Способ определения генетических маркеров для оценки полигенного риска развития рака молочной железы (гормон-негативного и гормон-позитивного подтипов)

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и касается способа определения генетических маркеров полигенного риска развития рака молочной железы (РМЖ). Предложен способ анализа 38 генетических маркеров для оценки полигенного риска развития гормон-негативного и гормон-позитивного подтипов РМЖ: 11q13.1 (rs3903072), 12q24 (rs12920U), 19q13.31 (rs3760982), 2q14.2 (rs4849887), 2q35 (rs16857609, rs13387042), 6q14.1 (rs17529111), 8p21.1 (rs9693444), 8q21.11 (rs6472903), 8q24.21 (rs11780156), BRCA2 (rs11571833), CASP8 (rs1045485), CCND1 (rs78540526), CDCA7 (rs1550623), CDKN2A/B (rs1011970), CHEK2 I157T (rs17879961), DNAJC1 (rs11814448), EBF1 (rs1432679), ESR1 (rs12662670, rs2046210), FGFR2 (rs2981579), FOXQ1 (rs11242675), FTO (rs17817449), HNF4G (rs2943559), LSP1 (rs3817198), MKL1 (rs6001930), NTN4 (rs17356907), PDE4D (rs1353747), PEX14 (rs616488), PTHLH (rs10771399), RAB3C (rs10472076), RAD51L1 (rs999737), SSBP4 (rs4808801), TCF7L2 (rs7904519), TERT (rs2736108, rs7726159), TOX3 (rs3803662), ZNF365 (rs10995190). Изобретение позволяет осуществлять одновременное определение генотипов по выбранным локусам с использованием мультиплексной ПЦР и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом). 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 3 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области персонализированной медицины и касается способа определения генетических маркеров полигенного риска развития (ПГР) рака молочной железы (РМЖ).

Одним из важных факторов риска развития РМЖ является генетическая предрасположенность. Помимо высокопенетрантых и среднепенетратных мутаций, которые обуславливают наследственные формы РМЖ, выявлен ряд однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП), вклад каждого из которых в формирование риска развития РМЖ невелик, однако их совместный эффект при оценке полигенного риска оказывается значимым и может улучшить стратификацию населения по группам риска. Включение в генетический анализ информативных генетических маркеров ПГР может существенно расширить возможности выявления предрасположенности к РМЖ и позволит адресно проводить мероприятия, направленные на профилактику и раннюю диагностику.

Выделяют гормон-негативный и гормон-позитивный подтипы РМЖ, которые отличаются по механизмам возникновения, генетическим характеристикам, характеру течения и применяемой терапии. Некоторые маркеры ПГР информативны только для одного из подтипов (гормон-негативного или гормон-позитивного), другие - для обоих подтипов РМЖ.

Данное изобретение предназначено для определения генетических маркеров, которые могут использоваться для оценки ПГР как гормон-негативного, так и гормон-позитивного подтипов РМЖ.

Уровень техники

Рак молочной железы (РМЖ) - многофакторное онкологическое заболевание. Одним из важных факторов риска развития РМЖ является генетическая предрасположенность. Вклад мутаций высокого и среднего риска (мутации в генах BRCA1, BRCA2, PALB2, NBN, BLM, ATM, RAD50 и некоторых других) составляет только около 25% в случае семейных форм РМЖ и около 5-10% в общей предрасположенности к РМЖ.

При проведении полногеномных ассоциативных исследований (Genome Wide Association Studies, GWAS) на больших когортах больных РМЖ и здоровых доноров (по нескольку десятков тысяч человек) было идентифицировано множество однонуклеотидных полиморфизмов в различных генах и хромосомных локусах, связанных с повышенным риском развития РМЖ. Каждый из полиморфизмов в отдельности оказывает незначительный эффект на вероятность развития заболевания и не может рассматриваться как независимый фактор риска. Однако их совокупный эффект может приводить к существенному повышению риска развития заболевания, что позволило разработать полигенные модели риска. По мере накопления научной информации были предложены модели ПГР на основе различных комбинаций полиморфизмов в количестве 4-10 ОНП [Reeves, Gillian K., et al. "Incidence of breast cancer and its subtypes in relation to individual and multiple low-penetrance genetic susceptibility loci. "Jama 304.4 (2010): 426-434], 77 ОНП [Mavaddat N. et al. Prediction of breast cancer risk based on profiling with common genetic variants // JNCI: Journal of the National Cancer Institute. - 2015. - T. 107. - №. 5], 88 ОНП [Kuchenbaecker K. B. et al. Evaluation of polygenic risk scores for breast and ovarian cancer risk prediction in BRCA1 and BRCA2 mutation carriers // JNCI: Journal of the National Cancer Institute. - 2017. - T. 109. - №. 7], 313 ОНП [Mavaddat N. et al. Polygenic risk scores for prediction of breast cancer and breast cancer subtypes // The American Journal of Human Genetics. - 2019. - T. 104. - №. 1. - C. 21-34].

Для поиска маркеров для моделей ПГР использовали высокопрозводительные технологии генотипипования, такие как биочипы высокой плотности фирмы Illumina, например массив Oncoarray (500000 маркеров). Массив генотипирования iCOGSarray (211 155 маркеров) был совместно разработан консорциумом COGS и фирмой Illumina специально для изучения генетических маркеров связанных с гормонами онкологических заболеваний: рак молочной железы, рак яичников, рак простаты [Bahcall О., Orli В. COGS project and design of the iCOGS array // Nat Genet. - 2013. - T. 45. - №. 4. - C. 343]. Подходы, основанные на высокопроизводительных методиках генотипирования, высокоинформативны и позволили разработать модели для расчета полигенного риска, где каждому маркеру присваивается коэффициент, согласно его вкладу в ПГР. При внедрении в практику и апробации разработанных моделей ПГР использование высокопроизводительных методов может оказаться избыточным с точки зрения необходимых затрат (высокая цена реактивов и оборудования, трудоемкость и длительность анализа) и того, что из сотен тысяч маркеров в анализ включается их небольшая часть. В исследовании, посвященном разработке модели ПГР на основе 14 маркеров, известных по результатам GWAS [Reeves, Gillian K., et al. "Incidence of breast cancer and its subtypes in relation to individual and multiple low-penetrance genetic susceptibility loci. "Jama 304.4 (2010): 426-434], для генотипирования использовали ПЦР в реальном времени с Taqman-зондами. Этот метод быстр и точен, однако не подходит для одновременной детекции большого числа маркеров, т.к. в одной пробирке возможно анализировать только 1-3 маркера. Изучение многих моделей ПГР на основе 70-80 маркеров осуществлялось с генотипированием на биочипах высокой плотности Illumina [Shieh Y. et al. Breast cancer risk prediction using a clinical risk model and polygenic risk score //Breast cancer research and treatment. - 2016. - T. 159. - №. 3. - C. 513-525; Vachon С.M. et al. The contributions of breast density and common genetic variation to breast cancer risk // Journal of the National Cancer Institute. - 2015. - T. 107. - №. 5. - C. dju397; Dite G. S. et al. Breast cancer risk prediction using clinical models and 77 independent risk-associated SNPs for women aged under 50 years: Australian Breast Cancer Family Registry //Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers. - 2016. - T. 25. - №. 2. - C. 359-365].

Столь трудоемкие и дорогостоящие анализы могут быть серьезным препятствием при проведении аналогичных исследований в российской популяции, а тем более при внедрении такого тестирования в клиническую практику. Таким образом, в данной области существует объективная потребность в разработке эффективных и доступных инструментов для проведения генетического тестирования с целью оценки полигенного риска развития РМЖ, которые бы выгодно отличались простотой проведения анализа, высокой информативностью и невысокой стоимостью.

Предлагаемый в настоящем изобретении способ обладает рядом важных преимуществ: быстрая и простая пробоподготовка, невысокая стоимость реагентов и необходимого оборудования, возможность одновременного определения широкого спектра генетических маркеров. Данный способ касается определения генетических маркеров, информативных как для гормон-положительного, так и для гормон-отрицательного подтипов РМЖ (маркеры, специфичные только для одного из подтипов в анализ не включены).

Раскрытие сущности изобретения

Задача настоящего изобретения состоит в создании способа определения генетических маркеров полигенного риска развития гормон-негативного и гормон-позитивного подтипов РМЖ. Панель включает 38 генетических маркеров, которые позволяют оценить уровень полигенного риска развития РМЖ.

Сущность изобретения заключается в обеспечении способа анализа 38 ОНП (Таблица 1).

Основными признаками данного изобретения являются мультиплексная ПЦР и последующая гибридизация продуктов на биочипе, содержащем набор иммобилизованных олигонуклеотидных зондов.

Первый важный признак изобретения - набор праймеров для амплификации анализируемых локусов, который используется для получения флуоресцентно-меченных продуктов в необходимом количестве для гибридизации на биочипе. Последовательности праймеров для проведения ПЦР приведены в Перечне последовательностей 1 (последовательности SEQ ID NO: 1-76).

Второй важный признак изобретения - биочип, содержащий набор иммобилизованных олигонуклеотидных зондов, последовательности которых приведены в Перечне последовательностей 2 (последовательности SEQ ID NO: 77-152). Олигонуклеотидные зонды иммобилизуются в ячейках гидрогелевого микрочипа, как описано в патенте RU 2206575 (дата публикации 2003-06-20) в концентрации 2000 мкМ. Схема расположения зондов в ячейках биочипа приведена на Фигуре 1.

Набор праймеров для ПЦР используется при проведении мультиплексной ПЦР, результатом которой является флуоресцентно-меченный продукт, который используется для последующей гибридизации на биочипе. Далее проводится гибридизация ПЦР-продукта с иммобилизованными в ячейках биочипа олигонуклеотидными зондами. После проведения гибридизации и отмывки биочипа проводится анализ полученной флуоресцентной картины, на основании которой делается отчет о генотипе исследуемого образца. Пример картины гибридизации приведен на Фигуре 2.

Краткое описание фирур и таблиц

Фигура 1. Схема расположения зондов в ячейках биочипа для определения генетических маркеров полигенного риска гормон-негативного и гормон-позитивного подтипов РМЖ. (а) расположение ячеек на биочипе; (б) расшифровка условных обозначений.

Фигура 2. Гибридизационная картина анализа генетических маркеров полигенного риска гормон-негативного и гормон-позитивного подтипов РМЖ в контрольном образце ДНК, полученная на биочипе.

Таблица 1. Панель определяемых генетических маркеров.

Осуществление изобретения

Для обеспечения оптимальных условий мультиплексной ПЦР необходимо использовать праймеры, обеспечивающие специфичный и эффективный отжиг на мишени при одинаковой температуре, и они не должны образовывать при этой температуре вторичные структуры, в том числе и в условиях мультиплексной ПЦР. Для оптимальной (стабильной и специфичной) наработки необходимого для гибридизации на биочипе количества флуоресцентно-меченного ПЦР-продукта были подобраны и оптимизированы концентрации реагентов в реакционной смеси и температурно-временной режим реакции, которые позволяют осуществлять эффективную наработку исследуемых локусов ДНК в условиях мультиплексной ПЦР.

Для иммобилизации на биочипе подбираются олигонуклеотидные зонды, позволяющие идентифицировать все выбранные для анализа участки генов.

Олигонуклеотидные зонды подобирают в соответствии со следующими критериями:

1) Олигонуклеотидный зонд должен обладать высокой специфичностью к анализируемому локусу.

2) Предпочтительно расположение вариабельного нуклеотида в серединной области зонда, так как такая конструкция зонда позволяет добиться лучшей дискриминации между совершенными и несовершенными дуплексами.

3) Олигонуклеотидный зонд в условиях, при которых проводится гибридизация, не должен образовывать стабильных вторичных структур, наличие которых может приводить к снижению эффективности гибридизации.

Для анализа генетических маркеров полигенного риска гормон-негативного и гормон-позитивного подтипов РМЖ на биочипе было иммобилизовано 76 высокоспецифичных дифференцирующих олигонуклеотидных зондов (Перечень последовательностей 2, последовательности SEQ ID NO: 77-152), структура которых обеспечивает высокоспецифичное связывание с полностью комплементарными ДНК-мишенями. Яркий флуоресцентный сигнал наблюдается только в ячейках, в которых при гибридизации образовался совершенный дуплекс между олигонуклеотидным зондом и флуоресцентно-меченым ПЦР-продуктом.

Приведем последовательность анализа с использованием данного метода.

Амплификация целевых участков ДНК с получением преимущественно одноцепочечных флуоресцентно-меченных ПЦР-продуктов проводится посредством мультиплексной ПЦР. Для проведения ПЦР используют праймеры SEQ ID NO: 1-76 (Последовательности праймеров приведены в Перечне последовательностей 1). В качестве матрицы для проведения реакции используют образец ДНК, выделенный из крови или соскоба буккального эпителия любым известным исследователю методом (фенол-хлороформная экстракция, выделение на колонках, выделение на сорбенте и т.д.). Мультиплексная ПЦР может проводиться как в один, так и в два раунда. При постановке в два раунда в первом раунде осуществляется симметричная наработка анализируемых участков (прямые и обратные праймеры в одинаковых концентрациях), во втором раунде (где в качестве матрицы используют продукт 1-ого этапа ПЦР) обратные праймеры добавляются в избытке, за счет чего нарабатывается преимущественно одноцепочечный ПЦР-продукт. При постановке в один раунд на 5'-конец каждого обратного праймера вводится дополнительный участок, последовательность которого соответствует последовательности универсального праймера, который добавляется в реакцию в избытке, и обеспечивает синтез преимущественно одноцепоцецного продукта [Fesenko D.О. et al. Biochip-based genotyping assay for detection of polymorphisms in pigmentation genes associated with cutaneous melanoma // Genetic Testing and Molecular Biomarkers. - 2016. - T. 20. - №. 4. - C. 208-212]. В ходе мультиплексной ПЦР осуществляется флуоресцентное маркирование ПЦР-продуктов с использованием дУТФ-Су5. В качестве флуоресцентной метки также может быть использован любой флуорохром без ограничения (например, FITC, Texas red, Су-3 и т.д.), а также биотин.

ПЦР может быть проведена с использованием любого вида термостабильной полимеразы (Taq-полимераза, Taq-полимераза с горячим стартом, Tth-полимераза, Tfl-полимераза, Pfu-полимераза, Vent-полимераза, DeepVent-полимераза и других коммерчески доступных ферментов), работающей в соответствующем буфере. Для построения новой цепи в буфер добавляется смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ). Для проведения ПЦР могут быть использованы готовые коммерчески доступные наборы, содержащие все необходимые компоненты за исключением праймеров.

Флуоресцентно-меченные фрагменты ДНК, полученные после проведения ПЦР, гибридизуют с иммобилизованными в ячейках геля олигонуклеотидными зондами, последовательности которых представляют собой участки, комплементарные последовательностям анализируемым участкам.

Гибридизация ПНР-продукта с олигонуклеотидными зондами на биочипе может быть проведена в любом гибридизационном буфере, например, в SSPE-буфере с формами дом или буфере с гуанидином. Гибридизацию проводят 8-14 ч при 37°С. Отмывка биочипа после проведения гибридизации может быть проведена в любом известном в данной области техники буфере (SSC, SSPE и т.п.) или в дистиллированной воде.

Анализируемый фрагмент ДНК в условиях (состав реакции, температура и время гибридизации), при которых осуществляется гибридизация, образует совершенные дуплексы только с полностью комплементарными ему олигонуклеотидными зондами. Сигнал флуоресценции детектируется только в ячейках, в которых образовался совершенный дуплекс. В случае, если дуплекс несовершенный (присутствует хотя бы один не спаренный нуклеотид), то сигнал флуоресценции отсутствует.

Далее проводится визуализация результатов гибридизации с помощью любой детектирующей системы, способной возбуждать флуоресценцию и распознавать флуоресцентный сигнал (например, портативный анализатор биочипов, снабженный ПЗС-камерой и специальным программным обеспечением, производства ООО «БИОЧИП-ИМБ» (Москва, Россия)).

Изготовление биочипов может осуществляться посредством последовательного нанесения на поверхность подложки из стекла ячеек акриламидного геля, активации ячеек и иммобилизации в ячейках модифицированных олигонуклеотидов [Analysis of SNPs and other genomic variations using gel-based chips / A. Kolchinsky, A. Mirzabekov // Hum Mutat. - 2002. - Vol. 19. - P. 343-360. Review]. В качестве подложки кроме стекла может быть использован любой материал, в том числе металл, гибкие мембраны и пластик (Патент RU 2309959, опубликован 2007-11-10). Биочипы также могут быть изготовлены и другими известными способами [Arrays of immobilized oligonucleotides- contributions to nucleic acids technology / H. Seliger, M. Hinz, E. Happ // Curr Pharm Biotechnol- 2003. - Vol. 4. - P. 379-395].

Для изготовления биочипа в настоящем изобретении используется набор олигонуклеотидных зондов SEQ ID NO: 77-152, приведенный в Перечне последовательностей 2. Расположение конкретных олигонуклеотидных зондов на биочипе может варьироваться в зависимости от удобства интерпретации результатов.

Далее приведены примеры, иллюстрирующие возможности применения способа определения генетических маркеров для оценки полигенного риска развития рака молочной железы (гормон-негативного и гормон-позитивного подтипов). Варианты и модификации осуществления изобретения, которые могут быть воспроизведены, не отходя от общей концепции настоящего изобретения и без привлечения собственной изобретательской деятельности, также будут входить в объем притязаний настоящего изобретения.

Пример 1. Амплификация целевых ДНК с целью получения флуоресцентно-меченного ПЦР-продукта в необходимом количестве.

Из крови выделяли ДНК с помощью набора QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, США).

Наработку участков анализируемых генов проводили методом одноэтапной мультиплексной ПЦР. На 5'-конец каждого обратного праймера при синтезе вводили последовательность 5'-TCATTGGATCTCATTA-3'. ПЦР проводили в двух отдельных реакциях для каждого образца ДНК. ПЦР-смесь общим объемом 25 мкл включала в себя: 0.5 ед. акт. Taq-полимеразы с горячим стартом SynTaq («Синтол», Россия), 1×ПЦР-буфер («Синтол», Россия), по 200 мкМ каждого дНТФ («СибЭнзим», Россия), 10 нг ДНК, 50 пмоль универсального праймера с последовательностью 5'-TCATTGGATCTCATTA-3', 8 мкМ флуоресцентно-меченного дУТФ-Су7, по 1 пмоль каждого праймера: реакция №1 содержала праймеры SEQ ID NO: 1-38, реакция №2 содержала праймеры SEQ ID NO: 39-76. Амплификацию проводили по следующей схеме: 40 циклов (94°С 30с, 65°С 30с, 67°С 30с, 69°С 30с, 72°С 20с), далее 40 циклов (94°С 30с, 56°С 10с, 72°С 30с), на амплификаторе Т100 («Bio-Rad», США).

Пример 2. Олигонуклеотидный биочип для анализа генетических маркеров полигенного риска развития гормон-негативного и гормон-позитивного подтипов РМЖ.

Олигонуклеотидные зонды для иммобилизации на микрочипе синтезировали на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer («Applied Biosystems», США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры: на 3'-конец олигонуклеотидов вводили спейсер со свободной аминогруппой, используя метод 3'-Amino-Modifier С7 CPG 500 («Glen Research», США).

Биочип изготтавливали методом сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле (патент RU 2309959, опубликованный 2007-11-10 и RU 2175972, опубликованный 2001-11-20). Биочип содержит 76 иммобилизованных олигонуклеотидных зондов (SEQ ID NO: 77-152), список которых представлен также в Перечне последовательностей 2. Ячейки наносили согласно схеме на Фигуре 1.

Пример 3. Гибридизация флуоресцентно-меченного продукта на биочипе

Реакционную смесь, полученную после проведения ПЦР, описанной в Примере 1, использовали для гибридизации на биочипе. Смешивали 10 мкл формамида («Panreac», Испания), 10 мкл 20×SSPE («Thermo Fisher Scientific)), США) и 10 мкл ПЦР-продукта из реакции №1 и 10 мкл ПЦР-продукта из реакции №2. Полученную смесь наносили на биочип и оставляли на 12 часов при 37°С. После проведения гибридизации биочип отмывали в 1×SSPE в течение 10 минут при комнатной температуре. Пример 4. Регистрация и интерпретация результатов гибридизации Регистрацию гибридизационной картины производили с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой, производимого ООО «Биочип-ИМБ». По полученной гибридизационной картине, представленной на Фигуре 2. определяли генотип образца Генотип образца:

1. rs1011970 GT

2. rs10472076 ТТ

3. rs10995190 GA

4. rs11242675 CC

5. rs11571833 AA

6. rs11780156 TT

7. rs11814448 AA

8. rsl353747 TG

9. rs1432679 AA

10. rs1550623 GG

11. rs16857609 CT

12. rs17356907 AG

13. rs17817449 TT

14. rs2943559 AA

15. rs3760982 GG

16. rs3817198 CC

17. rs3903072 GG

18. rs4808801 AA

19. rs4849887 CC

20. rs6001930 TC

21. rs616488 AA

22. rs6472903 TT

23. rs7904519 AA

24. rs9693444 CA

25. rs999737 CT

26. rs1045485 CC

27. rs10771399 AA

28. rs12662670 TG

29. rs1292011 AA

30. rs13387042 GG

31. rs17529111 AG

32. rs17879961 AA

33. rs2046210 GG

34. rs2736108 TT

35. rs2981579 GA

36. rs3803662 GA

37. rs7726159 CC

38. rs78540526 CT

1. Способ определения 38 генетических маркеров для оценки полигенного риска развития гормон-негативного и гормон-позитивного подтипов рака молочной железы, предусматривающий следующие стадии:

(а) - амплификация анализируемых с помощью мультиплексной ПЦР, в которой в качестве матрицы для амплификации используется ДНК, выделенная из крови или другого биоматериала, полученного от пациента и праймеры, представленные последовательностями SEQ ID NO: 1-76;

(б) - обеспечение биочипа для анализа и идентификации генетических маркеров полигенного риска развития гормон-негативного и гормон-позитивного подтипов РМЖ, набором олигонуклеотидных зондов, представленных последовательностями SEQ ID NO: 77-152;

(в) - гибридизация флуоресцентно-меченного ПЦР-продукта, полученного на стадии (а), на биочипе, полученном на стадии (б);

(г) - регистрация и интерпретация результатов гибридизации на биочипе, проведенной на стадии (в).

2. Набор олигонуклеотидных зондов, представленный последовательностями SEQ ID NO: 77-152, необходимый для идентификации генетических маркеров полигенного риска развития гормон-негативного и гормон-позитивного подтипов РМЖ способом по п. 1.