Способ селекции генотипов малины на содержание антоцианов с помощью молекулярных маркеров

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к селекции новых генотипов малины с помощью микросателлитных маркеров (маркерной селекции). Способ заключается в ПЦР-амплификации ДНК, выделенной из анализируемого образца, с использованием набора из четырех пар праймеров на микросателлитные (SSR) маркеры, разработанные на основе последовательностей структурных и регуляторных генов биосинтеза флавоноидов, идентификации размера ПЦР-ампликонов и выявлении генотипов малины, содержащих набор ПЦР-ампликонов, характерный для сортов с высоким содержанием антоцианов. Заявляемый способ позволяет ускорить селекцию малины на улучшение качества ягод с помощью ДНК-технологий. 2 табл., 4 пр.

 

Классическая селекция растений добилась значительных успехов в выведении высокоурожайных и устойчивых к неблагоприятным факторам сортов, однако селекционеры не прекращают свою работу. Во-первых, появляются новые приемы ведения сельского хозяйства и ухода за растениями, что создает необходимость создания генотипов с агрономическими характеристиками, наиболее подходящими под новые методы. Во-вторых, фитопатогены и вредители постоянно эволюционируют и преодолевают устойчивость растений-хозяев. В-третьих, потребительские предпочтения и требования меняются и производители сельскохозяйственной продукции, употребляемой, главным образом, в свежем виде, вынуждены под них подстраиваться. Фундаментальной основой селекции растений является отбор конкретных растений с желаемыми признаками. Отбор включает оценку исходного селекционного материала, обычно полученного путем гибридизации, по фенотипическим признакам или с помощью биохимических исследований в ходе проведения полевых или тепличных испытаний. Цель селекции растений - собрать в новых сортах наиболее желательные комбинации генов, ответственных за хозяйственно-ценные признаки.

Сочетание генов в гибридном потомстве носит случайный характер и поэтому в типичных программах селекции на конкретный признак проводится оценка сотен и тысяч растений. Кроме того, выведение новых сортов методами классической селекции является длительным процессом. Например, у малины он может занимать до 15 лет (Graham, J.; Jennings, S.N. Raspberry breeding. In: Breeding Tree Crops; Jain, S.M., Priyadarshan, M, Eds.; IBH & Science Publication: Oxford, UK, 2009; pp. 233-248). Его можно ускорить с помощью методов биотехнологии - технологии ДНК-маркеров, основанной на исследованиях в области молекулярной генетики и геномики. Вследствие генетической связи ДНК-маркеров с необходимыми признаками они могут быть использованы для выявления аллельных вариаций в генах, лежащих в основе этих признаков. С помощью ДНК-маркеров эффективность и точность селекции растений могут быть значительно повышены. Использование ДНК-маркеров в селекции растений называется маркер-опосредованной селекций (marker-asssisted selection, MAS). К таким маркерам предъявляется ряд требований - высокая воспроизводимость, способность работать с небольшим количеством ДНК не самого высокого качества, высокая полиморфность и умеренная стоимость анализа. Всем этим требованиям хорошо удовлетворяют микросателлитные (SSR) маркеры.

Основные преимущества маркерной селекции по сравнению с классическим отбором по фенотипическим признакам заключаются в следующем:

1. Отбор ценных генотипов можно производить быстрее и дешевле, особенно для оценки устойчивости к заболеваниям и качественным характеристикам, которые обычно требуют дорогостоящих исследований. Экономия времени и рабочей силы вызвана заменой сложных или трудоемких полевых испытаний (которые должны проводиться в определенное время года или в определенных местах, или являются технически сложными) тестами на ДНК-маркеры.

2. Отбор можно проводить на очень ранней стадии развития, что позволяет сократить число растений для последующих исследований. Это может быть полезно для многих признаков, но особенно для тех, оценка которых возможна только на более поздних стадиях развития, например, плодоношение.

3. Можно отобрать отдельные растения для дальнейших исследований. При традиционных методах исследования для оценки многих признаков приходится выращивать большое количество растений, так как очень сложно отделить влияние генотипа от воздействия факторов окружающей среды. С помощью маркерной селекции отдельные растения могут быть выбраны на основе их генотипа. Кроме того, для большинства признаков гомозиготные и гетерозиготные растения нельзя отличить обычным фенотипическим скринингом.

В конечном итоге все это может значительно ускорить процесс селекции. Однако это направление в селекции растений все еще не получило широкого распространения. Например, только два генотипа малины были получены с помощью маркерной селекции - они обладают устойчивостью к корневой гнили и в настоящее время проходят испытания (Graham, J.; Brennan, R. Introduction to the Rubus genus. In: Raspberry: Breeding, Challenges and Advances; Graham, J., Brennan, R., Eds.; Springer Nature Switzerland AG: Cham, Switzerland, 2018; pp. 1-16).

Малина является ценной ягодной культурой, которая пользуется большим спросом - за период с 2010 по 2017 год производство малины в мире увеличилось на 50% и превысило 800 тысяч тонн. По производству малины в мире лидирует Россия, на долю которой приходится до 25% валового сбора ягод. Ягоды малины отличаются высоким содержанием биоактивных веществ с высокой антиоксидантной активностью, в частности, антоцианов, которые обладают профилактическими и лечебными свойствами против сердечных, онкологических, воспалительных и других заболеваний. Таким образом, увеличение потребления ягод с полезными свойствами будут способствовать улучшению здоровья человека.

Долгое время основными направлениями в селекции плодовых и ягодных растений было повышение урожайности и устойчивости к заболеваниям, а также улучшение способности к транспортировке и хранению. Однако в последние годы в селекции значительно вырос интерес к улучшению качества плодов и ягод и они теперь рассматриваются наряду с урожайностью и устойчивостью к патогенам (Mezzetti, В.; Giampieri, F.; Zhang, Y.-T.; Zhong, C.-F. Status of strawberry breeding programs and cultivation systems in Europe and the rest of the world. J. Berry Res. 2018, 8, 205-221). Повышение уровня биологически активных веществ, в том числе, антоцианов, является одним из направлений повышения качества сельскохозяйственной продукции.

Целью предлагаемого изобретения является ускорение селекции новых генотипов малины с повышенным содержанием антоцианов. Поставленная цель достигается путем идентификации в геноме малины ПЦР-ампликонов, характерных для сортов с высоким содержанием антоцианов, с помощью микросателлитных маркеров, разработанных из структурных и регуляторных генов биосинтеза флавоноидов. Изобретение реализуется следующим образом: а) выделение ДНК позволяет провести полимеразно-цепную реакцию (ПЦР); б) ПЦР с праймерами микросателлитных маркеров позволяет получить фрагменты участков последовательностей ДНК генов биосинтеза флавоноидов, к которым относятся антоцианы, определенной длины; в) фрагментный анализ полученных фрагментов ДНК позволяет установить размер этих фрагментов; г) сопоставление размеров полученных фрагментов ДНК из новых генотипов с размерами фрагментов, характерных для сортов с высоким содержанием антоцианов, позволяет отобрать генотипы с улученными пищевыми свойствами ягод.

Примеры реализации изобретения.

Пример 1. Выделение ДНК.

Геномную ДНК растений малины выделяют с помощью СТАВ-буфера по методу Nunez et al. (Nunes, C.F.; Ferreira, J.L.; Nunes-Fernandes, M.C.; de Souza Breves, S.; Generoso, A.L.; Fontes-Soares, B.D.; Carvalho-Dias, M.S.; Pasqual, M.; Borem, A.; de Almeida Cancado, G.M. An improved method for genomic DNA extraction from strawberry leaves. Ciencia Rural, 2011, 41, 1383-1389). Можно использовать любой другой подходящий способ выделения ДНК.

Пример 2. Проведение ПЦР.

ПЦР проводят в реакционной смеси следующего состава (в расчете на один образец 30 мкл):

- 5х кратная смесь для ПЦР Screenmix (Синтол, Россия) - 6 мкл;

- геномная ДНК (не менее 10 нг/мкл) - 1 мкл;

- смесь прямого и обратного праймеров - 0,5 мкл;

- вода mQ - 22,5 мкл.

Программа амплификации включает в себя этап предварительной денатурации ДНК при 95°С в течение 3 мин, затем прохождение 32 циклов, состоящих из денатурации при 95°С в течение 30 с, отжига при 60°С в течение 20 с, инкубировании при 72°С в течение 40 с, затем финальной элонгации при температуре 72°С в течение 5 мин.

Для амплификации микросателлитных маркеров из генов биосинтеза флавоноидов используют модифицированные 5'-6-FAM прямые олигонуклеотидные праймеры (модификация может быть любой в зависимости от калибровки генетического анализатора) и простые обратные олигонуклеотидные праймеры (таблица 1).

Пример 3. Фрагментный анализ продуктов амплификации.

Фрагментный анализ продуктов амплификации проводят на генетическом анализаторе с капиллярным электрофорезом (например, на анализаторе 3500xL Genetic Analyzer Applied Biosystems) в соответствии с инструкцией производителя. В качестве стандарта длин используют маркер GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 (Thermo Fisher Scientific) или иной. Расшифровку результатов фрагментного анализа проводят с помощью программы, поддерживающей расширение .fsa (например, Peak Scanner, GeneMarker, GeneMapper). Размер ПЦР-ампликонов округляют до целого значения. Для получения точных значений размеров ПЦР-ампликонов и их количества, для каждого генотипа по каждому маркеру фрагментный анализ проводится минимум дважды.

Пример 4. Отбор генотипов малины с повышенным содержанием антоцианов.

Для определения размера ПЦР-ампликонов и содержания антоцианов использовали сорта малины Атлант, Бабье Лето, Брянское Диво, Геракл, Золотая Осень, Маросейка, Метеор, Оранжевое Чудо, Пингвин и Элегантная. Размер ПЦР-ампликонов определяют, как описано в Примерах 1-3. Содержание антоцианов в ягодах определяют по методике, приведенной в «Программе и методике сортоизучения плодовых, ягодных и орехоплодных культур» (Орел: Изд-во ВНИИСПК, 1999). Результаты представлены в таблице 2. Сорта Атлант, Бабье Лето, Геракл, Метеор и Пингвин отличаются высоким количество антоцианов (более 40 мг/100 г) и наличием специфических ПЦР-ампликонов.

Способ селекции генотипов малины на улучшение пищевых свойств (повышение содержания антоцианов) с помощью молекулярных маркеров, включающий выделение ДНК из растительного материала, проведение ПЦР-анализа с праймерами на микросателлитные маркеры из структурных и регуляторных генов биосинтеза флавоноидов и имеющими последовательности SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 8, проведение фрагментного анализа продуктов ПЦР-амплификации (ПЦР-ампликонов) и идентификацию размеров ПЦР-ампликонов с точностью до единицы, дифференциацию генотипов малины по признаку содержания антоцианов на основании размеров ПЦР-ампликонов путем причисления к генотипам с высоким содержанием антоцианов генотипов, обладающих двумя и более признаками из нижеперечисленных: а) наличие фрагмента длиной 255 или 265 п.н. среди ПЦР-ампликонов, амплифицированных в ходе ПЦР с праймерами микросателлитного маркера RcFH01, имеющими последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2; б) наличие только ПЦР-ампликона длиной 328 п.н. при проведении ПЦР с праймерами микросателлитного маркера FaFS01, имеющими последовательности SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4; в) наличие фрагмента длиной 357 п.н. среди ПЦР-ампликонов, амплифицированных в ходе ПЦР с праймерами микросателлитного маркера RiAS01, имеющими последовательности SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6; г) наличие фрагмента длиной 325 или 327 п.н. среди ПЦР-ампликонов, амплифицированных в ходе ПЦР с праймерами микросателлитного маркера RiMY01, имеющими последовательности SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8.