Устройство и способ для изготовления 3d тканеинженерных конструкций для культивации клеток

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к устройству для изготовления скаффолдов. Устройство состоит из корпуса, на прямоугольном основании которого по трем сторонам расположены бортики высотой 0,3 см, и крышки, размер которой совпадает с размером основания корпуса, с возможностью их соединения при помощи струбцин, с образованием щели по одной из сторон, не имеющей бортика. Изобретение позволяет расширить арсенал технических средств. 7 ил.

 

Изобретение относится к области биотехнологий, в частности к устройствам и способам для создания тканеинженерных конструкций, пригодных для выращивания клеток млекопитающих, и может найти применение в тканевой инженерии и регенеративной медицине.

Трехмерное (3D) культивирование клеток получило широкое распространение в клеточной биологии. Это обусловлено множеством несомненных преимуществ по сравнению с обычным, монослойным (2D) культивированием клеток. 3D культивирование обеспечивает лучшее взаимодействие клетка-клетка, клетка-внеклеточный матрикс (ВКМ) и образование структуры клеточной популяции, схоже с архитектурой внутренних органов. Все преимущества 3D культивирования обеспечивают получение более полной и достоверной информации о физиологии клеток и прогнозировании их жизнедеятельности in vivo. /1, Edmondson R., Broglie J.J. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors // ASSAY and Drug Development Technologies. - 2014. - №12(4)./.

Наиболее частыми материалами, используемыми для получения 3D тканеинженерных конструкций, являются коллаген, желатин, хитозан, полилактид, гликолевая кислота, гликозаминогликаны. Все способы для получения тканеинженерных конструкций подразумевают формирование устойчивой, структурированной, объемной, пористой конструкции, к которой будет возможна адгезия клеток 12, Do A., Khorsand В. 3D Printing of Scaffolds for Tissue Regeneration Applications // Advanced Healthcare Materials. - 2015. - №4(12)./.

Существует множество устройств и способов получения 3D тканеинженерных конструкций для культивирования клеток. Не прямым аналогом является 3D-биопринтинг, а именно струйная лазерная и экструзионная печать. Данные методы предоставляют возможность создавать органоподобные матриксы, модифицировать скаффолды с помощью различных лекарственных веществ, а также печать 3D-скаффолдов вместе с клетками. Основной проблемой данного метода являются ограниченные условия печати, такие как вязкость, температура, не большие объемы печати, а также время печати и стоимость конечного продукта./3, Huang Y., Zhang X.F. 3D bioprinting and the current applications in tissue engineering // Biotechnology Journal. - 2017. - №12(8)./.

Ближайшим аналогом является способ получения внеклеточного матрикса с помощью хлорида натрия. Желатин (2,5 г) растворяли в дважды деионизированной воде (7,5 г) при 50°С в концентрации 25%. Кристаллы хлорида натрия (средний размер частиц = 300-500 мкм от просеивания) добавляли в весовых соотношениях (100-175 г) в раствор желатина. Раствор, содержащий кристаллы NaCl, заливали в тефлоновую форму (толщина = 2 мм), равномерно распределяли и затем сушили в вакуумной печи при 50°С в течение 24 часов для удаления воды. /4, Lee S.B., Kim Y.H., Study of gelatin-containing artificial skin V: fabrication of gelatin scaffolds using a salt-leaching method. // Biomaterials. - 2005. - №26(14)./.

Данный способ обладает рядом недостатков. При создании данных скаффолдов используется не выгодное соотношение соли и желатина, из-за этого большая часть соли получается не использованной. Так же для данной методики необходимо наличие дополнительного оборудования.

Техническая проблема, решаемая данным изобретением, состоит в создании устройства, которое позволяет получать внеклеточный матрикс необходимых размеров, толщины и пористости, с минимальной тратой ресурсов.

Сущность изобретения заключается в том, что устройство для изготовления 3D тканеинженерных конструкций для культивации клеток из пластика состоит из корпуса, на прямоугольном основании которого по трем сторонам расположены бортики высотой 0,3 см, и крышки, размер которой совпадает с размером основания корпуса, с возможностью их соединения при помощи струбцин, с образованием щели по одной из сторон, не имеющей бортика.

А в способе изготовления 3D тканеинженерных конструкций для культивации клеток, включающем смешивание соли NaCl с раствором желатина, соль смешивали с 20% раствором желатина в дистиллированной воде, в весовом соотношении 1:7, затем оставляли инкубировать для пропитки соли в течение суток, при 37°С, после чего полученный скаффолд помещали в емкость с 2,5% глутаровым альдегидом и инкубировали для фиксации в течение 5 минут, а затем промывали деионизованной водой, в течение 2 суток.

Устройство представлено на фиг. 1 - общий вид сверху, фиг. 2 - общий вид спереди, фиг. 3 - устройство в сборе, фиг. 4, 5 - Гистологическое изображение образца, фиг. 6, 7 - Исследования образца с помощью сканирующей электронной микроскопии.

Устройство состоит из прямоугольной пластиковой крышки 1, корпуса 2, выполненного также из пластика и представляющего собой основание в виде плоского прямоугольника с бортиками по трем сторонам. Размеры крышки и основания одинаковы, высота бортиков составляет 0,3 см. Фиксация крышки на корпусе осуществляется с помощью струбцины 3 маленького размера.

Работа устройства осуществляется следующим образом. В корпус 2 насыпается соль хлорида натрия, которая фиксируется крышкой, прижатой к корпусу струбцинами 3, с образованием щели по стороне без бортика. Устройство переворачивается щелью вверх, в которую заливается 20% раствор желатина с дистиллированной водой, в весовом соотношении соль-раствор желатина 1:7. Вещества оставляют инкубировать для хорошего смешивания в течение суток, при 37°С. Затем снимают крышку и помещают получившийся скаффолд в емкость с 2,5% глутаровым альдегидом и инкубируют для фиксации в течение 5 минут. Затем промывают полученный скаффолд деионизованной водой в течение 2 суток. Таким образом, использован наливной способ изготовления тканеинженерных конструкций.

Технический результат использования данного изобретения заключается в том, что оно позволяет создавать внеклеточный матрикс необходимого размера, пористости, который в дальнейшем можно будет использовать в исследованиях регенерационной медицины. Изобретение позволяет создавать внеклеточный матрикс с минимальными затратами, без использования сложного и дорогостоящего оборудования. Были проведены гистологические исследования, в ходе которых образцы внеклеточного матрикса были окрашены с помощью гематоксилина и эозина. На образцах видно высокую пористость матрикса (см. Фиг. 4, 5). При анализе полученных образцов с помощью сканирующего электронного микроскопа так же видно высокую пористость матрикса (см. Фиг. 6, 7).

Устройство для изготовления скаффолдов, состоящее из корпуса, на прямоугольном основании которого по трем сторонам расположены бортики высотой 0,3 см, и крышки, размер которой совпадает с размером основания корпуса, с возможностью их соединения при помощи струбцин, с образованием щели по одной из сторон, не имеющей бортика.