Способ выявления предрасположенности к развитию атеросклероза у мужчин среднего возраста

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к ранней диагностике атеросклероза. Сущность: отбирают у пациента пробу буккального эпителия и осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты ДНК. На детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции проводят генотипирование полиморфизма генов FAS и ММР9, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена FAS (rs1159120) и гена ММР9 (rs17576). В пробе крови определяют содержание триглицеридов. И при одновременном выполнении следующих условий: наличии комбинации СС генотипа гена FAS (rs1159120), а также генотипа АА гена ММР9 (rs17576), при одновременном превышении уровня триглицеридов в крови выше верхней границы физиологической нормы в 1,15-2,15 раза, оценивают риск развития атеросклероза у мужчин среднего возраста как высокий. Изобретение позволяет обеспечить достоверность диагностики прогнозирования риска развития атеросклероза у мужчин среднего возраста (36-45 лет). 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, медицинской генетике, кардиологии, а именно к ранней диагностике атеросклероза. Предложен способ генодиагностики и/или определения предрасположенности к атеросклерозу, и может быть использовано для определения степени индивидуального генетического риска атеросклероза.

Атеросклероз является основной причиной сердечного приступа и инсульта, и ожидается, что он станет основной причиной смерти в мире в течение ближайшего времени. Заболевание характеризуется сужением стенок артерий в результате накопления липидов и клеток - так называемой атеросклеротической бляшки. При разрыве покрышки бляшки могут образовываться тромбы, которые ограничивают кровоток жизненно важных органов, таких как сердце и мозг. Поэтому, чтобы уменьшить количество смертей от атеросклероза, исследователи пытаются найти способы предотвратить это. Прогрессирование атеросклероза модулируется взаимодействием с адаптивной иммунной системой. Атеросклероз - это хроническое системное воспалительное заболевание. Врожденный и адаптивный иммунный ответ может быть вовлечен в атерогенез.

В России, как и в большинстве индустриальных стран, сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) занимают первое место в структуре инвалидизации и смертности, в том числе преждевременной, а также ведут к эскалации расходов на здравоохранение. Поскольку морфологической основой смертности от сердечно-сосудистых заболеваний в 90% случаев является атеросклероз, то вклад заболеваний атеросклеротического генеза и их последствий в России в общую смертность является наиболее весомым. Одной из причин распространенности атеросклероза и заболеваний атеросклеротического генеза является недостаточное количество верифицированных биомаркеров, использование которых позволяло бы выявлять индивидуальную предрасположенность к атеросклерозу и проводить раннюю и эффективную профилактику.

В последнее время наиболее перспективными прогностическими методами риска возникновения этого заболевания стали генетические методы. Из уровня техники широко известны различные способы, в основу которых положено использование различных генов в качестве прогностических маркеров возможности развития атеросклероза.

Например, из патента РФ №2376372 известен способ генетической диагностики предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям, основанный на исследовании генотипов генов-кандидатов сердечно-сосудистой патологии, в частности, по анализу полиморфных вариантов ядерных генов AGTR1, АСЕ, MTHFR, AGT, GNB3, NOS3, F5, ITGB3 и F2.

Известен ряд патентных документов (патент США №2013136726; патент РФ №2592233), которые позволяют установить предрасположенность к атеросклерозу, ишемической болезни сердца и связанным с ними состояниями, заключающийся в использовании показателей гетероплазмии митохондриального генома по мутациям 652ins/delG, A1555G, С3256Т, Т3336С, G12315A, G13513A, G14459A, G14846A и G15059A (по американскому патенту); а по российскому патенту производят оценку индивидуального генетического риска атеросклероза на основе определения вариантов митохондриального генома, состоящий в том, что у человека берут кровь, выделяют ДНК и проводят генотипирование митохондриальной ДНК; наличие варианта A1811G свидетельствует о высоком генетическом риске атеросклероза, а наличие вариантов Т204С, G8251A, Т10238С, G12501A свидетельствует о низком генетическом риске атеросклероза. Однако указанные известные методы предлагают диагностические характеристики только для пациентов старше 60 лет.

Также из патента РФ №2574896 известен способ оценки риска неблагоприятных сердечно-сосудистых событий у больных с клиническими проявлениями атеросклероза. Согласно этому способу в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа определяют концентрацию растворимых маркеров апоптоза - sAPO-1 (sAPO-1/Fas), sFas-лиганда (sFasL), аннексина V (Anx) и антител к фосфотидилсерину (Anti-PS). По формуле рассчитывают прогностический коэффициент К. При значениях К менее 29% оценивают низкий риск, 30-50% - умеренный, 51-61% - высокий, более 61% - очень высокий риск развития неблагоприятных сердечно-сосудистых событий.

Однако, указанный известный способ обеспечивает оценку риска неблагоприятных сердечно-сосудистых событий у больных (45-80 лет) уже с клиническими проявлениями атеросклероза, т.е. используемые известные генетические маркеры не могут являться прогностическими маркерами. Кроме того, величина риска в известном способе устанавливается не напрямую, а рассчитывается по дополнительной математической зависимости, что может гипотетически привносить погрешность в определение. Все это сказывается на точности оценки.

Из патента РФ №2367956 известен способ выявления предрасположенности к возникновению атеросклероза. Сущность изобретения включает определение наличия фенотипов SS и FS локуса С'3 и при наличии фенотипа SS локуса С'3 устанавливают генетическую предрасположенность к развитию атеросклеротических процессов. При наличии фенотипа FS локуса С'3 устанавливают генетическую предрасположенность к сдерживанию развития атеросклеротических процессов.

Еще из уровня техники (патент РФ №2698092) известен способ выявления предрасположенности к заболеванию атеросклерозом на основе определения экспрессии генов, вовлеченных в накопление холестерина. С помощью ПЦР-РВ измеряют уровень экспрессии генов, тесно связанных с накоплением холестерина макрофагами человека, идентифицированных как IL7R, IL7, TIGIT, CXCL8, F2RL1, EIF2AK3, TSPYL2, ANXA1, DUSP1 и IL15. Сравнивают полученные данные с аналогичными значениями уровня экспрессии тех же генов здоровых людей. Более высокий уровень экспрессии мРНК указанных генов свидетельствует о предрасположенности пациента к развитию атеросклероза на доклиническом этапе патологии. Недостатком указанного способа является сложность реализации, т.к. требуется для сравнения проводить исследование здоровых людей.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ молекулярно-генетической диагностики предрасположенности к атеросклерозу и ишемической болезни сердца [Пчелина С.Н., Дубина М.В. Молекулярно-генетическая диагностика предрасположенности к атеросклерозу и ишемической болезни сердца // Клинико-лабораторный консилиум, 2009. - №5. - С. 9-13]. Выявлен генетический маркер - генотип R191 гена PON1, повышающий риск развития атеросклероза и инфаркта миокарда, по которому судят о высоком риске предрасположенности к атеросклерозу. Недостатком указанного известного способа является недостаточная точность, вследствие ограниченного числа диагностических маркеров, используемых при реализации способа.

Задачей предлагаемого изобретения является создание эффективного способа определения генетической предрасположенности к атеросклерозу, позволяющего на ранних этапах выявлять развитие болезни и принимать адекватные меры для профилактики и своевременного лечения.

Технический результат - обеспечение достоверности диагностики прогнозирования риска развития атеросклероза у мужчин среднего возраста, за счет использования в качестве диагностических критериев совокупности генетических вариантов комбинации СС генотипа гена FAS (rs1159120) и генотипа АА гена ММР9 (rs17576), при одновременном использовании в качестве критерия лабораторного показателя - уровня триглицеридов в крови.

Поставленный технический результат достигается предлагаемым способом выявления предрасположенности к развитию атеросклероза у мужчин среднего возраста, включающий использование в качестве диагностического критерия наличие полиморфизма гена, при этом новым является то, что отбирают у пациента пробу буккального эпителия и осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты ДНК, затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции ПЦР проводят генотипирование полиморфизма генов FAS и ММР9, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена FAS (rs1159120) и гена ММР9 (rs17576), в пробе крови пациента определяют содержание триглицеридов, и при одновременном выполнении следующих условий: наличии комбинации СС генотипа гена FAS (rs1159120), а также генотипа АА гена ММР9 (rs17576), при одновременном превышении уровня триглицеридов в крови выше верхней границы физиологической нормы в 1,15-2,15 раза, оценивают риск развития атеросклероза у мужчин среднего возраста как высокий.

Указанный технический результат достигается за счет следующего.

Атеросклероз представляет собой патологическое ремоделирование артерий, которое является основной причиной заболеваемости и смертности в развитых странах; эта патология лежит в основе инфаркта миокарда, инсульта и заболевания периферических артерий. Существует необходимость в прогностических и легкодоступных маркерах атеросклероза, которые могут быть определены в буккальном эпителии и образцах периферической крови.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала пробы крови, а также стандартных методик изучения иммунологических параметров, обеспечивается простота, надежность и доступность исследований, а также получение результатов нужной информативности.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала буккального эпителия (пробы биологического материала со слизистой щеки), обеспечивается простота и надежность исследований, а также получение нужной информативности, в плане выделения из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) проведения генотипирования полиморфизма используется в качестве праймера участок ДНК генотипа гена FAS (rs1159120) и гена ММР9 (rs17576), путем исследования аллельного состояния каждого.

Согласно балансовой модели, часто не существует какого-то одного аллеля дикого типа. Во многих, а может быть и в большинстве локусов присутствует целый ряд аллелей с различными частотами. Следовательно, составляющие популяцию особи гетерозиготны по этим аллелям в значительной части локусов. При этом какой-либо определенный нормальный, или идеальный генотип отсутствует. Популяция представляет собой совокупность множества генотипов, различающихся по многим локусам и, тем не менее, в большинстве случаев удовлетворительно приспособленных к тем условиям, с которыми приходится сталкиваться популяции. У гена FAS 2 аллеля (1 пара аллелей) С и Т (С - дикий или наиболее часто встречающийся в природной популяции аллель, Т - мутантный или вариантный). У гена ММР9 также 2 аллеля (1 пара аллелей) А и G (А - дикий или наиболее часто встречающийся в природной популяции аллель, G - мутантный или вариантный).

В уровне техники изучена возможность участия Fas/APO 1 в апоптозе прогрессирующего коронарного атеросклероза человека. Коронарные артерии с атеросклерозом были получены из сердца человека с хронической ишемической болезнью сердца при трансплантации сердца. В качестве контроля использовались обычные сосуды. Fas/APO 1 был обнаружен методом иммуногистохимии с моноклональным антителом. Апоптотические клетки окрашивали in situ терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой, опосредованной концевой маркировкой dUTP nick (TUNEL), а фрагментацию ДНК в олигонуклеосомы проверяли методом гель-электрофореза. Вс1-2, антиапоптотический онкопротеин, был обнаружен с помощью иммуногистохимии и Вестерн-блота. Апоптотические клетки присутствовали в неоинтиме на всех стадиях атеросклероза, а также в интраплазматических мелких сосудах. При первоначальном поражении только несколько клеток подвергались апоптозу. Напротив, при запущенных поражениях было обнаружено, что многие клетки подвергаются апоптозу. Апоптоз был дополнительно подтвержден геномным анализом ДНК с использованием гель-электрофореза. Апоптотическими клетками были либо гладкомышечные клетки, либо макрофаги, но также эндотелиальные и кровеносные клетки. Fas/APO 1 присутствовал в пенных ячейках. Большинство положительных клеток Fas/APO 1 были окрашены на маркер макрофагов CD68 и на альфа-гладкомышечный актин в последовательных срезах. Было обнаружено, что несколько анти-Fas/APO 1 позитивных пенистых клеток подвергаются апоптозу путем двойного окрашивания. Bcl-2 был обнаружен в экспрессирующих FAS / АРО 1 бляшках. Вокруг пенистых клеток, экспрессирующих Fas/APO 1, было обнаружено несколько CD3-позитивных Т-лимфоцитов. Эти данные свидетельствуют о том, что регулируемый Fas/APO 1 апоптоз участвует в развитии прогрессирующих атеросклеротических поражений человека и что он, вероятно, определяет количество массы ткани в пораженных сосудах (Cai Wl, Devaux В, Schaper W, Schaper J. The role of Fas/APO 1 and apoptosis in the development of human atherosclerotic lesions // Atherosclerosis. 1997 Jun; 131 (2): 177-86).

Атеросклероз является основной причиной ишемической болезни сердца, и матриксные металлопротеиназы (ММР) играют важную роль в атеросклерозе, разрушая внеклеточный матрикс, что приводит к ремоделированию сердечно-сосудистой системы. Развитие болезни начинается с появления бляшек, которые, в свою очередь, возникают из-за неправильной работы слоя плоских клеток, выстилающих внутреннюю поверхность сосудов (эндотелий). Стенка сосуда становится толще, и в растущей бляшке накапливается холестерин. На поздних стадиях в крупной бляшке прорастают капилляры, которые обеспечивают приток крови в разросшуюся ткань. Крупные бляшки сами по себе нарушают ток крови по пораженному сосуду, но наиболее опасны в этом случае дестабилизация и образование тромба на поверхности бляшки, что может привести к смерти человека.

Ученые выяснили, что во всех этих процессах большую роль играют матриксные металлопротеиназы. Это ферменты (ускорители реакций), которые могут разрушать все типы белков внеклеточного матрикса. Он составляет основу плотных тканей, в которых располагаются клетки, и участвует в транспорте химических веществ. При расщеплении этих белков под действием ферментов клетки приобретают способность мигрировать активнее, благодаря чему становятся возможными «ремонтные процессы» и структурная перестройка тканей, включая ремоделирование сосудов. Ранее исследователи заметили, что многие заболевания, такие как рак и атеросклероз, сопровождаются сбоем в регуляции этих ферментов

Недавние исследования выявили повышенную экспрессию ММР в атеросклеротическом поражении и их вклад в ослабление сосудистой стенки за счет деградации внеклеточного матрикса. Транскрипция, ферментативная обработка и специфическое ингибирование ММР тканевыми ингибиторами матриксной металлопротеиназы (ТИМП) регулируют эти эффекты. Эти процессы также модифицируются воспалительными цитокинами и сигнализацией контакта клетки с клеткой. Как эксперименты на животных, так и клинический анализ образцов показали, что баланс экспрессии и активации ММР и ингибирование ТИМП имеет решающее значение для развития стенотических и аневризматических изменений. Полиморфизм промотора гена ММР способствует возникновению межиндивидуальных различий в предрасположенности к ишемической болезни сердца. Таким образом, разработка терапевтических препаратов, специально нацеленных на ММР, может быть полезна для предотвращения прогрессирования атеросклеротического поражения, разрыва бляшек и рестеноза (Noboru Watanabe MD, PhD & Uichi Ikeda MD, PhD Matrix metalloproteinases and atherosclerosis // Current Atherosclerosis eports volume 6, Article number: 112.2004).

Экспериментальным путем было неожиданно установлено, что мужчины среднего взрослого возраста (по Классификации ВОЗ - средний взрослый возраст 36-45 лет), с клиническими проявлениями атеросклероза, характеризуются одновременным наличием комбинации СС генотипа гена FAS (rs1159120), а также генотипа АА гена ММР9 (rs17576). Также у них было установлено превышение уровня триглицеридов в крови выше верхней границы физиологической нормы именно в 1,15-2,15 раза, а также приближающийся к верхней границе диапазона нормы уровень клеток, находящихся в апоптозе. В то время как у мужчин аналогичного возраста без клинических проявлений атеросклероза, подобной комбинации генотипов не наблюдалось, а уровень триглицеридов соответствовал норме при дефиците погибших апоптозом клеток.

Наличие такой триады и позволяет спрогнозировать высокий риск развития атеросклероза у мужчин среднего возраста. При отсутствии хотя бы одного из вышеуказанных условий оценивают риск нарушения здоровья через развитие атеросклероза как низкий.

В уровне техники не было известно использование такой совокупности маркерных показателей в комплексе для прогнозирования развития атеросклероза.

Удалось установить, что из патента US №9892229 известен способ определения вероятности наличия рака мочевого пузыря у субъекта по определению в биологической жидкости (моче, крови, плазме, сыворотке) набора биомаркеров, выбранных из группы, включающей: CRP; EGF; IL-6; IL-1а; ММР9; IL-4; ТМ; IL-2; TNFa; sTNFRI; STNFR2; ММР9/NGAL комплекс; СЕА; CK18; IL-1β; IL-8; dDimer; VEGF; NGAL; BTA; FPSA; vWF; HA; NSE; MCP1; NMP22; TPSA и FAS, а также учитывающий пол субъекта, наличие камней в почках, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, прием антигипертензивных, антиагрегантных и противоязвенных препаратов, статус курения. В известном способе использованы те же показатели, что и в настоящей заявке, однако, методы определения белков ММР9 и FAS основаны на идентификации экспрессии продуктов генов, а не самого гена, что не соответствует принципу оценки предрасположенности (вероятности). Кроме того авторы применили диагностический подход к патологии, пусть и связанной патогенетически с апоптозом, однако клинически проявляющейся злокачественной пролиферацией (рак мочевого пузыря), а не доброкачественной (атеросклероз). Вместе с этим назначение указанного изобретения отличается от предлагаемого способа. Поэтому эта известность не влияет на новизну и изобретательский уровень заявляемого способа.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что поставленный технический результат обеспечивается за счет совокупности операций предлагаемого способа, их последовательности и режимов его реализации.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом. 1. Была отобрана группа мужчин численностью 55 человек, возраст которых подпадает в диапазон 36-45 лет. Производят отбор пробы крови в специальные пробирки с антикоагулянтом ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) (0,05М раствор ЭДТА в соотношении 500 мкл крови на 50 мкл антикоагулянта) - для определения содержания триглицеридов. При этом определение триглицерида в крови проводят согласно Инструкции по применению набора реагентов для количественного определения содержания триглицеридов в сыворотке или плазме крови человека «Триглицериды - UTS» (https://pandia.ru/text/78/094/96.php)

2. У указанных мужчин отбирают пробу буккального эпителия (в виде мазка со слизистой оболочки щеки). После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную пробирку типа «Эппендорф» с 500 мкл транспортной среды (стерильный 0,9%-ный раствор NaCl). Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.

Далее производят выделение ДНК из пробы. Для этого пробы в количестве 100 мкл лизируют 300 мкл лизирующего раствора, представляющего собой 0,5%-ный раствор саркозила и протеиназы К (20 мг/мл) в ацетатном буфере (рН 7,5). Затем добавляют сорбент (каолин) и последовательными процедурами промывки отмывают фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) пробы от белков и смесью изопропиловый спирт : ацетон от липидов. Нуклеиновые кислоты остаются при этом на сорбенте. Далее адсорбированные на сорбенте ДНК из пробы экстрагируют ТЕ-буфером, представляющим собой смесь 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА (рН 8,0). Экстракт подвергают центрифугированию. После центрифугирования пробирки надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК.

Полученный материал готов к постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полимеразную цепную реакцию проводят на детектирующем амплификаторе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием готовых наборов праймеров и зондов производства ЗАО «Синтол», Россия, в котором в качестве праймеров использовались участки ДНК гена FAS (rs1159120) и гена ММР9 (rs17576).

Проводят реакцию амплификации, это достигается тем, что для исследования аллельного состояния каждого гена у отдельного человека готовят свою реакционную смесь. В каждую пробирку вносят 0,1 мкл готовой смеси праймеров (принятый в генетике термин, обозначающий конечные нуклеотиды с меткой, ограничивающие (отрезающие) амплифицируемую цепочку нуклеотидов гена) и зондов для выбранных генов: гена FAS (rs1159120) и гена ММР9 (rs17576), (использованы Наборы реагентов для определения полиморфизма гена FAS (rs1159120) и гена ММР9 (rs17576), ЗАО «Синтол», Россия).

В каждую пробирку добавляют остальные компоненты необходимые для осуществления ПЦР: нуклеотиды (дезоксинуклеозидтрифосфаты: по 10 мМ дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), буфера (100 мМ трис-HCl-буфера, 500 мМ KCl, 40 мМ MgCl₂) и Tag F-полимеразы. Вносят пробу в количестве 10 мкл. Таким образом, общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Каждая пробирка плотно закрывается пробкой и устанавливается в амплификатор.

При проведении ПЦР амплификацию и детекцию проводят на детектирующем амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad.

Используется универсальная программа амплификации, подобранная производителем реактивов. Она включает в себя несколько этапов: 1 этап - активация TaqF-полимеразы (режим «горячего старта») продолжается 15 мин при 95°С; 2 этап - установочные циклы амплификации без измерения флуоресценции (5 циклов); 3 этап - рабочие циклы амплификации с измерением флюоресценции (40 циклов).

Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК (5 с при 95°С), отжиг праймеров (20 с при 60°С) и саму реакцию полимеризации ДНК (15 с при 72°С).

Регистрация сигнала флюоресценции, возникающего при накоплении продуктов амплификации участков ДНК, проводится в режиме «реального времени» после стадии отжига праймеров для выбранных генов по каналу VIC - для детекции одного из аллельных вариантов генов, и по каналу FAM - для альтернативного варианта.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (N) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой в программном обеспечении для амплификатора CFX96.

По соотношению пороговых циклов, полученных по двум каналам детекции, определяют состояние гена FAS в исследуемом участке ДНК (rs1159120), гена ММР9 в исследуемом участке ДНК (rs17576) (метод аллельной дискриминации). Возможных вариантов состояния гена было два: гомозиготное (генотип СС и ТТ для FAS и генотип АА и GG для ММР9) - в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии) и гетерозиготное (генотип СТ для FAS и генотип AG для ММР9) - в случае, когда получено два значения пороговых циклов и по этим каналам получены параболические кривые флюоресценции. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходит в реакции, устанавливаются различные генотипы гена FAS (rs1159120) и гена ММР9 (rs17576).

3. И при наличии комбинации СС генотипа гена FAS (rs119120), а также генотипа АА гена ММР9 (rs17576), при одновременном превышении уровня триглицеридов в крови выше верхней границы физиологической нормы в 1,15-2,15 раза, оценивают риск развития атеросклероза у мужчин среднего возраста как высокий. Показатель триглицеридов является подтверждающим фактором изменения состояния эндотелия сосудов и риска формирования атеросклероза и гипертонической болезни.

Для доказательства достоверности заявляемых критериев диагностики прогнозирования риска развития у мужчин атеросклероза в группе мужчин с клиническим диагнозом атеросклероз методом МР-ангиографии были установлены начальные признаки окклюзионно-стенотического поражения, что является подтверждающим фактором реализованного риска развития атеросклероза.

Данные, полученные в результате исследований, приведены в таблице 1.

Содержание триглицеридов - фактор риска формирования атеросклероза и на уровнях его содержания выше диапазона нормы (0,3-1,7 ммоль/дм³). Таким образом, установлены высокие значения уровня триглицеридов и нормальное содержание рецептора клеточной смерти CD95. Экспрессия CD95 в норме, т.к. ген имеет наиболее часто встречающийся в природной популяции аллель (нормальный), т.е. клеток апоптоза много - на верхней границе нормы, они и формируют атеросклеротическую бляшку. На фоне наличия СС генотипа гена FAS (rs1159120), кодирующих рецепцию CD95, с накоплением апоптотических клеток в очаге атеросклероза и участием регулируемого апоптоза в развитии прогрессирующих атеросклеротических поражений человека, а также АА генотипа гена ММР9 (rs17576), фермента, ответственного за формирование процесса атеросклеротической модификации эндотелия, белки, играющие важную роль в атеросклерозе, разрушая внеклеточный матрикс, что приводит к ремоделированию сердечно-сосудистой системы.

Данные, приведенные в таблице 1, показывают, что при одновременном сочетании наиболее часто встречающихся в природной популяции генотипов СС генотипа гена FAS (rs1159120) и АА генотипа гена ММР9 (rs17576) (пациенты 1-4), наблюдается проявления атеросклероза, что доказывается методом MP-ангиографии с установлением начальных признаков окклюзионно-стенотического поражения артерий у этой группы мужчин и повышением у них в крови по сравнению с физиологической нормой уровня триглицеридов (более 1,7 ммоль/л), а также содержания на уровне верхней границы диапазона нормы клеток в состоянии апоптоза (CD95+). Это значит, что при сочетании достаточной экспрессии гена FAS и рецептора CD95, а также высокой экспрессии гена ММР9, разрушающего одноименным ферментом внеклеточный матрикс, с заполнением образовавшегося дефекта апоптоз-измененными клетками, формируется атеросклеротическая окклюзия сосудов с избыточным содержанием триглицеридов, с развитием у мужчин среднего возраста (36-45 лет) атеросклероза.

Тогда как при измененных генотипах одного из указанных (кандидатных) генов (пациенты 5-7, 8-11) либо СТ и ТТ генотипы гена FAS (rs1159120) в сочетании с наиболее часто встречающимся в природной популяции АА генотипом гена ММР9 (rs17576), либо AG и GG генотипы гена ММР9 (rs17576) в сочетании с наиболее часто встречающимся в природной популяции СС генотипом гена FAS (rs1159120), отсутствуют проявления атеросклеротического повреждения артерий, а уровень триглицеридов находится в пределах физиологической нормы, и уровень иммунокомпетентных клеток в апоптозе ниже либо на нижней границе диапазона нормы, что доказывает наличие ассоциации наиболее часто встречающихся в природной популяции генотипов СС гена апоптоза FAS (rs1159120) и АА гена матриксной металлопептидазы ММР9 (rs17576) с развитием атеросклероза.

Таким образом, это доказывает то, что только одновременное наличие у мужчин среднего возраста, страдающих атеросклерозом, ассоциации наиболее часто встречающихся в природной популяции СС генотипов гена апоптоза FAS (rs1159120) и АА гена матриксной металлопептидазы ММР9 (rs17576), характеризуется появлением негативных эффектов в виде превышения нормы уровня триглицеридов и достаточного (на уровне верхней границы диапазона нормы) содержания погибших в апоптозе клеток (CD95+), что формирует риск развития атеросклероза, и таким образом подтверждается точность и достоверность предлагаемого способа.

Для иллюстрации реализации предлагаемого способа приведены два примера по конкретным пациентам - мужчинам, близким по возрасту и одной этнической принадлежности, у первого из которых установлено наличие одновременно наиболее часто встречающихся в природной популяции СС генотипов гена апоптоза FAS (rs1159120) и АА гена матриксной металлопептидазы ММР9 (rs17576), а также наличие высокого уровня триглицеридов, ассоциированной с подтвержденным клинически атеросклеротическим поражением артерий, а у второго пациента - только одного из двух указанных генов с наиболее часто встречающимся в природной популяции генотипом - генотипа гена апоптоза FAS (rs1159120), а второй генотип - гена матриксной металлопептидазы ММР9 (rs17576) изменен, что изменило программу формирования атеросклероза и данная патология у пациента не вывляется.

Пример 1. Пациент, 45 лет, русский, атеросклероз. Установлено наличие нормального гомозиготного СС генотипа гена FAS (rs1159120), а также АА генотипа гена гена ММР9 (rs17576). Содержание триглицеридов в крови - маркера формирующегося атеросклероза - 3,63 ммоль/см³, т.е. выше диапазона нормы (0,3-1,7 МЕ/мл). Уровень мембранного маркера апоптоза CD95+ в крови - маркера состояния клеточной гибели - 0,793*10⁹/дм³, т.е. в диапазоне нормы (0,630-0,970*10⁹/дм³). Таким образом, установлены высокие значения уровня триглицеридов и достаточный рецептора, запускающего клеточную гибель, на фоне нормального генотипа гена FAS (rs1159120) - СС, а также нормального гомозиготного генотипа гена ММР9 (rs17576) АА, кодирующих белки-рецепторы, ответственные за клеточную гибель и экспрессию белков-ферментов, принимающих участие в разрушении внеклеточного матрикса, ремоделировании сосудистой системы, когда в случае экспрессии первого гена (FAS rs1159120) создаются условия, способствующие накоплению потерявших функционал эндотелиальных и дендритных клеток, с формированием при участии экспрессии второго гена ММР9 rs17576 АА соединительной ткани у данного пациента.

Это говорит о том, что, согласно предлагаемому способу, у данного пациента (мужчины) состояние атеросклеротического поражения сосудов, подтвержденное клинически сформировалось в условиях генетической предрасположенности, ассоциированной с генотипами СС гена FAS rs1159120 и АА гена ММР9 rs17576, которые можно отнести к кандидатным генам формирования атеросклероза.

Для доказательства данного вывода, были установлены следующие показатели метаболизма у данного пациента, которые имели следующие значения: уровень глюкозы - 6,5 ммоль/дм³ (физиологическая норма 3,3-5,5 ммоль/дм³); уровень ЛПНП - 4,7 ммоль/дм³ (норма 1,5-3,9 ммоль/дм³).

Анализируя представленные данные, можно сделать вывод, что у пациента имеются изменения в углеводном и жировом обменах, в частности, наличие избыточного содержания глюкозы и липопротеидов низкой плотности, которое характеризует наличие нарушений их утилизации, то есть сниженного энергетического обмена, что запускает процессы метаболических нарушений, ведущих к формированию ожирения, ассоциированного с контаминацией алюминием.

Это говорит о том, что, согласно предлагаемому способу, у данного пациента состояние оценивается, как реализация генетического риска развития у мужчин атеросклероза.

Пример 2. Пациент, 40 года, русский, здоров. Установлено наличие нормального гомозиготного генотипа гена FAS rs1159120 - СС, а также гетерозиготного генотипа гена гена ММР9 rs17576 - AG. Содержание триглицеридов в крови - маркера формирующегося атеросклероза - 0,33 ммоль/см³, т.е. в диапазоне нормы (0,3-1,7 МЕ/мл). Уровень мембранного маркера апоптоза CD95+ в крови - маркера состояния клеточной гибели - 0,638*10⁹/дм³, т.е. в диапазоне нормы (0,630-0,970*10⁹/дм³). Таким образом, установлены нормальные значения уровня триглицеридов, несмотря на достаточный уровень рецептора, запускающего клеточную гибель, в условиях нормального генотипа гена FAS rs1159120 - СС, так как гетерозиготный вариант генотипа гена MMP9 rs17576 AG не приводит к избыточному разрушению внеклеточного матрикса и формированию очага атеросклеротического поражения сосудов. То есть в отсутствии негативной генетической программы одного из патогенетически значимых полиморфизмов АА ММР9 rs17576, наличие только одного из двух кандидатных полиморфизмов - нормального гомозиготного генотипа гена FAS rs1159120 - СС не приводит к развитию атеросклероза у данного пациента.

Для доказательства данного вывода - отсутствия нарушений углеводного и жирового обменов, были установлены следующие показатели метаболизма у данного ребенка, которые имели следующие значения: уровень глюкозы - 5,0 ммоль/дм³ (физиологическая норма 3,3-5,5 ммоль/дм³); уровень ЛПНП - 3,1 ммоль/дм³ (норма 1,5-3,9 ммоль/дм³).

Таким образом, приведенные данные показывают, что при реализации предлагаемого способа с использованием предлагаемых критериев обеспечивается его назначение.

Заявляемый способ позволяет с достаточной достоверностью установить предвестники формирования атеросклероза у мужчин среднего возраста по заявляемым генетическим критериям - комбинации двух генотипов кандидатных генов - генотип СС гена FAS rs1159120, а также генотип АА гена ММР9 rs17576, при одновременном превышении относительно нормы уровня триглицеридов, и начать профилактические мероприятия.

Способ выявления предрасположенности к развитию атеросклероза у мужчин среднего возраста, включающий использование в качестве диагностического критерия наличие полиморфизма гена, отличающийся тем, что отбирают у пациента пробу буккального эпителия и осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты ДНК, затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции ПЦР проводят генотипирование полиморфизма генов FAS и ММР9, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена FAS (rs1159120) и гена ММР9 (rs17576), в пробе крови пациента определяют содержание триглицеридов, и при одновременном выполнении следующих условий: наличии комбинации СС генотипа гена FAS (rs1159120), а также генотипа АА гена ММР9 (rs17576), при одновременном превышении уровня триглицеридов в крови выше верхней границы физиологической нормы в 1,15-2,15 раза, оценивают риск развития атеросклероза у мужчин среднего возраста как высокий.