п. ф-лы, 3 ил.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2018-12-10 2019-09-19T08:00:52
Наверх