Универсальная модифицированная питательная среда m-s для клонирования микрорастений земляники сорта ирма, елизавета в условиях in vitro

Изобретение относится к области биотехнологии и предлагает собой способ создания универсальной оптимизированной питательной среды, при котором в питательной среде Мурасиге-Скуга снижается концентрация 6-БАП с 0,5 мл/л до 0,35 мл/л с последующим стимулированием продуцирования цитокининов растениями, содержанием индолилуксусной кислоты (ИУК) 0,2 мг/л при одновременном снижении концентрации углеводного компонента (сахарозы) до 25 г/л. Предлагаемая универсальная модифицированная питательная среда для использования в условиях in vitro на этапе мультипликации земляники (сорта Ирма, Елизавета) позволила повысить коэффициент размножения на 34,05. 2 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ повышения эффективности размножения in vitro земляники садовой на жидкой среде. Результаты данного изобретения могут быть использованы при получении посадочного материала земляники сорта Ирма, Елизавета.

Предлагается способ создания универсальной оптимизированной питательной среды, при котором в питательной среде Мурасиге-Скуга снижается концентрация 6 - БАП с 0,5 мл/л до 0,35 мл/л с последующим стимулированием продуцирования цитокининов растениями, содержание индолилуксусная кислота (ИУК) 0,2 мг/л при одновременном снижении концентрации углеводного компонента (сахароза) до 25 г/л.

Известен способ, предлагаемый авторами патента №: RU 2527065 С2 предлагают окислять воду углекислым газом и получать раствор первичных Сахаров вне растения, используя для этого энергию кратковременного повышения давления и возникающих при прохождении раствора углекислого газа в воде через напорный насос кавитационных эффектов как эквивалента энергетического воздействия светового фотона на реакции фотосинтеза, проходящие в молекулах хлорофилла в растениях. [Коваленко Д.В., Смирнов А.П. Способ подкормки растений, выращиваемых в защищенном грунте. Патент на изобретение №: RU 2527065 С2].

Требование растений ягодных культур на этапе ввода апексов in vitro к составу питательной среды не значительны [Попов Ю.Г./ Биологические науки. - 1976. - №6. - с. 13-24] и существенно возрастают на этапе мультипликации. Наибольшее влияние на коэффициент размножения растений земляники оказывают гормоны роста. Наиболее распространенными в биотехнологии растений являются три группы фитогормонов - ауксины, цитокинины и АКБ [Гормоны растений: регуляция концентрации, связь с ростом и водным обменом /Д.С. Веселов, С.Ю. Веселов, Л.Б. Высоцкая и др.; [отв. ред. Ф. М. Шакирова]; Ин-т биол. УНЦРАН. - М: Наука, 2007. - 158 с. ISBN 978-5-02-035889-8].

Ответственными за проявление пролиферации являются цитокинины. Цитокинины обладают уникальной особенностью, так как включают целую группу веществ, большинство из которых способны легко превращаться друг в друга. Многие из соединений данного класса гормонов обладают активностью, характерной для цитокининов (способность стимулировать деление клеток и формирование побега в культуре тканей, активировать синтез хлорофилла и задерживать его распад, поддерживать устьица в открытом состоянии, стимулировать ветвление и т.д.). [Мок D.W.S., Мок М.С. Cytokinin metabolism and action // Annu. Rev. PlantPhysiol, andPlantMol. Biol. 2001. Vol. 52. P. 89-118]. В качестве цитокинина, повышающего пролиферацию растительных тканей в традиционных средах для размножения используется 6-бензиламинопурин (6-БАП) в дозе 0,5 мг/л.

Но использование цитокининов может сопровождаться негативными последствиями, в частности нарушением оптимального баланса массы надземной и подземной частей растений [Г.А. Романов, С.С. Медведев. Ауксины и цитокинины в развитии растений. Последние достижения в исследовании фитогронов. 2-й иеждународный симпозиум. Прага, 7-12 июля, 2005 г. Физиология растений, 2006, Т. 53, №2, с. 309-319].

Так, известно, что дефицит цитокининов приводит к смещению оптимального баланса между объемом надземной и подземной частей растений. В большей степени задерживается рост побега и активизируется рост корней. Это позволяет рассматривать цитокинины как "отрицательный" регулятор (ингибитор) роста корней. Следовательно, повышение 6-БАП в питательном растворе может привести еще к одному негативному эффекту - снижению синтеза цитокининов естественным путем, основная часть которого синтезируется в корневой части. [Г.А. Романов, С.С. Медведев. Ауксины и цитокинины в развитии растений. Последние достижения в исследовании фитогормонов. 2-й международный симпозиум. Прага, 7-12 июля, 2005 г. Физиология растений, 2006, Т. 53, №2, с. 309-319].

Считается, что минеральная основа наиболее распространенных питательных сред с добавлением глюкозы или сахарозы 20-40 г/л и 6-8 г/л агара не нуждается в дальнейшей модификации, так как множество опытов свидетельствуют о том, что растения на них размножаются достаточно успешно [Муратова С.А., Шорников Д.Г., Янковская М.Б. Размножение садовых культур in vitro (методические рекомендации) /Муратова С.А., Шорников Д.Г., Янковская М.Б. - Мичуринск-наукоград, 2008. - 69 с.]. Тем не менее, модификация питательной среды минеральными компонентами имеет особые перспективы, учитывая, что каждый элемент выполняет в растительном организме особую физиологическую роль, в частности влияет на гормональный состав. В качестве примера приведем азот, который в нитратной форме способен стимулировать синтез цитокининов в корнях, что увеличивает их приток в побеги, вызывая активацию фотосинтеза и роста [Sakakibara Н. Nitrate specific and cytokinin-mediated nitrogen signaling pathways in plants I I J. Plant Res. 2003. Vol. 116. P. 253-257.]. Важность данного природного механизма заключается в том, что растение выступает объектом саморегуляции, то есть создаются условия для саморегуляции гормоноального фона в растительном организме. Проведенный авторами патента опыт на землянике (сорта Ирма и Елизавета) продемонстрировал, что замена хлоридной формы кальция (СаСl₂) 440 мг/л на нитратную Са(NO₃)₂ 440 мг/л с одновременным снижением концентрации 6-БАП позволила повысить коэффициент размножения микрорастений на протяжении 3-х периодов мультипликации в среднем на 20,5%.

Количество микропобегов возможно достичь так же за счет повышения концентрации железа в питательной среде. Имеются данные, свидетельствующие об увеличении микропобегов при повышении концентрации хелата железа в 2 раза [Д.Г. Шорников, С.А. Брюхина, С.А. Муратова, М.Б. Янковская, Р.В. Папихин. Оптимизация условий культивирования In vitro ягодных и декоративных культур. Вестник ТГАУ, т. 15. вып. 2, 2010. с. 640-645].

Дисбаланс ауксинов и цитокининов не позволяет получить ожидаемые результаты по коэффициенту микроразмножения. В связи с этим, так же, как и с цитокинином, важно учесть особенности поведения ауксинов в растительном организме.

Ауксин является одним из важнейших гормонов высших растений. Он активирует деление и растяжение клеток, необходим для формирования сосудов и боковых корней. Полярный транспорт ИУК обусловливает явление апикального доминирования и обеспечивает разметку и дифференцировку тканей в ходе онто- и морфогенеза. Из всех фитогормонов, только для активных ауксинов характерно ярко выраженное полярное передвижение по тканям. Но известно, ауксины конъюгируют с углеводсодержащими веществами, в частности глюкозой и др. [Г.А. Романов, С.С. Медведев. Ауксины и цитокинины в развитии растений. Последние достижения в исследовании фитогормонов. 2-й международный симпозиум. Прага, 7-12 июля, 2005 г. Физиология растений, 2006, Т. 53, №2, с. 309-319]. В такой форме активность ауксинов снижается.

Эффективность самого механизма обогащения углекислотой при наличии достаточного количества фотосинтетически активной радиации (ФАР) демонстрирует универсальность. В ходе природных фотосинтетических реакций энергия фотонов света возбуждает в молекулах хлорофилла растений атомы магния (Mg) и в клетках растений происходит взаимодействие углекислого газа с водой, в результате чего синтезируются простейшие моносахариды СН₂, которые используются для энергетического обмена в растениях и формирования клетчатки растений.

Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности размножения земляники садовой на жидкой среде с одновременным сокращением продолжительности культивирования и сохранением качественных характеристик растений.

Поставленная цель достигается за счет использования жидкой среды Мурасиге-Скуга (Murashige Т. & Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. // Physiol. Plant, 15 (1962) 473-497) с добавлением БАП 0,35 г/л и индолилуксусной кислоты (ИУК) 0,2 мг/л при одновременном снижении концентрации углеводного компонента (сахарозы) до 25 г/л.

Включение в питательную среду углекислоты происходит методом насыщения при температуре 25°С на протяжение 30 минут.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

Основа питательной среды - бидистиллированная вода насыщается углекислым газом из расчета 50±2.5 мг/литр воды. В качестве источника используются промышленные баллы СO2 до 5 литров. Для получения заданной концентрации углекислоты вода нагревается до 43°С и поддерживается на протяжение процесса насыщения.

Газ подается через пластиковую трубку, конец которой расположен на дне емкости с водой. Продолжительность подачи газа регулируется показателем кислотности. Так как кислотность воды при поступлении газа снижается пропорционально его концентрации в воде, то по достижение стабильного в течение 10 минут показателя рН служит признаком получения заданной концентрации.

Для дальнейшего приготовления питательной среды используются стандартные маточные растворы для среды Мурасише-Скуга. Количество солей и других компонентов питательной среды приведены в таблице 2.

Первоначально бидистиллированную воду, насыщенную углекислым газом, растворяют сахарозу в химическом стакане или колбе емкостью 1 л. Концентрация сахарозы составляет 25 г/л. Емкость наполняется на 1/2. далее по схеме добавляются расчетные концентрации макро и микросолей, витаминов. Посуда с солями доводится до 1 литра ранее насыщенной СO2 водой. Перед введением фитогормонов кислотность раствора доводится до оптимальных показателей рН, равной 5,6-5,8. Для регуляции кислотности используются стерильные растворы щелочи.

Для получения твердой питательно среды используется агар-агар, который предварительно замачивается для набухания, после чего нагревают на электроплите до полного растворения и сливают с готовой питательной средой.

Питательную среду разливают в пробирки до 1/3 объема, закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве. Стерилизация проводится при 1 атм и 120°С в течение 20 минут. В остывшую среду стерильно вносятся раствор витаминов Мурасиге-Скуга и регулятор роста 6-БАП в концентрации 0,35 м г/л.

Данная питательная среда используется на этапе мультипликации микрорастений земляники, которые были получены на стандартных средах, используемых на этапе ввода эксплантов в культуру in vitro.

Культивирование микрорастений проводится в течение 28 дней при фотопериоде 16/8 и освещенности 1000 люкс. На всем этапе мультипликации состав питательной среды и процесс ее приготовления остается первоначальным.

Предлагаемая универсальная модифицированная питательная среда для использования в условиях in vitro на этапе мультипликации земляники (сорта Ирма, Елизавета) позволила повысить коэффициент размножения на 34,05.

Питательная среда для клонирования микрорастений земляники сорта Ирма, Елизавета в условиях in vitro, при следующем содержании исходных компонентов:

NH₄NO₃ – 1650 мг/л

KNO₃ – 1900 мг/л

MgSO₄*7H₂O –370 мг/л

KH₂PO₄ – 170 мг/л

H₃BO₃ – 6, 2 мг/л

MnSO₄*4H₂O – 22,3 мг/л

СоCl₂*6H₂O – 0,025 мг/л

CuSO₄*5H₂O – 0,025 мг/л

ZnSO₄*7H₂O – 8,6 мг/л

Na₂MoO₄*2H₂O – 0,25 мг/л

FeSO₄*7H₂O – 55,6 мг/л

Na₂ЭДТА*2H₂O – 37,3 мг/л

KI – 0,83 мг/л

Ca(NO₃)₂*4H₂O – 440 г/л

Сахароза – 25 мг/л

Тиамин – 1,0

Пиридоксин – 0,5 мг/л

Глицин – 0,05 мг/л

Инозит – 100 мг/л

Агар – 5-8 г/л

6-БАП – 0,35 мг/л

ИУК – 0,2 мг/л.