Пентациклическое соединение

Авторы патента:

ХАГИВАРА Кодзи (JP)

ЙОСИДА, Ю (JP)

КОБАЯСИ, Йосихиса (JP)

ОХАСИ, Йосиаки (JP)

НОРИМИНЕ, Йосихико (JP)

ХОСИКАВА, Тамаки (JP)

САТО, Нобухиро (JP)

C07D495/22 - в которых конденсированная система содержит четыре или более гетероциклических кольца

A61P25/28 - для лечения нейродегенеративных заболеваний центральной нервной системы, например ноотропные агенты, агенты для усиления умственных способностей, для лечения болезни Альцгеймера или других форм слабоумия

A61K31/551 - содержащие два атома азота в качестве кольцевых гетероатомов, например клозапин, дилазеп

Владельцы патента RU 2754557:

ЭЙСАЙ Ар ЭНД Ди МЕНЕДЖМЕНТ КО., ЛТД. (JP)

Изобретение относится к соединению, выбранному из соединений, представленных структурными формулами (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), или к его фармацевтически приемлемой соли. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, обладающей активирующим действием в отношении холинергических нейронов и/или нейропротекторным эффектом, на основе указанных соединений. Технический результат – получены новые соединения и фармацевтическая композиция на их основе, которые могут найти применение в медицине для лечения болезни Альцгеймера, деменции с тельцами Леви и болезни Паркинсона с деменцией. 14 н. и 3 з.п. ф-лы, 6 табл., 6 пр.

Область техники

[0001] Настоящее изобретение относится к пентациклическому соединению или его фармацевтически приемлемой соли, обладающему активирующим действием в отношении холинергических нейронов и/или нейропротекторным эффектом, и к его фармацевтическому применению. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим вышеуказанное соединение в качестве активного ингредиента.

Уровень техники

[0002] Холинергические нейроны, которые обеспечивают высвобождение ацетилхолина в качестве трансмиттера, в значительной степени распространены в переднем мозге от базального ядра Мейнерта и ядра перегородки базального отдела переднего мозга до гиппокампа, миндалины и коры головного мозга и вовлечены в модуляцию памяти, обучение, познание и внимание (непатентный литературный источник 1). Более того, холинергические нейроны в педункулопонтийном тегментальном ядре и латеродорсальном тегментальном ядре ствола головного мозга распространены в полосатом теле, прилежащем ядре, черном веществе и таламусе, и считается, что они вовлечены в регуляцию мотивации и бодрствования (непатентные литературные источники 2-4).

[0003] В частности, роль холинергических нейронов в базальном отделе переднего мозга была выяснена в большей степени путем анализа с применением многих животных моделей, таких как модель поражения. В частности, корреляция между функциональным нарушением холинергических нейронов и ухудшением памяти и способности к обучению была показана на животных моделях (непатентные литературные источники 5-7), и было показано, что когнитивная деятельность улучшается за счет увеличения количества ацетилхолина при применении ингибитора холинэстеразы и усиления функции холинергических нейронов (непатентные литературные источники 8-12).

[0004] Сообщалось, что фактор роста нервов (NGF) демонстрирует нейропротекторный эффект в отношении холинергических нейронов на животной модели с потерей холинергических нейронов. (Непатентные литературные источники 13-15).

[0005] В частности, в случае болезни Альцгеймера (AD) потеря холинергических нейронов обнаруживается на ранней стадии AD и является одним из патологических проявлений AD. Накопление сенильных бляшек вследствие отложения бета-амилоида и нейрофибриллярных клубков вследствие агрегации тау-белка также представляет собой патологические проявления AD, и, в частности, известно, что нейрофибриллярные клубки увеличиваются с развитием патологического состояния и это приводит к гибели нейронов. Нейрофибриллярные клубки обнаруживаются в базальном ядре Мейнерта и энторинальной области коры с ранней стадии AD. В том числе сообщается, что потеря холинергических нейронов в базальном ядре Мейнерта за счет агрегации тау-белка обнаруживается на более ранней стадии, и что существует корреляция между потерей и уменьшением показателя когнитивной функции (непатентные литературные источники 16 и 17). Как и в случае с AD, гиперфосфорилирование и аномальное накопление тау-белка обнаруживается у генетически модифицированных мышей с мутацией P301S, которая была обнаружена при наследственной лобно-височной деменции (трансгенные мыши с мутацией P301S, экспрессирующие тау-белок человека). Следовательно, образуются нейрофибриллярные клубки, являющиеся патологическим проявлением AD, (непатентный литературный источник 18), и они вызывают когнитивную дисфункцию из-за синаптических нарушений, нейродегенерации и потери нейронов. На основании этих результатов трансгенные мыши с мутацией P301S, экспрессирующие тау-белок человека, широко применяются в качестве AD-подобных животных моделей (непатентные литературные источники 19-22), и можно ожидать улучшения в отношении снижения когнитивных способностей и подавления развития патологического состояния при болезни Альцгеймера путем подавления AD-подобных патологических изменений у трансгенных мышей с мутацией P301S, экспрессирующих тау-белок человека.

[0006] Кроме того, многочисленные анализы с применением генетически модифицированных мышей и животных моделей нарушений позволяют предположить, что дефицит аксонального транспорта является одной из причин потери холинергических нейронов (непатентные литературные источники 23-25). В том числе аксон холинергических нейронов, который выступает из области перегородки в гиппокамп, имеет нарушения в модели поражения бахромок гиппокампа и свода головного мозга, и при этом нарушение ретроградного транспорта молекул, связанных с выживанием и функционированием, приводит к потере нейронов (непатентные литературные источники 26-28). Нарушение ретроградного транспорта также обнаруживается у генетически модифицированных мышей (непатентные литературные источники 23 и 24), и потеря холинергических нейронов вследствие поражения бахромок гиппокампа и свода головного мозга отражает один аспект патологического состояния. Таким образом, можно ожидать улучшения в отношении снижения когнитивных способностей и подавления развития патологического состояния при болезни Альцгеймера путем подавления или улучшения в отношении потери холинергических нейронов в данной модели нарушения.

[0007] Деменция с тельцами Леви (DLB) и болезнь Паркинсона (PD) представляют собой прогрессирующие нейродегенеративные заболевания, при которых патологические тельца включения (тельца Леви), в основном состоящие из альфа-синуклеина, образуются внутри нейронов и приводят к дегенерации и потере нейронов. Когнитивная дисфункция развивается, если тельца Леви в основном распределены в коре головного мозга, и паркинсонизм развивается, если тельца Леви в основном распределены в стволе головного мозга. В дополнение к этому также развиваются психиатрические симптомы, такие как зрительная галлюцинация, галлюцинация и бред, нарушение сна и вегетативные симптомы. Диагноз представляет собой деменцию с тельцами Леви, если деменция появляется до или в течение одного года от начала паркинсонизма, и диагноз представляет собой болезнь Паркинсона с деменцией (PDD), если паркинсонизм появился до одного года или больше от начала деменции. Деменция с тельцами Леви, болезнь Паркинсона с деменцией и болезнь Паркинсона являются патологически одинаковыми заболеваниями и в целом называются болезнью телец Леви (LBD), хотя они различны по когнитивной дисфункции, и порядку появления, и степени паркинсонизма. При деменции с тельцами Леви и болезни Паркинсона с деменцией, как и в случае с болезнью Альцгеймера, нейроны базального ядра Мейнерта, представляющего собой ядро, являющееся источником холинергического нерва, дегенерируют и гибнут, и сообщается, что появляется тяжелое нарушение холинергических нейронов в гиппокампе и коре головного мозга (непатентные литературные источники 29-31). Кроме того, существует корреляция между развитием нарушения холинергических нейронов и когнитивной дисфункцией (непатентный литературный источник 29), и было продемонстрировано, что ингибиторы холинэстеразы обеспечивают улучшение когнитивной функции. На основании этих результатов когнитивная функция улучшается вследствие улучшения функции холинергических нейронов и, как и в случае с болезнью Альцгеймера, можно ожидать улучшения в отношении снижения когнитивных способностей и подавления развития патологического состояния при деменции с тельцами Леви и болезни Паркинсона с деменцией путем подавления или улучшения в отношении потери холинергических нейронов в нескольких моделях нарушения.

[0008] Следовательно, на основании этих результатов можно ожидать улучшения в отношении снижения когнитивной деятельности, обусловленного дисфункцией холинергических нейронов, путем достижения функциональной активации и/или нейропротекторного эффекта в отношении холинергических нейронов в клинической практике.

[0009] В дополнение к вышеперечисленным заболеваниям примеры заболеваний, для которых сообщалось о связи между снижением когнитивной функции и дисфункцией холинергических нейронов, включают хорею Хантингтона, синдром Дауна, боковой амиотрофический склероз (ALS), большую депрессию, шизофрению и т. п.

Список использованной литературы

Непатентные литературные источники

[0010] [Непатентный литературный источник 1] Everitt BJ et al. "Central cholinergic systems and cognition." Annu. Rev. Psychol. 48 (1997) 649-684.

[Непатентный литературный источник 2] Gulledge AT. et al. "Cholinergic inhibition of neocortical pyramidal neurons." J. Neurosci. 25 (2005) 10308-20.

[Непатентный литературный источник 3] Daniel Dautan D. et al. "A major external source of cholinergic innervation of the striatum and nucleus accumbens originates in the brainstem." J. Neurosci. 34 (2014) 4509-18.

[Непатентный литературный источник 4] M Steriade M. et al. "Neuronal activities in brain-stem cholinergic nuclei related to tonic activation processes in thalamocortical systems." J. Neurosci. 10 (1990) 2541-59.

[Непатентный литературный источник 5] Fischer W. et al. "Progressive decline in spatial learning and integrity of forebrain cholinergic neurons in rats during aging." Neurobiol. Aging 13 (1992) 9-23.

[Непатентный литературный источник 6] Leanza G.et al. "Selective lesioning of the basal forebrain cholinergic system by intraventricular 192 IgG-saporin: behavioural, biochemical and stereological studies in the rat." Eur. J. Neurosci. 7 (1995) 329-43.

[Непатентный литературный источник 7] Leanza G. et al. "Selective immunolesioning of the basal forebrain cholinergic system disrupts short-term memory in rats." Eur. J. Neurosci. 8 (1996) 1535-44.

[Непатентный литературный источник 8] Ogura H. et al. "Donepezil, a centrally acting acetylcholinesterase inhibitor, alleviates learning deficits in hypocholinergic models in rats." Methods Find Exp Clin Pharmacol. 22 (2000) 89-95.

[Непатентный литературный источник 9] Spowart-Manning L. et al. "Spatial discrimination deficits by excitotoxic lesions in the Morris water escape task." Behav Brain Res. 156 (2005) 269-76.

[Непатентный литературный источник 10] Bruce AP. et al. "Choline acetyltransferase activity and cognitive domain score of Alzheimer's patients." Neurobiol. Aging. 21 (2000) 11-17

[Непатентный литературный источник 11] Rogers SL. et al. "The efficacy and safety of donepezil in patients with Alzheimer's disease: results of a US Multicentre, Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Trial. The Donepezil Study Group." Dementia. 7 (1996) 293-303

[Непатентный литературный источник 12] Mori E. et al. "Donepezil for dementia with Lewy bodies: a randomized, placebo-controlled trial." Ann Neurol. 72 (2012) 41-52

[Непатентный литературный источник 13] Mufson EJ. et al. "Human cholinergic basal forebrain: chemoanatomy and neurologic dysfunction." J. Chem. Neuroanat. 26 (2003) 233-242

[Непатентный литературный источник 14] Mufson EJ. et al. "Cholinergic system during the progression of Alzheimer's disease: therapeutic implication." Expert. Rev. Neurother. 8 (2008) 1703-1718

[Непатентный литературный источник 15] Schliebs R. et al. "The significance of the cholinergic system in the brain during aging and in Alzheimer's disease." J. Neural. Transm 113 (2006) 1625-1644

[Непатентный литературный источник 16] Vana L et al. "Progression of tau pathology in cholinergic Basal forebrain neurons in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease." Am J Pathol. 179 (2011) 2533-2550.

[Непатентный литературный источник 17] Gómez-Isla T et al. "Neuronal loss correlates with but exceeds neurofibrillary tangles in Alzheimer's disease." Ann Neurol. 41 (1997) 17-24.

[Непатентный литературный источник 18] Lee VM et al. "Neurodegenerative tauopathies." Annu. Rev. Neurosci. 24 (2001) 1121-1159.

[Непатентный литературный источник 19] Allen B et al. "Abundant tau filaments and nonapoptotic neurodegeneration in transgenic mice expressing human P301S tau protein." J. Neurosci. 22 (2002) 9340-9351.

[Непатентный литературный источник 20] Xu H et al. "Memory deficits correlate with tau and spine pathology in P301S MAPT transgenic mice." Neuropathol. Appl. Neurobiol. 40 (2014) 833-43.

[Непатентный литературный источник 21] Yoshiyama Y et al. "Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model." Neuron. 53 (2007) 337-351.

[Непатентный литературный источник 22] Hoffmann NA et al. "Impaired plasticity of cortical dendritic spines in P301S tau transgenic mice." Acta Neuropathol Commun. 1 (2013) 82.

[Непатентный литературный источник 23] Salehi A et al. "Increased App Expression in a Mouse Model of Down's Syndrome Disrupts NGF Transport and Causes Cholinergic Neuron Degeneration" Neuron 51 (2006) 29-42.

[Непатентный литературный источник 24] Onishi T et al. "Early-onset cognitive deficits and axonal transport dysfunction in P301S mutant tau transgenic mice" Neuroscience Research 80 (2014) 76-85.

[Непатентный литературный источник 25] Xu W et al. "Amyloid precursor protein-mediated endocytic pathway disruption induces axonal dysfunction and neurodegeneration" J. Clin. Invest. 126 (2016) 1815-33.

[Непатентный литературный источник 26] Lapchak PA et al. "Effect of recombinant human nerve growth factor on presynaptic cholinergic function in rat hippocampal slices following partial septohippocampal lesions: measures of [³H]acetylcholine synthesis, [³H]acetylcholine release and choline acetyltransferase activity" Neuroscience 42 (1991) 639-49.

[Непатентный литературный источник 27] Gilmor ML et al. "Coordinate expression of the vesicular acetylcholine transporter and choline acetyltransferase following septohippocampal pathway lesions" J. Neurochem. 71 (1998) 2411-20.

[Непатентный литературный источник 28] Gu H et al. "Recombinant human NGF-loaded microspheres promote survival of basal forebrain cholinergic neurons and improve memory impairments of spatial learning in the rat model of Alzheimer's disease with fimbria-fornix lesion" Neurosci. Lett. 453 (2009) 204-9.

[Непатентный литературный источник 29] Shimada, H. et al., "Mapping of brain acetylcholinesterase alterations in Lewy body disease by PET" Neurology, vol.73, pp. 273-278, 2009.

[Непатентный литературный источник 30] Tiraboschi, P. et al., "Cholinergic dysfunction in diseases with Lewy bodies" Neurology 54 (2000) 407-411.

[Непатентный литературный источник 31] Perry, E. K. et. al., "Neocortical cholinergic activities differentiate Lewy body dementia from classical Alzheimer's disease", NeuroReport, vol.5, pp.747-749 (1994).

Краткое описание изобретения

Техническая задача

[0011] Целью настоящего изобретения является обеспечение соединения или его фармацевтически приемлемой соли, обладающего активирующим действием в отношении холинергических нейронов и/или нейропротекторным эффектом, и имеющего потенциальное применение в качестве терапевтического средства для лечения болезни Альцгеймера, деменции с тельцами Леви и болезни Паркинсона с деменцией.

Решение задачи

[0012] В результате обширных исследований, направленных на решение вышеуказанных проблем, авторы настоящего изобретения обнаружили пентациклическое соединение или его фармацевтически приемлемые соли, обладающее активирующим действием в отношении холинергических нейронов и/или нейропротекторным эффектом.

[0013] То есть настоящее изобретение относится к следующим пунктам <1>-<26>.

<1> Соединение, выбранное из группы, состоящей из

3-фтор-6,11-диметил-6,7,10,11,12,13-гексагидробензо[f]пиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a][1,4]диазепин-5,14-диона:

5,10-диметил-5,6,9,10,11,12-гексагидропиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a]тиено[2,3-f][1,4]диазепин-4,13-диона:

5,10-диметил-5,6,9,10,11,12-гексагидропиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a]тиено[3,2-f][1,4]диазепин-4,13-диона:

(3aS,14aR)-5,10-диметил-3,3a,5,6,9,10,11,12-октагидро-1H-циклопента[f]пиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a][1,4]диазепин-4,13-(2H,14aH)диона:

(3aR,14aR)-5,10-диметил-3,3a,5,6,9,10,11,12-октагидро-1H-циклопента[f]пиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a][1,4]диазепин-4,13-(2H,14aH)диона:

(3aS,14aS)-5,10-диметил-3,3a,5,6,9,10,11,12-октагидро-1H-циклопента[f]пиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a][1,4]диазепин-4,13-(2H,14aH)диона:

или его фармацевтически приемлемая соль.

<2> 3-Фтор-6,11-диметил-6,7,10,11,12,13-гексагидробензо[f]пиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a][1,4]диазепин-5,14-дион или его фармацевтически приемлемая соль:

<3> 5,10-Диметил-5,6,9,10,11,12-гексагидропиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a]тиено[2,3-f][1,4]диазепин-4,13-дион или его фармацевтически приемлемая соль:

<4> 5,10-Диметил-5,6,9,10,11,12-гексагидропиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a]тиено[3,2-f][1,4]диазепин-4,13-дион или его фармацевтически приемлемая соль:

<5> (3aS,14aR)-5,10-Диметил-3,3a,5,6,9,10,11,12-октагидро-1H-циклопента[f]пиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a][1,4]диазепин-4,13-(2H,14aH)дион или его фармацевтически приемлемая соль:

<6> (3aR,14aR)-5,10-Диметил-3,3a,5,6,9,10,11,12-октагидро-1H-циклопента[f]пиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a][1,4]диазепин-4,13-(2H,14aH)дион или его фармацевтически приемлемая соль:

<7> (3aS,14aS)-5,10-Диметил-3,3a,5,6,9,10,11,12-октагидро-1H-циклопента[f]пиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a][1,4]диазепин-4,13-(2H,14aH)дион или его фармацевтически приемлемая соль:

<8> Фармацевтическая композиция, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с любым из <1>-<7> и одну или несколько фармацевтически приемлемых добавок.

<9-1> Фармацевтическая композиция в соответствии с <8>, которая является средством, активирующим нейроны.

<9-2> Фармацевтическая композиция в соответствии с <8>, которая является средством, защищающим нейроны.

<10> Фармацевтическая композиция в соответствии с <8> для лечения когнитивной дисфункции.

<11> Терапевтическое средство для лечения когнитивной дисфункции, содержащее соединение или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с любым из <1>-<7>.

<12> Способ лечения когнитивной дисфункции, включающий введение соединения или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из <1>-<7> пациенту.

<13> Соединение или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с любым из <1>-<7> для применения при лечении когнитивной дисфункции.

<14> Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из <1>-<7> для изготовления терапевтического средства для лечения когнитивной дисфункции.

<15> Терапевтическое средство для лечения болезни Альцгеймера, содержащее соединение или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с любым из <1>-<7>.

<16> Способ лечения болезни Альцгеймера, включающий введение соединения или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из <1>-<7> пациенту.

<17> Соединение или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с любым из <1>-<7> для применения при лечении болезни Альцгеймера.

<18> Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из <1>-<7> для изготовления терапевтического средства для лечения болезни Альцгеймера.

<19> Терапевтическое средство для лечения деменции с тельцами Леви, содержащее соединение или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с любым из <1>-<7>.

<20> Способ лечения деменции с тельцами Леви, включающий введение соединения или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из <1>-<7> пациенту.

<21> Соединение или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с любым из <1>-<7> для применения при лечении деменции с тельцами Леви.

<22> Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из <1>-<7> для изготовления терапевтического средства для лечения деменции с тельцами Леви.

<23> Терапевтическое средство для лечения болезни Паркинсона с деменцией, содержащее соединение или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с любым из <1>-<7>.

<24> Способ лечения болезни Паркинсона с деменцией, включающий введение соединения или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из <1>-<7> пациенту.

<25> Соединение или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с любым из <1>-<7> для применения при лечении болезни Паркинсона с деменцией.

<26> Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из <1>-<7> для изготовления терапевтического средства для лечения болезни Паркинсона с деменцией.

Полезные эффекты изобретения

[0014] Пентациклические соединения, представленные формулами (I)-(VI) (далее в данном документе называемые "соединения (I)-(VI)"), или их фармацевтически приемлемые соли в соответствии с настоящим изобретением обладают активирующим действием в отношении нейронов и/или нейропротекторным эффектом, как показано в данных активности в примерах фармакологических тестов, представленных ниже. Соединения (I)-(VI) по настоящему изобретению обеспечивают улучшение когнитивной деятельности за счет их активирующего действия в отношении нейронов и/или нейропротекторного эффекта и, таким образом, имеют потенциальное применение в качестве терапевтических средств для лечения болезни Альцгеймера, деменции с тельцами Леви и болезни Паркинсона с деменцией.

Описание вариантов осуществления

[0015] Далее в данном документе будет подробно описано содержание настоящего изобретения.

[0016] В настоящем описании для удобства структурные формулы соединений могут представлять собой конкретные изомеры; однако настоящее изобретение может включать поворотные изомеры и таутомеры, а также изомерные смеси без ограничения формулами, описанными для удобства, и может представлять собой любой из изомеров или смесь, содержащую изомеры в любом соотношении.

[0017] Кроме того, могут также существовать полиморфные кристаллы; однако настоящее изобретение также не ограничено каким-либо из них и может представлять собой монокристаллическую форму или их смесь. Более того, настоящее изобретение также включает аморфные формы, и соединения в соответствии с настоящим изобретением включают ангидриды и сольваты (в частности, гидраты).

[0018] Настоящее изобретение также включает меченные изотопом соединения из соединений (I)-(VI). Меченные изотопом соединения являются такими же, как соединения (I)-(VI), за исключением того, что один или несколько атомов заменены одним или несколькими атомами с атомной массой или массовым числом, отличными от тех, что обычно встречаются в природе. Примеры изотопов, которые могут быть включены в соединения по настоящему изобретению, включают изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, фтора, фосфора, серы, йода и хлора и, в частности, включают ²H, ³H, ¹¹C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸O, ¹⁸F, ³²P, ³⁵S, ¹²³I, ¹²⁵I и т. п.

[0019] Вышеупомянутые меченные изотопом соединения, например, соединения, в которые включены радиоактивные изотопы, такие как ³H и/или ¹⁴C, пригодны для анализа распределения в ткани лекарственных препаратов и/или субстратов. ³H и ¹⁴C считаются пригодными из-за легкости их получения и обнаружения. Изотопы ¹¹C и ¹⁸F считаются пригодными для PET (позитронно-эмиссионной томографии), изотоп ¹²⁵I считается пригодным для SPECT (однофотонной эмиссионной компьютерной томографии), и все они пригодны для визуализации головного мозга. Замена на более тяжелые изотопы, такие как ²H, обеспечивает некоторые терапевтические преимущества, в том числе увеличение периода полувыведения in vivo или уменьшение необходимой дозы вследствие более высокой метаболической стабильности и, следовательно, считается пригодной в определенных ситуациях. Вышеупомянутые меченные изотопом соединения можно подобным образом получать путем осуществления процедур, раскрытых в следующих примерах, с применением простых в применении реагентов, меченных изотопами, вместо реагентов, которые не мечены изотопами.

[0020] "Фармацевтически приемлемые соли" в настоящем описании конкретно не ограничены при условии, что они представляют собой соли, образованные с соединениями в соответствии с настоящим изобретением, и конкретные примеры включают соли присоединения кислоты, такие как соли неорганических кислот, соли органических кислот и соли кислых аминокислот.

[0021] "Фармацевтически приемлемая соль" в настоящем описании представляет собой любую соль, образованную в подходящем соотношении, за исключением любого конкретного ограничивающего описания, и число молекул кислоты на одну молекулу соединения в образованной соли конкретно не ограничено; однако предпочтительно, чтобы число молекул кислоты на одну молекулу соединения составляло от приблизительно 0,5 до приблизительно 2, и более предпочтительно, чтобы число молекул кислоты на одну молекулу соединения составляло приблизительно 0,5, приблизительно 1 или приблизительно 2.

[0022] Предпочтительные примеры солей неорганических кислот включают гидрохлорид, гидробромид, сульфат, нитрат и фосфат, а предпочтительные примеры солей органических кислот включают ацетат, сукцинат, фумарат, малеат, тартрат, цитрат, лактат, стеарат, бензоат, метансульфонат, п-толуолсульфонат и бензолсульфонат.

[0023] Предпочтительные примеры солей кислых аминокислот включают аспартат и глутамат.

[0024] Если соединения (I)-(VI) в соответствии с настоящим изобретением получают в свободной форме, их можно превратить в соли, которые могут быть образованы соединениями (I)-(VI) или их гидратами в соответствии с общепринятым способом.

[0025] Если соединения (I)-(VI) в соответствии с настоящим изобретением получают в виде солей соединений (I)-(VI) или гидратов соединений (I)-(VI), то их можно превратить в свободные формы соединений (I)-(VI) в соответствии с общепринятым способом.

[0026] Более того, различные изомеры (например, оптические изомеры, поворотные изомеры, стереоизомеры и т. д.), полученные из соединений (I)-(VI) в соответствии с настоящим изобретением, можно очистить и выделить с помощью общих способов разделения, таких как перекристаллизация, способ с получением диастереоизомерной соли, способ ферментативного разделения, и различных хроматографических методик (например, тонкослойной хроматографии, колоночной хроматографии, газовой хроматографии и т. д.).

[0027] [Фармацевтический препарат]

Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть получена путем смешивания фармацевтически приемлемых добавок с соединением, выбранным из группы соединений (I)-(VI), или его фармацевтически приемлемыми солями. Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть получена с помощью известного способа, например, способа, описанного в разделе "Общие правила получения" в Японской фармакопее, семнадцатое издание.

[0028] Фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением можно соответствующим образом вводить пациенту в зависимости от ее лекарственной формы.

[0029] Доза соединений (I)-(VI) в соответствии с настоящим изобретением или их фармацевтически приемлемых солей изменяется в зависимости от тяжести симптомов, возраста, пола, веса тела, лекарственной формы, типа соли, конкретного типа заболевания и других условий; однако, как правило, суточная доза для взрослого человека в случае перорального введения составляет от приблизительно 30 мкг до 10 г, предпочтительно от 100 мкг до 5 г и более предпочтительно от 100 мкг до 1 г; суточная доза для взрослого человека в случае введения посредством инъекции составляет от приблизительно 30 мкг до 1 г, предпочтительно от 100 мкг до 500 мг и более предпочтительно от 100 мкг до 300 мг; и при этом вышеуказанную дозу вводят один или несколько раз.

[0030] Соединения по настоящему изобретению можно применять в качестве химических зондов для захвата целевых белков биологически активных низкомолекулярных соединений. То есть соединения по настоящему изобретению можно превратить в зонды для аффинной хроматографии, фотоаффинные зонды и т. д. путем введения групп-меток, линкеров или т. п. во фрагмент, отличный от структурного фрагмента, необходимого для проявления активности соединений с применением способа, описанного, например, в J. Mass Spectrum. Soc. Jpn. Vol. 51, No. 5, 2003, pp. 492-498, WO2007/139149 или подобном.

[0031] Примеры групп-меток, линкеров и т. д., применяемых в химических зондах, включают группы, показанные в группе, состоящей из следующих (1)-(5):

(1) группы-метки для белков, такие как фотоаффинные группы-метки (например, бензоильная группа, бензофеноновая группа, азидная группа, карбонилазидная группа, диазиридиновая группа, еноновая группа, диазогруппа, нитрогруппа и т. д.) и химические аффинные группы (например, кетонная группа, в которой альфа-атом углерода заменен атомом галогена, карбамоильная группа, сложноэфирная группа, алкилтиогруппа, акцептор Михаэля, такой как α,β-ненасыщенный кетон или сложный эфир и оксирановая группа);

(2) отщепляемые линкеры, такие как -S-S-, -O-Si-O-, моносахариды (глюкозная группа, галактозная группа и т. д.) или дисахариды (лактоза и т. д.); а также олигопептидные линкеры, отщепляемые посредством ферментативной реакции;

(3) группы с меткой для флуоресцентной гибридизации in situ, такие как биотин и 3-(4,4-дифтор-5,7-диметил-4H-3a,4a-диаза-4-бора-s-индацен-3-ил)пропионильная группа;

(4) радиоактивные группы-метки, такие как ¹²⁵I, ³²P, ³H и ¹⁴C; флуоресцентные группы-метки, такие как флуоресцеин, родамин, дансил, умбеллиферон, 7-нитрофуразанил и 3-(4,4-дифтор-5,7-диметил-4H-3a,4a-диаза-4-бора-s-индацен-3-ил)пропионильная группа; хемилюминесцентные группы, такие как люциферин и люминол; а также маркеры, способные обеспечивать обнаружение ионов тяжелых металлов, таких как ионы металлов-лантаноидов и ионы радия; или

(5) группы для присоединения к твердым носителям, таким как стеклянные шарики, стеклянные пластины, титровальные микропланшеты, агарозные гранулы, агарозные слои, полистирольные гранулы, полистирольные слои, нейлоновые гранулы и нейлоновые слои.

[0032] Зонды, полученные посредством введения в соединения по настоящему изобретению групп-меток и т. д., выбранных из группы, состоящей из вышеуказанных (1)-(5), способами, описанными в вышеуказанных документах или им подобных, можно применять в качестве химических зондов для идентификации меченных белков, пригодных для поиска мишеней нового разрабатываемого лекарственного средства и т. д.

Примеры

[0033] Соединения (I)-(VI) по настоящему изобретению можно получать, например, с помощью способов, описанных в следующих примерах, и эффекты соединений можно подтверждать с помощью способов, описанных в следующих тестовых примерах. Однако это лишь примеры и настоящее изобретение в любом случае не ограничено следующими конкретными примерами и может быть модифицировано в пределах, которые не отступают от объема настоящего изобретения.

[0034] Соединения, описанные с названиями из документов и т. д., означают, что соединения получали в соответствии с документами и т. д.

[0035] Более того, сокращения, применяемые в настоящем описании, хорошо известны и понятны специалисту в данной области техники. В настоящем описании применяются следующие сокращения.

DCE: 1,2-дихлорэтан

DCM: дихлорметан

DIPEA: N, N-диизопропилэтиламин.

DMT-MM: 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид

DMSO: диметилсульфоксид

EDC: 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид

HATU: O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N, N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат

HOBT: 1-гидроксибензотриазол

н-: нормальный

NMM: N-метилморфолин

трет-: третичный

TBD: 1,3,4,6,7,8-гексагидро-2H-пиримидо[1,2-a]пиримидин

TBME: третичный бутилметиловый эфир

TEA: триэтиламин

THF: тетрагидрофуран

¹H-ЯМР: спектрометрия на основе протонного ядерного магнитного резонанса

MS: масс-спектрометрия

HPLC: высокоэффективная жидкостная хроматография

[0036] Термин "комнатная температура" в следующих примерах и примерах получения, как правило, относится к интервалу от приблизительно 10°C до приблизительно 35°C. % относится к весовому проценту, если не указано иное.

[0037] Химические сдвиги на спектрах протонного ядерного магнитного резонанса обозначены в единицах δ (ppm) относительно тетраметилсилана, а константы взаимодействия регистрируются в герцах (Гц). Обозначения мультиплетности обозначаются как s: синглет, d: дублет, t: триплет, q: квартет, m: мультиплет, br: широкий, br.s: широкий синглет.

[0038] Для разделения оптических изомеров соединения применяли Parallex Flex (TM), изготовленный Biotage (колонка: одна из CHIRALPAK (R) AD-H, IA, IB и IC, изготовленная DAICEL; и CHIRALCEL (R) OD-H и OJ-H, изготовленная DAICEL).

[0039] Для реакций с применением микроволнового реактора из примеров получения, ссылочных примеров и примеров применяли Initiator (TM) или Initiator+ (TM), изготовленный Biotage.

[0040] Что касается хроматографии, как силикагель применяли силикагель 60, изготовленный Merck (70-230 меш или 230-400 меш ASTM), или PSQ60B, изготовленный Fuji Silysia Chemical Ltd., или применяли предварительно упакованную колонку {колонка: Hi-Flash (TM) Column (силикагель), изготовленная YAMAZEN, размер: один из S (16×60 мм), M (20×75 мм), L (26×100 мм), 2L (26×150 мм) и 3L (46×130 мм); или Biotage (TM) SNAP Ultra Silica Cartridge, изготовленная Biotage, размер: один из 10 г, 25 г и 50 г}.

[0041] В качестве NH-силикагеля применяли CHROMATOREX NH-DM2035, изготовленный Fuji Silysia Chemical Ltd., или применяли предварительно упакованную колонку {колонка: Hi-Flash (TM) Column (модифицированный аминогруппами силикагель), изготовленная YAMAZEN, размер: один из S (16×60 мм), M (20×75 мм), L (26×100 мм), 2L (26×150 мм) и 3L (46×130 мм); или Presep (TM) (Luer Lock) NH2(HC), изготовленная Wako Pure Chemical Industries, Ltd., размер: один из типа M (14 г/25 мл), типа L (34 г/70 мл), типа 2L (50 г/100 мл) и типа 3L (110 г/200 мл)}.

[0042] В качестве названий соединений, показанных ниже, за исключением обычно применяемых реагентов, использовали названия, показанные в "E-Notebook" версии 12 (PerkinElmer).

[0043] Пример получения 1

Синтез этил-2-амино-6-метил-4,5,6,7-тетрагидротиено[2,3-c]пиридин-3-карбоксилата

TEA (61,6 мл, 442 ммоль) добавляли при комнатной температуре к смеси 1-метил-4-пиперидона (CAS № 1445-73-4) (51,5 мл, 442 ммоль), этилцианоацетата (CAS № 105-56-6) (47,2 мл, 442 ммоль), серы (CAS № 7704-34-9) (14,2 г, 442 ммоль) и этанола (800 мл). Реакционную смесь перемешивали при 40°C в течение 15 часов и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (NH-силикагель, этилацетат). Полученный концентрированный остаток растирали с этилацетатом. Осадки собирали посредством фильтрации, промывали с помощью этилацетата и высушивали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (58,4 г).

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ (ppm): 1,33 (t, J=7,0 Гц, 3H), 2,44 (s, 3H), 2,62-2,70 (m, 2H), 2,79-2,88 (m, 2H), 3,37 (t, J=2,0 Гц, 2H), 4,26 (q, J=7,3 Гц, 2H), 5,97 (br. s, 2H).

MS (ESI) масса/заряд: 241 [M+H]⁺

[0044] Пример получения 2

Синтез 7-фтор-4-метил-3,4-дигидро-1H-бензо[e][1,4]диазепин-2,5-диона

Саркозин (CAS № 107-97-1) (5,16 г, 58,0 ммоль) добавляли при комнатной температуре к раствору 6-фтор-1H-бензо[d][1,3]оксазин-2,4-диона (CAS № 321-69-7) (10,0 г, 55,2 ммоль) в пиридине (100 мл) и реакционную смесь перемешивали при 100°C в течение 8 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры. Осадки собирали посредством фильтрации и промывали с помощью диэтилового эфира. Полученное твердое вещество высушивали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (5,34 г).

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ (ppm): 3,30 (s, 3H), 3,90 (s, 2H), 6,97 (dd, J=8,8, 4,5 Гц, 1H), 7,20 (ddd, J=8,6, 7,6, 2,9 Гц, 1H), 7,67 (dd, J=9,0, 3,1 Гц, 1H), 7,99 (br. s, 1H).

MS (ESI) масса/заряд: 209 [M+H]⁺

[0045] Пример получения 3

Синтез 4-метил-3,4-дигидро-1H-тиено[3,2-e][1,4]диазепин-2,5-диона

Смесь 1H,2H,4H-тиено[3,2-d][1,3]оксазин-2,4-диона (CAS № 78756-28-2) (300 мг, 1,77 ммоль), саркозина (395 мг, 4,43 ммоль) и воды (10 мл) нагревали с обратным холодильником в течение 2 часов. Реакционную смесь охлаждали до 0°С. Осадки собирали посредством фильтрации и последовательно промывали с помощью воды и диэтилового эфира. Полученное твердое вещество высушивали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (165 мг).

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ (ppm): 3,24 (s, 3H), 4,00 (s, 2H), 6,72 (d, J=5,3 Гц, 1H), 7,52 (d, J=5,3 Гц, 1H), 7,96 (br. s, 1H).

MS (ESI) масса/заряд: 197 [M+H]⁺

[0046] Пример получения 4

Синтез 4-метил-3,4-дигидро-1H-тиено[2,3-e][1,4]диазепин-2,5-диона

1H,2H,4H-Тиено[2,3-d][1,3]оксазин-2,4-дион (CAS № 103979-54-0) (600 мг, 3,55 ммоль) добавляли к раствору саркозина (790 мг, 8,87 ммоль) в воде (12 мл). Реакционную смесь нагревали с обратным холодильником в течение 1,5 часа. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры. К реакционной смеси добавляли хлороформ и отделяли органический слой. Водный слой экстрагировали хлороформом (дважды) и этилацетатом (3 раза). Объединенный органический слой высушивали над безводным сульфатом натрия и фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученное твердое вещество высушивали с получением указанного в заголовке соединения (430 мг).

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ (ppm): 3,23 (s, 3H), 3,99 (s, 2H), 6,90 (d, J=5,9 Гц, 1H), 7,29 (d, J=5,7 Гц, 1H), 8,39 (br. s, 1H).

MS (ESI) масса/заряд: 197 [M+H]⁺

[0047] Пример получения 5

Синтез (5aS,8aR)-4-метилоктагидроциклопента[e][1,4]диазепин-2,5-диона

(1) Синтез метил-2-((1S,2R)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-N-метилциклопентанкарбоксамид)ацетата

TEA (22,2 мл, 159 ммоль), HOBT/моногидрат (11,7 г, 76,3 ммоль) и EDC (14,6 г, 76,3 ммоль) последовательно добавляли при охлаждении льдом к смеси (1S,2R)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)циклопентан-1-карбоновой кислоты (CAS № 137170-89-9) (14,6 г, 63,6 ммоль), гидрохлорида сложного метилового эфира саркозина (CAS № 13515-93-0) (10,7 г, 76,3 ммоль) и THF (150 мл). После того, как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 часов, добавляли этилацетат и воду и отделяли органический слой. Водный слой экстрагировали с помощью этилацетата. Объединенный органический слой промывали последовательно насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали дважды с помощью колоночной хроматографии (силикагель, 25-30% этилацетат/н-гептан) с получением указанного в заголовке соединения (16,1 г).

MS (ESI) масса/заряд: 337 [M+Na]⁺

(2) Синтез (5aS,8aR)-4-метилоктагидроциклопента[e][1,4]диазепин-2,5-диона

4 н. раствор смеси хлороводород/1,4-диоксан (160 мл, 640 ммоль) добавляли при охлаждении льдом к метил-2-((1S,2R)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-N-метилциклопентанкарбоксамид)ацетату (16,1 г, 51,3 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при той же температуре в течение 30 минут, затем перемешивали при комнатной температуре в течение 45 минут и концентрировали при пониженном давлении. TBD (8,57 г, 61,6 ммоль) добавляли при охлаждении водой к раствору остатка в метаноле (130 мл). Реакционную смесь перемешивали при охлаждении водой в течение 3 часов и затем охлаждали до 0°C. Полученное твердое вещество собирали посредством фильтрации, промывали 3 раза с помощью охлажденного льдом метанола и высушивали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (5,22 г).

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ (ppm): 1,41-1,59 (m, 2H), 1,78-1,98 (m, 2H), 2,00-2,15 (m, 1H), 2,36-2,53 (m, 1H), 3,08 (s, 3H), 3,18-3,32 (m, 1H), 3,49 (dd, J=15,5, 1,7 Гц, 1H), 3,91-4,04 (m, 1H), 4,51 (d, J=15,4 Гц, 1H), 5,54 (br. s, 1H).

MS (ESI) масса/заряд: 183 [M+H]⁺

[0048] Пример получения 6

Синтез (5aR,8aR)-4-метилоктагидроциклопента[e][1,4]диазепин-2,5-диона

(1) Синтез трет-бутил-2-((1R,2R)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-N-метилциклопентанкарбоксамид)ацетата

DIPEA (1,81 мл, 10,5 ммоль) и HATU (1,99 г, 5,23 ммоль) последовательно добавляли при комнатной температуре к смеси (1R,2R)-трет-бутоксикарбонил-2-аминоциклопентанкарбоновой кислоты (CAS № 245115-25-7) (1,00 г, 4,36 ммоль), гидрохлорида сложного трет-бутилового эфира саркозина (CAS № 136088-69-2) (872 мг, 4,80 ммоль) и DCM (10 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа и затем непосредственно очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель, 30-50% этилацетат/н-гептан) с получением указанного в заголовке соединения (1,61 г).

MS (ESI) масса/заряд: 357 [M+H]⁺

(2) Синтез (5aR,8aR)-4-метилоктагидроциклопента[e][1,4]диазепин-2,5-диона

4 н. раствор смеси хлороводород/1,4-диоксан (16 мл, 64 ммоль) добавляли при комнатной температуре к трет-бутил-2-((1R,2R)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-N-метилциклопентанкарбоксамид)ацетату (1,61 г, 4,52 ммоль) и смесь перемешивали в течение 20 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Гидрокарбонат натрия (0,911 г, 10,8 ммоль), метанол (24 мл), NMM (0,099 мл, 0,90 ммоль) и DMT-MM (12,3% H₂O, 1,80 г, 5,70 ммоль) последовательно добавляли к остатку при комнатной температуре, и смесь перемешивали в течение 20 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток промывали с помощью DCM. Промытую жидкость концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель, 5-20% метанол/этилацетат) с получением указанного в заголовке соединения (745 мг).

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ (ppm): 1,56-1,88 (m, 3H), 1,91-2,02 (m, 1H), 2,13-2,23 (m, 1H), 2,26-2,39 (m, 1H), 3,07 (s, 3H), 3,08-3,16 (m, 1H), 3,51-3,62 (m, 1H), 3,79 (d, J=18,0 Гц, 1H), 4,58 (d, J=18,0 Гц, 1H), 6,76 (br. s, 1H).

MS (ESI) масса/заряд: 183 [M+H]⁺

[0049] Пример получения 7

Синтез (5aS,8aS)-4-метилоктагидроциклопента[e][1,4]диазепин-2,5-диона

(1) Синтез трет-бутил-2-((1S,2S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-N-метилциклопентанкарбоксамид)ацетата

HATU (1,99 г, 5,23 ммоль) добавляли при комнатной температуре к смеси (1S,2S)-трет-бутоксикарбонил-2-аминоциклопентанкарбоновой кислоты (CAS № 143679-80-5) (1,00 г, 4,36 ммоль), гидрохлорида сложного трет-бутилового эфира саркозина (872 мг, 4,80 ммоль), DIPEA (1,81 мл, 10,5 ммоль) и DCM (10 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и затем непосредственно очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель, 30-50% этилацетат/н-гептан) с получением указанного в заголовке соединения (1,55 г).

MS (ESI) масса/заряд: 357 [M+H]⁺

(2) Синтез (5aS,8aS)-4-метилоктагидроциклопента[e][1,4]диазепин-2,5-диона

4 н. раствор смеси хлороводород/1,4-диоксан (16 мл, 64 ммоль) добавляли при комнатной температуре к трет-бутил-2-((1S,2S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-N-метилциклопентанкарбоксамид)ацетату (1,55 г, 4,35 ммоль) и смесь перемешивали в течение 16 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Гидрокарбонат натрия (0,877 г, 10,4 ммоль), метанол (24 мл), NMM (0,096 мл, 0,87 ммоль) и DMT-MM (12,3% H₂O, 1,73 г, 5,48 ммоль) последовательно добавляли к остатку при комнатной температуре, и смесь перемешивали в течение 3 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток промывали с помощью DCM. Промытую жидкость концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель, 0-20% метанол/этилацетат) с получением указанного в заголовке соединения (753 мг).

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ (ppm): 1,55-1,88 (m, 3H), 1,91-2,02 (m, 1H), 2,11-2,22 (m, 1H), 2,25-2,40 (m, 1H), 3,07 (s, 3H), 3,07-3,16 (m, 1H), 3,51-3,62 (m, 1H), 3,78 (d, J=18,0 Гц, 1H), 4,57 (d, J=18,0 Гц, 1H), 6,54 (br. s, 1H).

MS (ESI) масса/заряд: 183 [M+H]⁺

[0050] Пример 1

Синтез 3-фтор-6,11-диметил-6,7,10,11,12,13-гексагидробензо[f]пиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a][1,4]диазепин-5,14-диона

Оксихлорид фосфора (4,65 мл, 49,9 ммоль) добавляли при комнатной температуре к смеси этил-2-амино-6-метил-4,5,6,7-тетрагидротиено[2,3-c]пиридин-3-карбоксилата (6,00 г, 25,0 ммоль), полученного в примере получения 1, 7-фтор-4-метил-3,4-дигидро-1H-бензо[e][1,4]диазепин-2,5-диона (5,20 г, 25,0 ммоль), полученного в примере получения 2, и DCE (300 мл). Реакционную смесь перемешивали при 80°C в течение 20 часов. При перемешивании при охлаждении льдом к реакционной смеси добавляли этоксид натрия (20% раствор в этаноле, 80 мл, 207 ммоль). Реакционную смесь помешивали при комнатной температуре в течение 20 минут. К реакционной смеси добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и этилацетат и отделяли органический слой. Водный слой экстрагировали с помощью этилацетата. Объединенный органический слой высушивали над сульфатом магния и фильтровали и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток последовательно очищали с помощью колоночной хроматографии (NH-силикагель, 50-100% этилацетат/н-гептан) и колоночной хроматографии (силикагель, 0-50% метанол/этилацетат). Полученное твердое вещество растирали с TBME и осадки собирали посредством фильтрации. Полученное твердое вещество промывали с помощью TBME и высушивали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (4,56 г).

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ (ppm): 2,51 (s, 3H), 2,66-2,76 (m, 1H), 2,77-2,88 (m, 1H), 3,04-3,18 (m, 2H), 3,25 (s, 3H), 3,57-3,75 (m, 2H), 4,09 (d, J=15,2 Гц, 1H), 4,47 (d, J=14,8 Гц, 1H), 7,25-7,31 (m, 1H), 7,60-7,64 (m, 1H), 7,67 (dd, J=9,0, 4,7 Гц, 1H).

MS (ESI) масса/заряд: 385 [M+H]⁺

[0051] Пример 2

Синтез 5,10-диметил-5,6,9,10,11,12-гексагидропиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a]тиено[2,3-f][1,4]диазепин-4,13-диона

Оксихлорид фосфора (0,157 мл, 1,68 ммоль) добавляли при комнатной температуре к смеси этил-2-амино-6-метил-4,5,6,7-тетрагидротиено[2,3-c]пиридин-3-карбоксилата (303 мг, 1,26 ммоль), полученного в примере получения 1, 4-метил-3,4-дигидро-1H-тиено[3,2-e][1,4]диазепин-2,5-диона (165 мг, 0,841 ммоль), полученного в примере получения 3, и 1,4-диоксана (10 мл). Реакционную смесь перемешивали при 70°C в течение 2 часов и затем перемешивали при 90°C в течение 5 часов. Этоксид натрия (20% раствор в этаноле, 2,60 мл, 6,73 ммоль) добавляли к реакционной смеси, охлажденной до комнатной температуры. Реакционную смесь помешивали при комнатной температуре в течение 40 минут. К реакционной смеси добавляли этилацетат и насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и отделяли органический слой. Водный слой экстрагировали с помощью этилацетата. Объединенный органический слой высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель, 50% метанол/этилацетат) с получением указанного в заголовке соединения (90,0 мг).

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ (ppm): 2,51 (s, 3H), 2,66-2,87 (m, 2H), 3,07-3,20 (m, 2H), 3,26 (s, 3H), 3,56-3,74 (m, 2H), 4,21 (d, J=15,0 Гц, 1H), 4,56 (d, J=15,0 Гц, 1H), 7,54 (d, J=5,3 Гц, 1H), 7,59 (d, J=5,3 Гц, 1H).

MS (ESI) масса/заряд: 373 [M+H]⁺[0052] Пример 3

Синтез 5,10-диметил-5,6,9,10,11,12-гексагидропиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a]тиено[3,2-f][1,4]диазепин-4,13-диона

Оксихлорид фосфора (1,43 мл, 15,3 ммоль) добавляли при комнатной температуре к смеси 4-метил-3,4-дигидро-1H-тиено[2,3-e][1,4]диазепин-2,5-диона (1,00 г, 5,10 ммоль), полученного в примере получения 4, этил-2-амино-6-метил-4,5,6,7-тетрагидротиено[2,3-c]пиридин-3-карбоксилата (1,84 г, 7,64 ммоль), полученного в примере получения 1, и 1,4-диоксана (30 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут и перемешивали при 90°C в течение 2 часов. Этоксид натрия (20% раствор в этаноле, 21,7 мл, 56,1 ммоль) добавляли в течение 5 минут к реакционной смеси, охлажденной до комнатной температуры. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часа. К реакционной смеси последовательно добавляли этилацетат, насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и воду и отделяли органический слой. Водный слой экстрагировали с помощью этилацетата. Объединенный органический слой высушивали над безводным сульфатом магния и фильтровали и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель, 20%-50% метанол/этилацетат). Полученное твердое вещество растирали с этанолом и осадки собирали посредством фильтрации. Полученное твердое вещество промывали с помощью этанола и высушивали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (712 мг).

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ (ppm): 2,52 (s, 3H), 2,71-2,87 (m, 2H), 3,05-3,30 (m, 5H), 3,59-3,75 (m, 2H), 4,23 (d, J=14,8 Гц, 1H), 4,57 (d, J=14,8 Гц, 1H), 7,35 (d, J=6,2 Гц, 1H), 7,39 (d, J=5,9 Гц, 1H).

MS (ESI) масса/заряд: 373 [M+H]⁺

[0053] Пример 4

Синтез (3aS,14aR)-5,10-диметил-3,3a,5,6,9,10,11,12-октагидро-1H-циклопента[f]пиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a][1,4]диазепин-4,13-(2H,14aH)диона

Оксихлорид фосфора (7,93 мл, 85,1 ммоль) добавляли при комнатной температуре к смеси (5aS,8aR)-4-метилоктагидроциклопента[e][1,4]диазепин-2,5-диона (3,10 г, 17,0 ммоль), полученного в примере получения 5-(2), этил-2-амино-6-метил-4,5,6,7-тетрагидротиено[2,3-c]пиридин-3-карбоксилата (8,18 г, 34,0 ммоль), полученного в примере получения 1, и DCE (300 мл). Реакционную смесь перемешивали при 80°C в течение 14,5 часа. Насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия добавляли к реакционной смеси при 0°C, смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3,5 часа и затем отделяли органический слой. Водный слой экстрагировали с помощью этилацетата. Объединенный органический слой промывали последовательно насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (NH-силикагель, 30-60% этилацетат/н-гептан). Полученный концентрированный остаток растирали с TBME и осадки собирали посредством фильтрации. Полученное твердое вещество промывали 3 раза с помощью TBME и высушивали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (3,70 г).

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ (ppm): 1,51-1,73 (m, 2H), 1,94-2,18 (m, 2H), 2,30-2,41 (m, 1H), 2,44-2,59 (m, 4H), 2,71-2,82 (m, 2H), 3,04-3,19 (m, 5H), 3,42-3,54 (m, 1H), 3,64 (s, 2H), 4,17 (d, J=15,6 Гц, 1H), 4,75 (d, J=15,6 Гц, 1H), 5,69-5,82 (m, 1H).

MS (ESI) масса/заряд: 359 [M+H]⁺Удельное вращение: [α] _D²⁰ -146,0 (c 0,50, CHCl₃)

Анализ с помощью HPLC

(Условия анализа) Колонка: CHIRALPAK IB (изготовленная Daicel Chemical Industries, Ltd.) (0,46 см, φ x 15 см), 40°C, элюент: этанол/гексан=20/80 (об./об.), расход: 1 мл/мин., обнаружение: УФ (254 нм).

(Анализ результатов) Когда указанное в заголовке соединение анализировали в вышеуказанных условиях анализа, время удерживания составляло 10,38 минуты, оптическая чистота составляла >98%ee и вращение плоскости поляризации являлось (-). Время удерживания энантиомера подтверждали с помощью продукта, синтезированного подобным образом, с применением рацемической смеси в качестве исходного материала.

[0054] Пример 5

Синтез (3aR,14aR)-5,10-диметил-3,3a,5,6,9,10,11,12-октагидро-1H-циклопента[f]пиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a][1,4]диазепин-4,13-(2H,14aH)диона

Оксихлорид фосфора (0,793 мл, 8,51 ммоль) добавляли при комнатной температуре к смеси (5aR,8aR)-4-метилоктагидроциклопента[e][1,4]диазепин-2,5-диона (310 мг, 1,70 ммоль), полученного в примере получения 6-(2), этил-2-амино-6-метил-4,5,6,7-тетрагидротиено[2,3-c]пиридин-3-карбоксилата (613 мг, 2,55 ммоль), полученного в примере получения 1, и DCE (16 мл). Реакционную смесь перемешивали при 70°C в течение 2,5 часа и затем обеспечивали ее остывание до комнатной температуры и добавляли этилацетат (15 мл) и насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия (30 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 дней, добавляли этилацетат и отделяли органический слой. Водный слой экстрагировали с помощью этилацетата. Объединенный органический слой высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (NH-силикагель, 50-70% этилацетат/н-гептан). Полученный продукт промывали 3 раза с помощью диэтилового эфира, затем промывали с помощью TBME и высушивали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (143 мг).

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ (ppm): 1,29-1,49 (m, 1H), 1,68-1,83 (m, 1H), 1,82-2,21 (m, 3H), 2,50 (s, 3H), 2,76 (t, J=5,7 Гц, 2H), 2,98-3,23 (m, 6H), 3,40-3,54 (m, 1H), 3,57-3,68 (m, 2H), 4,17-4,34 (m, 2H), 5,30 (d, J=17,4 Гц, 1H).

MS (ESI) масса/заряд: 359 [M+H]⁺

Анализ с помощью HPLC

(Условия анализа) Колонка: CHIRALPAK IC (изготовленная Daicel Chemical Industries, Ltd.) (0,46 см, φ x 15 см), 40°C, элюент: этанол, расход: 1 мл/мин., обнаружение: УФ (254 нм)

(Анализ результатов) Время удерживания указанного в заголовке соединения составляло 6,64 минуты, оптическая чистота составляла >99%ee, и вращение плоскости поляризации являлось (-).

[0055] Пример 6

Синтез (3aS,14aS)-5,10-диметил-3,3a,5,6,9,10,11,12-октагидро-1H-циклопента[f]пиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a][1,4]диазепин-4,13-(2H,14aH)диона

Оксихлорид фосфора (0,859 мл, 9,22 ммоль) добавляли при комнатной температуре к смеси (5aS,8aS)-4-метилоктагидроциклопента[e][1,4]диазепин-2,5-диона (336 мг, 1,84 ммоль), полученного в примере получения 7-(2), этил-2-амино-6-метил-4,5,6,7-тетрагидротиено[2,3-c]пиридин-3-карбоксилата (665 мг, 2,77 ммоль), полученного в примере получения 1, и DCE (17 мл). Реакционную смесь перемешивали при 60°C в течение 3,5 часа и затем обеспечивали ее остывание до комнатной температуры. К реакционной смеси добавляли этилацетат (15 мл) и насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия (30 мл). После того, как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 дней, добавляли этилацетат и отделяли органический слой. Водный слой экстрагировали с помощью этилацетата. Объединенный органический слой высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (NH-силикагель, 40-80% этилацетат/н-гептан). Полученный продукт промывали 3 раза с помощью диэтилового эфира и высушивали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (166 мг).

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ (ppm): 1,31-1,50 (m, 1H), 1,69-1,83 (m, 1H), 1,84-1,97 (m, 1H), 1,97-2,20 (m, 2H), 2,50 (s, 3H), 2,73-2,80 (m, 2H), 3,02-3,23 (m, 6H), 3,41-3,55 (m, 1H), 3,57-3,69 (m, 2H), 4,19-4,34 (m, 2H), 5,30 (d, J=17,2 Гц, 1H).

MS (ESI) масса/заряд: 359 [M+H]⁺

(Анализ результатов) Время удерживания указанного в заголовке соединения составляло 8,34 минуты, оптическая чистота составляла >99%ee, и вращение плоскости поляризации являлось (+).

[0056] Примеры фармакологических тестов

Следующие фармакологические тесты проводили с применением соединений из примеров 1-6.

[0057] Измерение высвобождения ацетилхолина (ACh) в системе первичной культуры нейронов перегородки крыс в присутствии NGF

(1) Первичная культура нейронов перегородки крыс

Выделяли область перегородки у крыс Спрег-Доули (SD) (Charles River Laboratories Japan, Inc.) в гестационном возрасте 18 дней и культивировали. В частности, плоды в стерильных условиях удаляли у беременных крыс под анестезией изофлураном. Головной мозг извлекали из каждого плода и погружали в охлажденную льдом среду L-15 (11415-064, Thermo Fisher Scientific). Область перегородки иссекали из извлеченного головного мозга под стереоскопическим микроскопом. Иссеченную область перегородки подвергали ферментативной обработке в ферментном растворе, содержащем 0,25% трипсина (15050-065, Thermo Fisher Scientific) и 0,01% ДНКазы (D5025-150KU, Sigma), при 37°C в течение 30 минут, тем самым обеспечивая диспергирование клеток. В данном случае ферментативную реакцию останавливали с помощью добавления инактивированной лошадиной сыворотки (26050-088, Thermo Fisher Scientific). Обработанный ферментами раствор центрифугировали при 1000 об./мин. в течение 3 минут и надосадочную жидкость удаляли. К полученной клеточной массе добавляли среду в количестве 10 мл. Применяемой средой являлась среда Игла в модификации Дульбекко (044-29765, WAKO), дополненная с помощью добавки N2 (17502-048, Thermo Fisher Scientific), 1 мМ пирувата натрия (11360-070, Thermo Fisher Scientific) и пенициллина-стрептомицина (15140-1221, Thermo Fisher Scientific). Клетки в клеточной массе, в которую добавляли среду, повторно диспергировали путем аккуратного пипетирования, а затем снова центрифугировали при 1000 об./мин. в течение 3 минут и надосадочную жидкость удаляли. Среду в количестве 10 мл добавляли к полученной клеточной массе и дисперсию клеток фильтровали через 40 мкм нейлоновую сетку (Cell Strainer) с удалением клеточной массы с получением тем самым суспензии нейронных клеток. Суспензию нейронных клеток разбавляли с помощью среды и 10% инактивированной бычьей сыворотки (26140-079, Thermo Fisher Scientific) и добавляли 10% инактивированной лошадиной сыворотки. После этого высевали 100 мкл/лунка суспензии в 96-луночный планшет (354461, CORNING), предварительно покрытый поли-D-лизином, так что начальная плотность культуры составляла 1,4×10⁵ клетки/см². После того, как высеянные клетки культивировали при 5% CO₂-95% воздуха в инкубаторе с температурой 37°C в течение 2 дней, всю среду заменяли 120 мкл свежей среды и затем клетки культивировали в течение 5 дней.

(2) Добавление соединения

На 7-й день культивирования соединение добавляли следующим образом. Раствор тестируемого соединения в DMSO разбавляли с помощью среды так, чтобы концентрация была в 10 раз выше, чем конечная концентрация. NGF (450-01, PEPRO TECH, INC.) получали при 0,3 нг/мл. Каждый из этих двух растворов добавляли в количестве 15 мкл/лунка и смесь хорошо смешивали. Конечная концентрация DMSO составляла 0,1% или меньше. Более того, только DMSO и NGF добавляли к контрольной группе.

(3) Измерение высвобождения ACh

Через день после добавления соединения количество высвобождаемого ACh измеряли с помощью HPLC следующим образом. Нагретый буфер добавляли при 100 мкл/лунка в лунку после того, как среду убирали, и буфер немедленно удаляли. После этого добавляли буфер, в который добавляли 10 мкм холина, 10 мкм физостигмина и 6 мМ KCl, при 120 мкл/лунка. Буфер получали путем добавления 125 мМ NaCl, 25 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты, 1,2 мМ KH₂PO₄, 1,2 мМ MgSO₄, 2,2 мМ CaCl₂ (2H₂O) и 10 мМ глюкозы к стерилизованной воде и конечное значение pH раствора регулировали до 7,4. После того, как 96-луночный планшет, в который добавляли буфер, инкубировали при 5% CO₂-95% воздуха в инкубаторе с температурой 37°C в течение 40 минут, собирали 80 мкл буфера. Раствор внутреннего стандарта IPHC (5×10^-7 М) добавляли в количестве 6 мкл к собранному буферу и буфер переносили в пробирку для измерения с помощью HPLC и подвергали измерению с помощью HPLC. Результаты отображают эффект каждого соединения в виде процента (% контроля) концентрации ACh в буфере контрольной группы, и значения концентрации соединения, демонстрирующие увеличение на 20% по сравнению с концентрацией ACh в буфере контрольной группы, показаны в следующей таблице 1.

[0058] [Таблица 1]

Пример	Концентрация (мкМ), демонстрирующая увеличение на 20% или больше по сравнению с количеством ACh в контрольной группе
1	0,1
2	0,1
3	0,1
4	0,1
5	0,1
6	0,03

[0059] Измерение уровней экспрессии mRNA холинацетилтрансферазы (ChAT) в области перегородки крыс

(1) Введение соединения

В данном исследовании применяли самцов крыс SD (Charles River Laboratories Japan, Inc.) с весом тела от приблизительно 250 до 350 г. Соединение растворяли в 0,01 моль/л хлористоводородной кислоты и вводили перорально.

(2) Отбор образцов

Через 24 часа после введения соединения всю ткань головного мозга собирали под анестезией пентобарбиталом. Выделяли медиальную перегородку из всего головного мозга на льду и замораживали с помощью жидкого азота и затем хранили при -80°C.

(3) Измерение уровней экспрессии mRNA ChAT

Для очищения РНК в данном исследовании применяли набор RNeasy Plus Mini (№ 74136: QIAGEN). Очищение РНК проводили с помощью способа, описанного в наборе. После очищения РНК измеряли общую концентрацию РНК с применением прибора QIAxpert (QIAGEN). Синтезировали cDNA с применением набора для синтеза cDNA SuperScript (R) VILO (TM) (№ 11754: Thermo Fisher Scientific). Синтез cDNA проводили с помощью способа, описанного в наборе. Синтезированную cDNA разбавляли в 4 раза с помощью воды, не содержащей РНКазы, и разбавленный раствор cDNA применяли в качестве образца. Универсальный мастер-микс для ПЦР Taqman (№4304437: Thermo Fisher Scientific), наборы для анализа экспрессии генов Taqman (R), INVENTORIED (№4331182: Thermo Fisher Scientific), воду, не содержащую РНКазы, и раствор cDNA смешивали в количестве 10 мкл, 1 мкл, 4 мкл и 5 мкл соответственно и полученную смесь применяли в качестве измеряемого образца раствора. Количественную полимеразную цепную реакцию (qPCR) проводили с применением ABI PRISM (R) 7900HT (Thermo Fisher Scientific) с помощью способа с применением флуоресцентных зондов. Анализ проводили с помощью SDS 2.4 (Thermo Fisher Scientific). Результаты рассчитывали в виде процентного значения величины уровней экспрессии mRNA ChAT в группе с введением соединения, увеличенной по сравнению с величиной уровней экспрессии mRNA ChAT в группе с введением среды-носителя. Результаты показаны в следующей таблице 2.

[0060] [Таблица 2]

Пример	Доза	Величина (%), на которую увеличена величина уровней экспрессии mRNA ChAT по сравнению с группой с введением среды-носителя
1	10 мг/кг	73,3
2	3 мг/кг	38,0
3	10 мг/кг	56,4
4	10 мг/кг	42,4
5	3 мг/кг	33,6
6	10 мг/кг	32,0

[0061] Измерение концентрации ацетилхолина (ACh) в спинномозговой жидкости (CSF) крыс

(1) Предпосылки

Корреляция между увеличением и уменьшением количества нейротрансмиттеров в головном мозге и нейротрансмиттеров в спинномозговой жидкости (CSF) была выявлена в исследованиях на грызунах, и также корреляция наблюдалась у человека (Lowe S et al. Psychopharmacology 219 (2012) 959-970). Соответственно, измеряли изменения концентрации ацетилхолина в CSF, чтобы определить изменения концентрации ацетилхолина в головном мозге с помощью тестируемых соединений.

(2) Введение соединения

В данном исследовании применяли самцов крыс Fischer 344 (Charles River Laboratories Japan, Inc.) с весом тела от приблизительно 150 до 250 г. Тестируемые соединения вводили перорально крысам один раз в сутки при 10 мг/кг в течение трех дней. Применяемая среда-носитель представляла собой 0,01 моль/л раствор хлористоводородной кислоты.

(3) Отбор образцов

Через 24 часа после введения среды-носителя и тестируемых соединений собирали CSF из мозжечково-мозговой цистерны в пробирку, содержащую ингибиторы AchE, под анестезией пентобарбиталом. Собранную CSF центрифугировали при 3500 x g при 4°C в течение 10 минут и собирали надосадочную жидкость. Собранную надосадочную жидкость замораживали с помощью жидкого азота и затем хранили при -80°C.

(4) Измерение концентрации Ach с помощью LC-MS

В 10 мкл CSF добавляли 50 мкл ацетилхолин-d9-хлорида (ACh-d9) при конечной концентрации 0,34 нмоль/л в качестве внутреннего стандарта. Смесь пипетировали и центрифугировали при 1500 x g при 4°C в течение 10 минут. Надосадочную жидкость собирали и подвергали LC/MS (NexeraX2 (MS), TSQ Altis (HPLC)) и выявляли Ach как соответствующий пику иона-предшественника при значении масса/заряд, равном 146,050, и пику иона-продукта при значении масса/заряд, равном 87,071, и определяли концентрацию ACh-d9 в качестве внутреннего стандарта пику иона-предшественника при значении масса/заряд, равном 155,088, и пику иона-продукта при значении масса/заряд, равном 87,000. Результаты представлены в виде расчетов процентного значения увеличения концентрации ACh в CSF в группе с введением тестируемого соединения по отношению к таковой в группе с введением среды-носителя (% контроля). Результаты представлены в таблице 3.

[0062] [Таблица 3]

Пример	Количество (%), на которое увеличено количество ACh в CSF относительно группы с введением среды-носителя
1	160,0
3	156,8

[0063] Оценка в трансгенной мыши с мутацией P301S, экспрессирующей тау-белок человека

(1) Введение соединения

В данном исследовании тестируемые соединения один раз в сутки в течение трех месяцев вводили перорально трансгенным мышам с мутацией P301S, экспрессирующим тау-белок человека, возрастом от четырех месяцев до семи месяцев. Применяемая среда-носитель представляла собой 0,01 моль/л раствор хлористоводородной кислоты.

(2) Отбор образцов

В первый день введения (в возрасте четырех месяцев) и на следующий день после последнего введения мышей из группы с введением среды-носителя и группы с введением тестируемого соединения подвергали анестезии пентобарбиталом (50 мг/кг, i. p.) и перфузировали с помощью PBS. После перфузии передний мозг, в том числе медиальную область перегородки, собирали и фиксировали с помощью 4% раствора параформальдегида.

(3) Получение коронарного среза замороженного головного мозга

Собранный передний мозг, в том числе медиальную область перегородки, погружали в 4% раствор параформальдегида и встряхивали в течение ночи. Раствор для погружения заменяли 7,5% раствором сахарозы. Полученное погружали в 7,5% раствор сахарозы и встряхивали в течение ночи, и раствор для погружения заменяли 15% раствором сахарозы, и полученное погружали в него и встряхивали в течение ночи. Раствор для погружения заменяли 30% раствором сахарозы и полученное погружали в него и встряхивали в течение ночи. Коронарные срезы замороженного головного мозга с толщиной 30 мкм получали из переднего мозга, в том числе медиальной области перегородки, с применением микротома (Leica, SM2000R).

(4) Иммуногистохимическое исследование клеток, положительных в отношении холинацетилтрансферазы (ChAT)

Полученные коронарные срезы замороженного головного мозга окрашивали с помощью DAB (НАБОРА С DAB-СУБСТРАТОМ ПЕРОКСИДАЗЫ (Vector, SK-4100)) с применением антитела к ChAT (Santa Cruz, SC-20672) в качестве первичного антитела. Изображение среза, в том числе медиальной области перегородки, как показано в "The mouse Brain in stereotaxic coordinates" (COMPACT THIRD EDITION, Keith B.J. Franklin & George Paxinos), получали с помощью универсального флуоресцентного микроскопа (KEYENCE, BZ-X710) и ChAT-положительные клетки вблизи основной оси медиальной области перегородки подсчитывали с помощью программного обеспечения для анализа BZ (KEYENCE). Результаты представлены в виде процента количества ChAT-положительных клеток в группе с введением среды-носителя и группе с введением тестируемого соединения относительно числа ChAT-положительных клеток на момент первоначального введения (в возрасте четырех месяцев). Данные выражены в виде среднего значения ±SEM. Различия между группой на момент первоначального введения и группой, обработанной средой-носителем (значительные: *), анализировали с помощью непарного t-критерия, а также различия между группой, обработанной средой-носителем, и группой, обработанной соединением (значительные: ^#), анализировали с помощью непарного t-критерия. Значение P<0,05 считали статистически значимым. Статистические анализы проводили с применением GraphPad Prism версии 7.02. Результаты представлены в таблице 4.

[0064] [Таблица 4]

Группа, которую подвергали обработке	Соотношение (%) числа ChAT-положительных клеток по сравнению с таковым при первоначальном введении
Группа на момент первоначального введения	100,0±4,5
Группа с введением среды-носителя	83,0±5,8^*
Группа с введением примера 1 (доза: 10 мг/кг)	105,0±4,0^#
Группа с введением примера 3 (доза: 5 мг/кг)	105,3±4,3^#

[0065] Нейропротекторный и восстановительный эффект в отношении холинергических нейронов с применением крысиной модели поражения бахромок гиппокампа и свода головного мозга

(1) Получение крысиной модели поражения бахромок гиппокампа и свода головного мозга

В данном исследовании применяли самцов крыс Спрег-Доули (Charles River Laboratories Japan, Inc.) с весом тела от приблизительно 250 до 350 г. Крысу подвергали анестезии с помощью комбинации трех лекарственных средств: мидазолама (2 мг/кг s.c.), медетомидина гидрохлорида (0,15 мг/кг s.c.) и буторфанола тартрата (2,5 мг/кг s.c.), и фиксировали с помощью стереотаксического аппарата для работы с головным мозгом (Narishige Co., Ltd.). Обнажали череп и просверливали отверстие шириной 5 мм в черепе от срединной линии на 2 мм позади брегмы. Лезвие шириной 4 мм вводили в брегму на глубину 5,5 мм с разрезанием бахромок гиппокампа и свода головного мозга. После остановки кровотечения скальп зашивали. После операции крысу возвращали обратно в клетку и обеспечивали восстановление после анестезии. В группе с имитацией операции просверливали отверстие шириной 5 мм в черепе от срединной линии на 2 мм позади брегмы, но без введения лезвия.

(2) Введение соединения

Тестируемые соединения вводили перорально крысам один раз в сутки от пяти дней до девяти дней после операции (пример 1: 10 мг/кг) или от семи дней до четырнадцати дней после операции (пример 3: 3 мг/кг). Применяемая среда-носитель представляла собой 0,01 моль/л раствор хлористоводородной кислоты. В группе с имитацией операции среду-носитель вводили перорально один раз в сутки аналогично группе с введением тестируемого соединения.

(3) Отбор образцов

Крыс подвергали анестезии с помощью пентобарбитала и транскардиально перфузировали с помощью ледяного PBS. После перфузии передний мозг, в том числе медиальную область перегородки, собирали и погружали в 4% раствор параформальдегида, и встряхивали в течение ночи. Раствор для погружения заменяли 7,5% раствором сахарозы. Полученное погружали в 7,5% раствор сахарозы и встряхивали в течение ночи, и раствор для погружения заменяли 15% раствором сахарозы, и полученное погружали в него и встряхивали в течение ночи. Раствор для погружения заменяли 30% раствором сахарозы и полученное погружали в него и встряхивали в течение ночи. Коронарные срезы замороженного головного мозга с толщиной 30 мкм получали из переднего мозга, в том числе медиальной области перегородки, с применением микротома (Leica, SM2000R).

(4) Иммуногистохимическое исследование клеток, положительных в отношении холинацетилтрансферазы (ChAT), и везикулярного транспортера ацетилхолина (VAChT)

Полученные коронарные срезы замороженного головного мозга окрашивали с помощью DAB (НАБОРА С DAB-СУБСТРАТОМ ПЕРОКСИДАЗЫ (Vector, SK-4100)) с применением антитела к ChAT (Santa Cruz, SC-20672) или антитела к VAChT (Merck Millipore, ABN100) в качестве первичного антитела. Изображение среза, в том числе медиальной области перегородки или гиппокампа, как показано в "The mouse Brain in stereotaxic coordinates" (COMPACT THIRD EDITION, Keith B.J. Franklin & George Paxinos), получали с помощью универсального флуоресцентного микроскопа (KEYENCE, BZ-X710) и количество ChAT-положительных клеток медиальной области перегородки или оптическую плотность (OD) гиппокампального VAChT измеряли с помощью программного обеспечения для анализа BZ (KEYENCE). Результаты представлены в виде процента количества ChAT-положительных клеток медиальной области перегородки или OD гиппокампального VAChT в группе с введением среды-носителя и группе с введением тестируемого соединения относительно числа ChAT-положительных клеток медиальной области перегородки или OD гиппокампального VAChT в группе с имитацией операции. Данные выражены в виде среднего значения ±SEM. Различия между группой, обработанной средой-носителем, и группой, обработанной соединением (значительные: ^#), анализировали с помощью непарного t-критерия. Значение P<0,05 считали статистически значимым. Статистические анализы проводили с применением GraphPad Prism версии 7.02. Результаты представлены в таблицах 5 и 6.

[0066] [Таблица 5]

Пример	Число ChAT-положительных клеток (%) при первоначальном введении	Число ChAT-положительных клеток (%) в группе с введением среды-носителя	Число ChAT-положительных клеток (%) в группе с введением тестируемого соединения
1	59,9±6,0	43,3±12,3	79,1±15,7
3	57,0±7,5	38,4±5,0	74,1±9,3^#

[0067] [Таблица 6]

Пример	OD гиппокампального VAChT (%) при первоначальном введении	OD гиппокампального VAChT (%) в группе с введением среды-носителя	OD гиппокампального VAChT (%) в группе с введением тестируемого соединения
1	35,4±4,4	22,8±9,5	77,2±14,6^#
3	51,7±13,1	19,5±6,4	66,1±14,2^#

1. Соединение, выбранное из группы, состоящей из

3-фтор-6,11-диметил-6,7,10,11,12,13-гексагидробензо[f]пиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a][1,4]диазепин-5,14-диона:

5,10-диметил-5,6,9,10,11,12-гексагидропиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a]тиено[2,3-f][1,4]диазепин-4,13-диона:

5,10-диметил-5,6,9,10,11,12-гексагидропиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a]тиено[3,2-f][1,4]диазепин-4,13-диона:

или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение, представляющее собой 3-Фтор-6,11-диметил-6,7,10,11,12,13-гексагидробензо[f]пиридо[4'',3'':4',5']тиено[2',3':4,5]пиримидо[1,2-a][1,4]диазепин-5,14-дион: