Штамм клеток escherichia coli bl21(de3)/pet32v11-cre, продуцирующих сайт-специфическую рекомбиназу cre

Изобретение относится к области генной инженерии и молекулярной биологии, в частности к рекомбинантной плазмиде pET32v11-Cre, обеспечивающей синтез рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre. Изобретение также раскрывает штамм клеток Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre и способ получения указанного белка 6His-S-NLS-Cre с помощью указанного штамма. Плазмида согласно изобретению обеспечивает синтез указанного рекомбинантного белка в клетках Escherichia coli за счет расположения гена рекомбиназы Cre в 3’-области относительно T7 промотора и lac оператора и в 5’-области относительно T7 терминатора и получена путем клонирования кДНК рекомбиназы Cre в вектор pET32v11, таким образом, чтобы кДНК рекомбиназы Cre с N-концевой NLS находилась в одной рамке считывания с 6-гистидиновым и S-эпитопами и аминокислотными последовательностями сайтов расщепления тромбина, энтерокиназы и протеазы TEV. Может быть использовано для продукции рекомбинантной сайт-специфической рекомбиназы Cre. Настоящее изобретение позволяет получить каталитически активную рекомбиназу Cre с высоким выходом. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 пр.

 

Область техники настоящего изобретения

Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной биологии и представляет собой способ получения штамма генномодифицированного организма, продуцирующего каталитически активную рекомбиназу Cre.

Изобретение создано при финансовой поддержке Министерства Науки и Высшего образования Российской Федерации в рамках Соглашения №075-15-2019-1661 от 31.10.2019.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Система сайт-специфической рекомбинации Cre-LoxP из бактериофага P1, инфицирующего клетки E.coli, получила широкое распространение для геномной инженерии и генетического анализа модельных организмов, позволяя исследовать функции отдельных генов или регуляторных элементов в контексте организма (Branda and Dymecki, 2004; McLellan et al., 2017; Sauer, 1998). Система Cre-LoxP состоит из тирозиновой рекомбиназы Cre и сайтов рекомбинации длиной 34 п.н., называемых LoxP (Sternberg and Hamilton, 1981). Сайт LoxP дикого типа, ATAACTTCGTATAatgtatgcTATACGAAGTTAT, имеет сходную архитектуру с сайтом FRT и состоит из двух инвертированных повторов длиной 13 п.н. (показаны заглавным шрифтом), разделенных ассиметричным спейсером длиной 8 п.н. (показан строчным шрифтом). Нуклеотидная последовательность спейсера определяет ориентацию сайта LoxP в геноме или генетических конструкциях. В природе функция системы Cre-LoxP заключается в циркуляризации генома фага P1 в плазмиду, разделении физически сцепленных кольцевых плазмид и поддержании копийности таких плазмид в клетках E.coli (Austin et al., 1981; et al., 2004). В модельных системах, в зависимости от взаимной ориентации LoxP сайтов в геноме, в результате действия Cre может происходит вырезание, интеграция, инверсия или транслокация фрагментов ДНК.

Для манипуляций с геном клеток млекопитающих in vivo систему Cre-LoxP впервые использовали на модели клеток в культуре (Sauer and Henderson, 1988), и впоследствии на модели трансгенных мышей (Lakso et al., 1992; Orban et al., 1992). К 2017 году было опубликовано более 3000 работ с использованием системы Cre-LoxP (McLellan et al., 2017). Система Cre-LoxP часто используется для создания мышиных моделей кондиционного нокаута генов. В этом случае получают линию трансгенных мышей у которых один или несколько критически важных экзонов гена фланкированы сайтам LoxP (так называемые «floxed» линии мышей). Для индукции нокаута гена такую линию животных скрещивают с «драйверными» линиями трансгенных животных, которые экспрессируют рекомбиназу Cre под контролем убиквитарных, тканеспецифичных или индуцибельных промоторов. В результате действия Cre удаляется фланкированный LoxP сайтами фрагмент генома, что приводит к инактивации целевого гена (McLellan et al., 2017).

К настоящему времени получены и охарактеризованы более двух тысяч «драйверных» линий трансгенных мышей и множество «floxed» линий животных (McLellan et al., 2017). Кроме того, получены репортерные линии мышей, позволяющие оценить эффективность действия Cre по мониторингу экспрессии репортерных генов, таких как β-галактозидаза или Egfp. Многие из этих линий животных доступны для исследователей и депонированы в питомники, например, лабораторию Jackson, а информация о таких линиях мышей может быть найдена на веб-сайте https://mice.jax.org. Таким образом, вот уже почти 30 лет с момента первого применения на модели трансгенных мышей в 1992 году система Cre-LoxP остается крайне востребованной и актуальной для генетического анализа модельных животных, и прежде всего домовой мыши.

Система Cre-LoxP также используется в методе геномной инженерии RMCE (Recombinase Mediated Cassette Exchange, опосредованный-рекомбиназой обмен кассет), который изначально был разработан на основе системы сайт-специфической рекомбинации Flp-FRT (Schlake and Bode, 1994). Практическая возможность использования Cre-LoxP при RMCE основана на идентификации сайтов LoxP с мутированными спейсерными последовательностями, которые могут рекомбинировать только между собой, но не с сайтами LoxP c другими спейсерными последовательностями (Siegel et al., 2001). Как и в случае системы Flp-FRT, использование двух LoxP сайтов с различающимися спейсерами позволяет строго сохранять ориентацию фрагмента ДНК после рекомбинации, и тем самым осуществлять точную замену последовательности ДНК в геноме, фланкированной двумя сайтами LoxP с различными спейсерами, на внесенную в клетку последовательность ДНК, фланкированную такими же сайтами LoxP (Turan et al., 2011; Turan et al., 2013).

Кроме того, на основе системы Cre-LoxP была разработана технология, названная FLEX, применение которой базируется на инверсии фрагментов ДНК. В системе FLEX два репортерных гена фланкированы парами сайтов LoxP с различающимися спейсерами и ориентированы так, что один ген находится под контролем промотора и экспрессируется, а второй ген расположен в обратной ориентации ( et al.). В результате инверсии с использованием одной пары сайтов LoxP прекращается экспрессия первого гена и активируется экспрессия второго гена, после чего с использованием второй пары сайтов LoxP удаляется небольшой фрагмент экспрессионной кассеты. Такая система позволяет осуществлять эффективный мониторинг активности Cre на уровне единичных клеток ( et al.). Технология FLEX находит применение для анализа трансгенных животных. Например, получена линия мышей, несущая в локусе ROSA26 кассету FLEX с Egfp и субъединицей А дифтерийного токсина, которая позволяет за счет Cre-опосредованной рекомбинации активировать экспрессию токсина и тем самым элиминировать определенные популяции клеток в организме мыши (Plummer et al., 2017). Технология Cre-опосредованной рекомбинации с использованием стохастических комбинаций инверсии и удаления фрагментов ДНК была элегантным образом реализована в системе Brainbow для мечения нейронов головного мозга с помощью комбинаций флуоресцентных белков (Cai et al., 2013; Livet et al., 2007).

Появление технологии геномного редактирования с помощью системы CRISPR/Cas9 позволило существенно упростить и ускорить процесс получения трансгенных животных (Low et al., 2016; Singh et al., 2015), что позволяет эффективно получать как новые «драйверные» линии мышей с заданной тканеспецифичностью экспрессии рекомбиназы Cre, так и продуцировать линии животных, несущие в геноме сайты LoxP, для создания кондиционного нокаута гена или проведения RMCE. Это определяет важность пересмотра и оптимизации методов генетического анализа с использованием сайт-специфической рекомбинации. В настоящий момент, все более широкое применение находят технологии редактирования генома без использования ДНК (DNA free genome editing), что, прежде всего, подразумевает доставку в клетки систем редактирования генома в виде рибонуклеопротеинового комплекса белка Cas9 и гидовой РНК (РНП), а не в виде экспрессионных плазмид. Использование РНП более эффективно, снижает риск модификации нецелевых локусов генома и элиминирует возможность случайной интеграции плазмидной ДНК, кодирующей Cas9 и гидовые РНК, в нецелевой сайт генома (Metje-Sprink et al., 2019). Все эти преимущества присущи и использованию сайт-специфических рекомбиназ в виде белков. В частности, первое сообщение о применение рекомбинантного белка Cre для индукции сайт-специфической рекомбинации датируется 1993 годом (Baubonis and Sauer, 1993). Альтернативные способы доставки Cre в клетки млекопитающих подразумевают использование плазмид или мРНК, однако плазмидная ДНК может интегрировать в случайное место генома, что требует дополнительной проверки клеточной линии или модельного организма на предмет интеграции плазмиды. Использование мРНК сайт-специфических рекомбиназ достаточно эффективно (de Wit et al., 1998; Ponsaerts et al., 2004), однако при внесении мРНК требуется время для транскрипции и трансляции белка, что снижает эффективность рекомбинации и, в случае микроинъекций мРНК в зиготы, может способствовать формированию мозаицизма. Кроме того, для экспрессии Cre в соматических клетках организма можно использовать аденовирусы (Akagi et al., 1997). Однако, введение вируса экспериментальным животным может вызвать иммунный ответ, что неприемлемо при исследовании функции генов иммунной системы.

Кроме того, стандартная схема получения животных с кондиционным нокаутом подразумевает скрещивание линии животных, экспрессирующих рекомбиназу Cre, с линией животных, несущих фланкированный LoxP сайтами локус генома (McLellan et al., 2017). Это имеет ряд недостатков. Во-первых, многие линии животных, экспрессирующие Cre, были получены с помощью рандомного трансгенеза, и далеко не все такие линии были охарактеризованы на предмет идентификации сайтов интеграции трансгена и его копийности. Следовательно, в таком случае геном двойных трансгенов с кондиционным нокаутом целевого гена будет нести в одной из хромосом рандомно интегрированные фрагменты ДНК с экспрессионной кассетой для Cre, что может нарушать функции каких-либо генов или некодирующих РНК в месте интеграции трансгена. Помимо этого, имеется достаточно много свидетельств токсичности экспрессии Cre для клеток (McLellan et al., 2017). При получении двойных трансгенных животных в организме таких животных будет экспрессироваться Cre, конститутивно или определенных тканях и органах, что может вызвать токсический эффект, влияя на пролиферацию клеток или внутриклеточные сигнальные пути или за счет неспецифической модификации генома в местах криптических LoxP сайтов.

Таким образом, использование системы сайт-специфической рекомбинации Cre-LoxP является одним из важных экспериментальных подходов функциональной геномики как у млекопитающих, так и других модельных организмов, таких как Drosophila melanogaster (Gurumurthy et al., 2019; McLellan et al., 2017; Sauer, 1998). Учитывая широкое распространение систем сайт-специфической рекомбинации, в том числе Cre-LoxP, для манипуляций с геномами модельных организмов или клеточных линий, актуальным представляется разработка и применение подходов, основанных на использовании рекомбинантного белка Cre. Это позволит повысить эффективность геномной инженерии, расширить арсенал используемых методов, элиминировать риск нецелевой интеграции генетических конструкций для экспрессии Cre в геном клетки-реципиента и минимизировать Cre-ассоциированную токсичность.

Очистка белка Cre

Бактериальные системы экспрессии рекомбинантных белков являются наиболее доступными и эффективными. В природе рекомбиназа Cre кодируется геномом бактериофага P1, инфицирующего клетки E.coli. Это свойство позволяет эффективно продуцировать рекомбинантный белок Cre в клетках E.coli в каталитически активной форме без необходимости в оптимизации кодонного состава (Van Duyne, 2015).

Основные подходы к очистке рекомбинантного белка Cre из бактериальных систем экспрессии можно разделить на методы очистки Cre в нативном виде; методы аффинной очистки Cre, несущей соответствующие эпитопы; методы, комбинирующие аффинную очистку и хроматографические методы очистки нативного белка.

После открытия системы Cre-LoxP был разработан эффективный протокол очистки нативного рекомбинантного белка Cre из бактериальной системы экспрессии (Abremski and Hoess, 1984). В частности, Cre очищали с помощью хроматографии на фосфоцеллюлозной колонке (часто применявшуюся для очистки ДНК-модифицирующих ферментов (Lu and Erickson, 1997)) и гель-фильтрации на носителе Sephadex G-75, что позволяло получить белок с чистотой 98% (Abremski and Hoess, 1984). Данный протокол использовали и в последующих работах (Mack et al., 1992), однако, в этом случае Cre экспрессировали под контролем T7 промотора в штамме E.coli BL21 (DE3), который широко применяется для продукции рекомбинантных белков в настоящее время и был использован в данном изобретении.

Дальнейшая модификация методов очистки нативного белка Cre была описана в работе (Ghosh and Van Duyne, 2002). Cre очищали с помощью комбинации двухстадийной катионообменной хроматографии на колонках SP и Mono S и последующей гидроксиапатитной хроматографии (Ghosh and Van Duyne, 2002). В другой работе нативный белок Cre для последующей кристаллизации очищали с использованием трехстадийной хроматографии на фосфоцеллюлозной колонке P11, катионообменной колонке Mono S и гель-фильтрации на носителе Superdex 200 (Ennifar et al., 2003).

Альтернативные методы очистки Cre основаны на использовании различных аффинных эпитопов. Например, Cre экспрессировали в виде слитого белка с MBP (Maltose binding protein), что позволяло проводить очистку рекомбинантного белка с помощью аффинной хроматографии на амилозной колонке (Kolb and Siddell, 1996). В этой работе Cre модифицировали, добавляя NLS, эпитоп MBP отщепляли с помощью протеазы фактор Xa, а отщепленный белок MBP удаляли с помощью ионообменной хроматографии на колонке с Q-сефарозой. Важно отметить, что N-концевой MBP-эпитоп не влиял на каталитическую активность Cre (Kolb and Siddell, 1996). Данный метод очистки Cre впоследствии использовали для получения рекомбинантного белка, пригодного для микроинъекций в ооциты мыши (Luckow et al., 2009; Shmerling et al., 2005) или слитого с пептидами, обеспечивающими проникновение в клетки млекопитающих (Jo et al., 2001).

Еще один вариант аффинной очистки Cre был основан на использовании белковых элементов интеинов, которые способны обеспечить посттрансляционное отщепление эпитопов от целевого белка без использования протеаз. Cre экспрессировали под контролем T7 промотора в виде слитого белка с интеином из Saccharomyces cerevisiae (Sce VMA интеин) и хитин-связывающим доменом из Bacillus circulans, который обеспечивал аффинную очистку рекомбинантного белка с помощью хитиновой колонки (Cantor and Chong, 2001). Для активации интеин-зависимого отщепления Cre колонку со связанным белком обрабатывали дитиотреитолом (ДТТ). Данный метод позволял получить белок Cre без каких-либо эпитопов используя лишь одностадийную аффинную хроматографию.

Широкое применение для очистки Cre из клеток E.coli нашла металл-хелатная аффинная хроматография в силу своей относительной простоты и эффективности (Block et al., 2009). Для получения рекомбинантного белка Cre c помощью металл-хелатной аффинной хроматографии часто использовали систему экспрессии компании Novagen, плазмидные векторы серии pET или pTriEx и соответствующие бактериальные штаммы, несущие лизоген DE3 (D'Astolfo et al., 2015; Jo et al., 2001; Martin et al., 2002; Peitz et al., 2002). В другом варианте белок Cre c 6-ти гистидиновым эпитопом очищали, используя систему QIAexpressionist (Qiagen) (Santoro and Schultz, 2002).

Кроме того, в качестве аффинного эпитопа для очистки Cre использовали глутатион-S-трансферазу (GST) из организма Schistosoma japonicum, проводя очистку на глутатионовой сефарозе. В частности, получали GST-Cre с последующим протеолитическим отщеплением GST эпитопа с помощью тромбина (Will et al., 2002) или использовали белок без отщепления GST (Jo et al., 2001). Полученный таким образом белок эффективно проникал в клетки млекопитающих в культуре и вызвал сайт-специфическую рекомбинацию. В другой работе Cre продуцировали в бактериальной системе экспрессии в виде слитого с GST белка, что не влияло на способность Cre связываться с LoxP сайтами (Kalinichenko et al., 2017) и позволяло осуществлять специфическую очистку фрагментов ДНК, содержащих LoxP сайты.

Как было отмечено выше, в ряде работ использовали комбинацию аффинной очистки и хроматографических методов очистки нативного белка. Например, Cre с N-концевым 6-гистидиновым эпитопом экспрессировали в векторе pET28b (Novagen) и очищали с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии и последующей катионообменной хроматографии. Полученный таким образом белок кристаллизовали в комплексе с олигонуклеотидными субстратами (Martin et al., 2002).

Актуальность получения каталитически активной формы Cre из бактериальной системы экспрессии иллюстрируется коммерческим использованием таких белков. Например, полученный из E.coli рекомбинантный белок Cre, слитый с Tat-пептидом вируса ВИЧ, и способный проникать в клетки без использования специальных реагентов для трансфекции белков, в настоящий момент коммерчески доступен от компаний Merck (https://www.merckmillipore.com/RU/ru/product/TAT-CRE-Recombinase,MM_NF-SCR508?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F) и Excellgen (https://www.excellgen.com/stem-cell-reagents-c-13/cre-recombinase-tatcre-tatnlscre-htnc-htncre-p-52931.html).

Учитывая опубликованные ранее данные, получение рекомбинантного белка Cre в бактериальной системе экспрессии представляется наиболее оптимальным подходом. Описанный в данном изобретении белок Cre несет NLS и продуцируется слитым с N-концевыми 6-гистидиновым и S-эпитопами, которые при необходимости могут быть отщеплены с использованием TEV протеазы. Как показано на Фиг.6, рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre, несущий N-концевые эпитопы, активен in vitro, что соответствует данными из работы (Kolb and Siddell, 1996) об отсутствии влияние N-концевых эпитопов на активность Cre. Использованный в данном изобретении метод очистки Cre основан на комбинации металл-хелатной аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе и катионообменной хроматографии на колонке Mono S.

In vitro анализ активности рекомбиназы Cre

Рекомбиназа Cre способна катализировать реакцию сайт-специфической рекомбинации in vitro. Тест на рекомбинацию с использованием в качестве субстрата кольцевой формы плазмидной ДНК, несущей сайты LoxP, впервые был реализован с использованием клеточного лизата E.coli, содержащего белок Cre (Abremski et al., 1983), а затем и с использованием очищенного рекомбинантного белка Cre (Abremski and Hoess, 1984). В качестве субстрата в реакции рекомбинации можно использовать кольцевую суперскрученную плазмидную ДНК, линейные фрагменты ДНК или кольцевые молекулы с никами (Abremski et al., 1983). Основные принципы проведения теста на рекомбинацию были описаны в работе Abremski и коллег (Abremski and Hoess, 1984). В частности, реакционный буфер для Cre включал 50 мМ Трис pH=7.5, 33 мМ NaCl, 5 мМ спермидин и 500 мкг/мл БСА, при этом спермидин в реакционном буфере может быть замен на 10 мМ MgCl₂. Для прохождения реакции не требуется источников энергии, достаточно лишь солевого буфера и 10 мМ MgCl₂ В качестве субстрата используется кольцевая плазмида, из которой в результате действия Cre формируются два кольцевых продукта реакции, которые для удобства детекции линеаризуются с помощью эндонуклеаз рестрикции и анализируются с помощью электрофореза в агарозном геле. Для терминации реакции смесь нагревают до +70°С для инактивации Cre.

Начиная с 1984 года in vitro тест для оценки активности рекомбинантного белка Cre применялся во множестве работ в разных форматах с некоторыми модификациями, наиболее часто протокол и состав реакционного буфера основывался на работе Abremski и коллег (Abremski and Hoess, 1984). Как правило, варьировали формат субстрата для реакции, используя кольцевые плазмиды, линеаризованные плазмиды, короткие синтетические двухцепочечные молекулы ДНК. Для количественной оценки реакции в некоторых случаях проводили радиоактивное мечение субстрата. В работе Kolb и коллег использовали два типа реакций: вырезание из кольцевой плазмиды фрагмента ДНК, фланкированного LoxP сайтами, и слияние двух кольцевых плазмид, несущих по одному LoxP сайту. Реакционный буфер включал 10 мМ Трис pH=7.5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂ и 1 мМ ДТТ (Kolb and Siddell, 1996).

В других работах в качестве субстрата использовали линеаризованную плазмиду, из которой под действием Cre вырезается фрагмент ДНК, и формируются укороченный линейный фрагмент и кольцевая молекула ДНК (Cantor and Chong, 2001; Ghosh and Van Duyne, 2002; Santoro and Schultz, 2002). Реакционная смесь содержала 20 мМ Трис pH=7.5, 300 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0.1% β-меркаптоэтанол и 0.5 нМ субстрата и 1000 нМ Cre (Santoro and Schultz, 2002). В других работах использовали 50 мМ Трис pH=7.5, 33 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂ (Cantor and Chong, 2001); 50 мМ Трис, pH=7.5, 50 мМ NaCl, 5 мМ спермина гидрохлорида, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ и 100 мкг/мл БСА или 50 мМ Трис pH 7.5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂ и 1 мМ ДТТ (Ghosh and Van Duyne, 2002). В другом варианте линейный субстрат для реакции in vitro получают с помощью ПЦР (Zhang et al., 2015).

Интересная модификация in vitro теста основана использование коротких двуцепочечных олигонуклеотидов, несущих LoxP сайты, в которых отсутствует одна фосфодиэфирная связь на разрезаемой цепи ДНК на 3'-стороне от отрезаемого фосфатного остатка (Ghosh and Van Duyne, 2002). В этом случае в результате действия Cre образуется стабильный комплекс Cre и субстрата.

Помимо этого, LoxP-Cre рекомбинация in vitro может быть эффективно использована для манипуляций с рекомбинантной ДНК: для манипуляций с геномом вируса простого герпеса (Gage et al., 1992), для получения рекомбинантных бакуловирусов (Peakman et al., 1992), для инверсии открытых рамок считывания в плазмидах системы рекомбинации FLEX, являясь эффективной альтернативой молекулярному клонированию (Xu and Zhu, 2018).

Рекомбинантный белок Cre коммерчески доступен от компании NEB под каталожным номером M0298 (https://international.neb.com/products/m0298-cre-recombinase#Product%20Information), а рекомендуемый реакционный буфер 50 мМ Трис-HCl pH=7.5, 33 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂ соответствует таковому из работы (Abremski and Hoess, 1984) и был использован в одной из недавних работ (Xu and Zhu, 2018). В данном изобретении для проведения реакции in vitro был использован реакционный буфер, в соответствии с данными из работы Abremski и коллег и рекомендациями компании NEB.

Использование белка Cre для геномной инженерии

Рекомбиназа Cre в виде белка применяется для геномной инженерии достаточно давно, что возможно благодаря достаточно простой и эффективной очистке рекомбинантного белка Cre (Ghosh and Van Duyne, 2002). Вначале было показано, что при липофекции белка Cre в клеточную линию млекопитающих происходит эффективная рекомбинация (интеграция или вырезания фрагмента ДНК) (Baubonis and Sauer, 1993). Оказалось что слитый белок MBP-Cre обладает такой же каталитической активностью in vitro как и нативный белок Cre, и способен эффективно индуцировать рекомбинацию при электропорации в клеточную линию млекопитающих (Kolb and Siddell, 1996).

В работе Araki и коллег была показана принципиальная возможность осуществления эффективной Cre-опосредованной рекомбинации в ооцитах мыши после микроинъекций кольцевой плазмидной ДНК, экспрессирующей Cre (Araki et al., 1995). Данный подход был эффективен и при микроинъекции мРНК Cre в ооциты мыши (de Wit et al., 1998). Несмотря на то, что авторы не обнаружили интеграции в геном плазмиды для экспрессии Cre (Araki et al., 1995), существует высокая вероятность интеграции даже плазмид в кольцевой форме. Поэтому для манипуляций с геномом зигот предпочтительно использовать мРНК или белок Cre. В частности, была показана Cre-опосредованная рекомбинация при реализации схемы RMCE при коинъекции кассеты для экспрессии Egfp и рекомбинантного белка MBP-Cre в ооциты, несущие «floxed» кассеты в локусе гена β-актина (Shmerling et al., 2005). Более, того инъецированные зиготы подсаживали псевдобеременным самкам получая потомков, несущих аллели с корректной заменой экспрессионных кассет. Однако в таких экспериментах эффективность замены кассет с помощью RMCE была достаточно низкая, порядка 0.3% (Shmerling et al., 2005). Важно отметить, что, в отличие от плазмид, длительно персистирующих в клетках, белок Cre находится в клетках транзиторно, что способствует сдвигу равновесия процесса RMCE в сторону интеграции кассет в геном, но не их вырезания. В другом примере микроинъекции белка MBP-Cre в ооциты мыши использовали для удаления маркерных генов устойчивости к антибиотикам, интегрированных в геном эмбриональных стволовых клеток в составе кассет для получения мышей с нокаутом генов CCR2 и CCR5 (Luckow et al., 2009).

Еще один вариант использования рекомбинантного белка Cre заключается в получении так называемых «клеточно-пермеабельных» вариантов Cre, которые проникают в клетки млекопитающих без использования реагентов для трансфекции или электропорации. Это достигается за счет слияния Cre c определенными аминокислотными последовательностями, опосредующими эффективное проникновение белка в клетку. Такие последовательности называют membrane translocation sequence, MTS; protein translocation sequence, PTS; protein transduction domain, PTD; cell-penetrating peptide, CPP. Впервые такой подход был описан с использованием рекомбинантного белка Cre с N-концевыми 6His эпитопом и NLS и C-концевой последовательностью MTS из белка FGF-4 (Jo et al., 2001). Белок 6His-NLS-Cre-MTS эффективно индуцировал рекомбинацию в модельных клеточных линиях. Более того, интраперитонеальное введение рекомбинантного белка 6His-NLS-Cre-MTS трансгенным мышам, несущим в локусе ROSA26 инактивированный репортерный ген β-галактозидазы, вызывало сайт-специфическую рекомбинацию и активировало экспрессию репортерного гена во всех тканях животного (Jo et al., 2001).

В работе Will и коллег использовали Cre, слитую с Tat-пептидом ВИЧ и PreS2-пептидом вируса HBV. Такие белки вызывали эффективную рекомбинацию в клеточной линии, несущей репортерную конструкцию в геноме (Will et al., 2002). Однако, как оказалось, белок Cre, слитый лишь с NLS из большого Т-антигена вируса SV40, а также нативный белок Cre тоже обладают способностью проникать в клетки и индуцировать рекомбинацию (Lin et al., 2004; Will et al., 2002). На клеточных культурах фибробластов и эмбриональных стволовых клетках мыши была подтверждена эффективность использования белка 6His-Tat-NLS-Cre, а также показана рекомбинация при использовании NLS-Cre, и обнаружено, что последовательность MTS из белка FGF-4 не является необходимой для проникновения Cre в клетку (Peitz et al., 2002). Данная технология находит применение для получения трансгенных свиней, свободных от маркерных генов, используемых для селекции корректно модифицированных фетальных фибробластов для последующего переноса ядер из соматических клеток (SCNT) (Kang et al., 2018). В этом случае использовали белок Cre, слитый с различными CPP/PTD (Tat пептид, R9 и CPP5), среди которых пептид CPP5 был наиболее эффективен (Kang et al., 2018).

Приведенные выше примеры иллюстрируют различные варианты использования рекомбинантного белка Cre для геномной инженерии в клеточных линиях, ооцитах мыши и взрослых трансгенных мышах. В совокупности, это указывает на целесообразность и важность получения рекомбинантного белка Cre, а также указывают на возможные варианты его применения.

Краткое описание изобретения

Данное изобретение решает задачу получения бактериального штамма, позволяющего эффективно продуцировать рекомбинантный белок Cre, слитый с 6-гистидиновым и S-эпитопами и последовательностью ядерной локализации из большого Т-антигена вируса SV40 (6His-S-NLS-Cre). Описан способ очистки белка 6His-S-NLS-Cre с помощью комбинации металл-хелатной аффинной и катионообменной хроматографии, позволяющий получить каталитически активную рекомбиназу Cre с выходом около 17 мкг с 1 мл культуры. Белок Cre может быть использован для геномной инженерии в модельных организмах и клеточных линиях, а также для манипуляций с рекомбинантной ДНК in vitro. В клетки млекопитающих возможна доставка Cre с помощью микроинъекций, электропорации или с использованием коммерчески доступных реагентов для трансфекции белков. Более того, возможно получение вариантов белка Cre, активно проникающих в клетки. Микроинъекции рекомбинантного белка Cre в эмбрионы модельных организмов, несущих в геноме сайты LoxP, можно использовать для интеграции фрагментов ДНК в целевое место генома, для удаления геномных последовательностей и получения кондиционного нокаута гена, для проведения RMCE. Доставку белка Cre можно рассматривать как альтернативу скрещиванию с «драйверными» линиями животных, экспрессирующими Cre. Применение белка Cre может повысить эффективность геномной инженерии, расширить арсенал используемых методов, элиминировать риск нецелевой интеграции генетических конструкций для экспрессии Cre в геном клетки-реципиента.

Осуществление/Раскрытие настоящего изобретения

Изобретение решает задачу получения бактериального штамма, эффективно продуцирующего рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre, представляющий собой сайт-специфическую рекомбиназу Cre, модифицированную путем добавления N-концевых 6-гистидинового и S-эпитопов, которые могут быть использованной для аффинной очистки рекомбинантного белка (Block et al., 2009; Raines et al., 2000). Продуцируемый в бактериальной системе рекомбинантный белок очищается с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии и катионообменной хроматографии. Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка содержит сайты расщепления для протеаз тромбина, энтеропептидазы (энтерокиназы) и TEV (протеаза вируса табачной мозаики). При необходимости, с помощью протеолитического расщепления удаляются 6-гистидиновый и S-эпитопы и получается белок Cre, несущий на N-конце лишь последовательность ядерной локализации (NLS) из большого Т-антигена вируса SV40 (Kalderon et al., 1984). Присутствие NLS важно для транслокации белка Cre в ядро и одновременно повышает сродство белка Cre к катионообменным носителям, что делает очистку данного белка более эффективной (более 90% чистоты, Фиг. 3). В другом техническом варианте очищают рекомбинантный белок без проведения протеолитического отщепления 6-гистидинового и S-эпитопов, что не влияет на функциональную активность рекомбиназы Cre.

Плазмидный вектор pET32v11-Cre получают с помощью методов генной инженерии путем амплификации кДНК рекомбиназы Cre и последующего клонирования в вектор pET32v11, таким образом, чтобы кДНК Cre с N-концевой NLS находилась в одной рамке считывания с 6-гистидиновым и S-эпитопами и аминокислотными последовательностями сайтов расщепления тромбина, энтерокиназы и протеазы TEV.

Штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующий рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre, получают путем трансформации компетентных клеток штамма Escherichia coli BL21(DE3) плазмидным вектором pET32v11-Cre. Штамм культивируют на селективной среде, содержащей антибиотик ампициллин в концентрации 50 мкг/мл, и хранят при -80°С в среде LB, содержащей 15% глицерина.

Для получения рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre клетки штамма-продуцента BL21(DE3)/pET32v11-Cre культивируют в богатой среде TB, индукцию синтеза рекомбинантного белка осуществляют в течение 16 часов при температуре +18°С путем внесения в среду индуктора ИПТГ (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид) до конечной концентрации 0.8 мМ. Суспензию клеток E.coli разрушают в буфере 30 мМ HEPES pH=7.4, 500 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 1 мМ MgCl₂, 10 мМ имидазол, 0.1% NP-40, 5% глицерин, 1 мМ β-меркаптоэтанол, 1 мМ фенилметилсульфонил фторид, 1х кратный коктейль ингибиторов протеаз VII (Calbiochem) и очищают рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии на носителе Ni-NTA (Qiagen). Фракции с максимальной концентрацией Cre объединяют и очищают с помощью катионообменной хроматографии на носителе Mono S 5/50 (GE Healthcare). Очищенный белок диализуют против буфера (20 мМ ацетат натрия pH=5.0, 40 мМ NaCl, 2 мМ ДТТ) и хранят в аликвотах при -80°С. В других воплощениях метода рекомбинантный белок очищают с помощью метал-хелатной аффинной хроматографии, проводят протеолитическое отщепление N-концевых эпитопов с помощью протеазы TEV и далее очищают белок с помощью катионообменной хроматографии.

Идентичность очищенного белка подтверждают с помощью ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга.

Специфическую активность очищенного рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre проверяют с помощью in vitro теста на рекомбинацию, используя в качестве субстрата кольцевую плазмидную ДНК, несущую сайты LoxP.

Штамм клеток Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre депонирован в Биоресурсный Центр Всероссийской коллекции Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИГенетика под номером В-13908.

Краткое описание чертежей

На Фиг. 1 показана генетическая карта плазмидной конструкции pET32v11-Cre, кодирующей рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre. Показаны основные элементы плазмиды: Ampicillin resistance gene (bla) - ген устойчивости к ампициллину (β-лактамаза); lacI - ген lac репрессора из E.coli; ColE1/pBR322 origin - точка начала репликации; f1 origin - точка начала репликации из бактериофага f1; 6His-S-NLS-Cre - кодирующая последовательность рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre; lac operator - lac оператор; T7 promoter - T7 промотор; T7 terminator - T7 терминатор; His tag и S-tag - 6-ти гистидиновый и S-эпитопы; thrombin, enterokinase, TEV cleavage site - сайты расщепления соответствующими протеазами. Кроме того, показан ряд уникальных сайтов рестрикции (EcoRI, SalI, XhoI, PstI и т.д.).

На Фиг. 2 показаны результаты анализа с помощью ДСН-ПААГ в 12%-ом акриламидном геле фракций, элюированных с катионообменной колонки Mono S при очистке рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre. Номера фракций указаны сверху. Часть исходного клеточного лизата диализовали перед нанесением на колонку Mono S. Элюированные фракции для такого образца отмечены сверху «d». Дорожка «w» - образец объединенных фракций промывки и прошедшего через колонку лизата. Дорожка «inp» содержит образец из объединенных фракций клеточного лизата с белком Cre после металл-хелатной хроматографии перед проведением диализа. Mw - маркер молекулярного веса белков: PageRuler™ Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa (ThermoFisher Scientific). Молекулярный вес полос маркера указан слева от рисунка. Полоса, соответствующая белку 6His-S-NLS-Cre, показана стрелкой.

На Фиг. 3 показаны результаты анализа в 10%-ом акриламидном геле с помощью ДСН-ПААГ очищенного рекомбинантного белка 6-His-S-NLS-Cre (дорожки «0.85 мкг» и «1.7 мкг») и образцов лизатов клеток штамма E.coli BL21 (DE3)/pET32v11-Cre до индукции синтеза рекомбинантного белка (дорожка «0 ч») и после культивации клеток штамма в среде, содержащий индуктор синтеза белка ИПТГ в концентрации 1 мМ в течение 3 часов при +37°С (дорожка «3 ч»). Справа указано положение полос маркера молекулярного веса белков Precision Plus Dual Color Protein Standard, (#161-0374 Bio-Rad). Полоса, соответствующая белку 6His-S-NLS-Cre, показана стрелкой.

На Фиг. 4 показаны результаты Вестерн-блот анализа очищенного рекомбинантного белка 6-His-S-NLS-Cre (дорожки «0.85 мкг» и «1.7 мкг») и образцов лизатов клеток штамма E.coli BL21 (DE3)/pET32v11-Cre до индукции синтеза рекомбинантного белка (дорожка «0 ч») и после культивации клеток штамма в среде, содержащий индуктор ИПТГ в концентрации 1 мМ в течение 3 часов при +37°С (дорожка «3 ч»). Для Вестерн-блот анализа использовали мышиные моноклональные антитела к 6-гистидиновому эпитопу (Sigma, #H1029, разведение 1:2000). Справа указано положение полос маркера молекулярного веса белков Precision Plus Dual Color Protein Standard, (#161-0374 Bio-Rad).

На Фиг. 5 показана схема проведения vitro теста на рекомбинацию с использованием модельной плазмиды pBl-Lox-PSMC-Lox-F3. В результате действия Cre из кольцевой плазмиды длиной 4743 п.н. (S) вырезается фрагмент ДНК, фланкированный двумя однонаправленными сайтами LoxP. В результате рекомбинации образуются два кольцевых продукта рекомбинации длиной 3183 (R1) и 1560 (R2) п.н. Под схемой приведены размеры линейный фрагментов ДНК, образующихся после обработки субстрата и продуктов реакции эндонуклеазой рестрикции EcoRI.

На Фиг. 6 показаны результаты in vitro теста на рекомбинацию с использованием модельной плазмиды pBl-Lox-PSMC-Lox-F3. Продукты реакции рекомбинации анализировали 1%-ом TAE-агарозном геле. Дорожка «Cre-» - субстрат инкубировали без добавления 6His-S-NLS-Cre; дорожка «Cre+» - субстрат инкубировали в присутствии 1 мкМ 6His-S-NLS-Cre. S - фрагменты ДНК, образующиеся при гидролизе субстрата эндонуклеазой рестрикции EcoRI. R1 и R2 - фрагменты ДНК, образующиеся при гидролизе продуктов реакции эндонуклеазой рестрикции EcoRI. Размеры продуктов реакции указаны слева. Размеры фрагментов маркера молекулярного веса ДНК (O'GeneRuler 1kb DNA Ladder, ThermoFisher Scientific), показаны справа.

Примеры осуществления настоящего изобретения

Пример 1.

Получение рекомбинантной плазмиды, кодирующей кДНК белка Cre, слитую с 6-гистидиновым и S-эпитопами

Для продукции белка Cre в бактериальной системе экспрессии с помощью методов генной инженерии получают рекомбинантную плазмидную конструкцию. Для этого кДНК рекомбиназы Cre амплифицируют с помощью ПЦР на матрице плазмиды pBluescriptSK II(+)-TERT-Surv-Cre-3DNMT1 (Bezborodova et al., 2018) с олигонуклеотидными праймерами 5-agaattcgagctccccaagaagaagaggaag-3 и 5-agtcgacctaatcgccatcttccag-3, содержащими сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции EcoRI и SalI, соответственно (выделены жирным шрифтом). Продукт амплификации анализируют с помощью электрофореза в 1%-ом агарозном геле, очищают из агарозного геля с помощью набора реагентов QiaexII (Qiagen) и клонируют в вектор pJET1 (ThermoFisher Scientific) получая вектор pJET1-Cre. Далее определяют полную нуклеотидную последовательность амплифицированного фрагмента с помощью секвенирования по Сэнгеру.

Далее, на основе вектора pET-32a(+) (Merck) получают модифицированный вектор pET32v11. Для этого, из вектора pGEX-6P1 (GE Healthcare) клонируют фрагмент NotI-XhoI, содержащий стоп-кодоны, в вектор pET-32a(+) по сайтам NotI-XhoI. В полученный вектор по сайтам NcoI-BamHI (выделены жирным шрифтом) клонируют фрагмент ДНК (5-ccatgggcagatctgaaaacctgtactttcagagcggatcc-3), содержащий сайт расщепления протеазой TEV. Далее, из полученного вектора удаляют NdeI-NdeI фрагмент, несущий кодирующую последовательность тиоредоксина, и получают вектор pET32v11 (SEQ ID NO 1).

В векторе pET32v11 сайт расщепления для протеазы TEV расположен таким образом, чтобы после очистки рекомбинантного белка с помощью металл-аффинной хроматографии используя протеазу TEV, при необходимости можно было отщепить N-концевой фрагмент очищенного белка, включающий 6-гистидиновый и S-эпитопы.

Далее EcoRI-SalI фрагмент, содержащий кДНК Cre, клонируют из вектора pJET1-Cre в плазмидный вектор pET32v11 по сайтам EcoRI-SalI таким образом, чтобы кДНК Cre находилась в одной рамке считывания с N-концевым 6-гистидиновым эпитопом. Полученную рекомбинантную плазмиду называют pET32v11-Cre.

Полученная плазмидная конструкция имеет размер 6648 п.н., (SEQ ID NO 2). Генетическая карта плазмиды pET32v11-Cre представлена на Фиг. 1. Слитый рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre, кодируемый данной плазмидой, имеет расчетный молекулярный вес 46.2 кДа и состоит из 411 аминокислотных остатков (SEQ ID NO 3).

Пример 2.

Процедура получения штамма бактерий E.coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующего рекомбинантный белок 6-His-S-NLS-Cre

Плазмидный вектор pET32v11-Cre трансформируют в штамм E.coli BL21 (DE3) с помощью стандартной методики трансформации бактерий (Titus, 1991) и высевают на LB агар (0.171 M NaCl, 1% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 1.5% агар), содержащий селективный антибиотик ампициллин в концентрации 50 мкг/мл и растят в течение 16 часов при температуре +37°С. Единичные колонии бактерий, выросших на селективной среде, пересевают штрихом на свежую селективную чашку, и растят в течение 16 часов при температуре +37°С. С чашки Петри бактериальной петлей берут единичную колонию бактерий и инокулируют 5 мл жидкой ростовой среды LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл и растят в течение 16 часов при температуре +37°С и постоянном перемешивании. 200 мкл ночной культуры переносят в 2 мл среды LB содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл и растят в течение 2 часов при температуре +37°С. Клетки E.coli осаждают центрифугированием, удаляют супернатант, осадок ресуспендируют в 500 мкл среды для заморозки (жидкая среда LB, содержащая 15% глицерина). Полученный штамм-продуцент хранят при температуре -80°С.

Пример 3.

Процедура получения рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre в бактериальной системе экспрессии

Клетки штамма E.coli BL21(DE3) трансформируют плазмидой pET32v11-Cre и высевают на чашку Петри с LB агаром, содержащим 0.5% глюкозу и 50 мкг/мл ампициллина. С чашки Петри смывают несколько колоний бактерий и ресуспендируют их в прогретой до +37°С среде Terrific Broth (TB; 17 мМ KH₂PO₄, 72 мМ K₂HPO₄, 5 мМ MgSO₄, 1.2% триптон, 2.4% дрожжевой экстракт, 0.5% глицерин) и инокулируют две 2-х литровые колбы, содержащие по 500 мл жидкой среды TB и ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. Бактерии растят при постоянном перемешивании и температуре +37°С в течение 3-5 часов до достижения оптической плотности 0.4 при длине волны 600 нм. Далее колбы охлаждают до +18°С и индуцируют экспрессию рекомбинантного белка путем добавления ИПТГ до конечной концентрации 0.8 мМ, добавляют ампициллин до концентрации 50 мкг/мл и растят бактерии при температуре +18°С в течение 16 часов при постоянном перемешивании (220 оборотов/мин).

Клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин и температуре +4°С в течение 20 минут, супернатант удаляют, а осадок промывают с использованием 50 мл фосфатно-солевого буфера (0.01 М натрия фосфат, 0.138 М NaCl, 0.0027 M KCl, pH=7.4), предварительно охлажденного до +4°С, и затем клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин и температуре +4°С в течение 20 минут. Супернатант удаляют, клеточную массу замораживают в жидком азоте и хранят при -80°С до стадии очистки белка.

Суспензию бактериальных клеток медленно оттаивают на льду, ресуспендируют в 30 мл буфера для лизиса (30 мМ HEPES pH=7.4, 500 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 1 мМ MgCl₂, 10 мМ имидазол, 0.1% NP-40, 5% глицерин, 1 мМ β-меркаптоэтанол, 1 мМ фенилметилсульфонил фторид, 1х кратный коктейль ингибиторов протеаз VII (Calbiochem) и разрушают с помощью гомогенизатора LV1 (Microfluidics).

Полученный лизат бактериальных клеток центрифугируют при 15000 об/мин и температуре +4°С в течение 60 минут, собирают осветленный лизат. Очистку белка проводят на хроматографе среднего давления Acta Pure (GE Healthcare). Осветленный лизат наносят на хроматографическую колонку, наполненную металл-хелатным аффинным носителем Ni-NTA agarose (Qiagen) объемом 5 мл, уравновешенную буфером для лизиса. Колонку промывают буфером (30 мМ HEPES pH=7.4, 500 мМ NaCl, 30 мМ имидазол, 0.1% NP-40, 1 мМ β-меркаптоэтанол). Связавшиеся с колонкой белки элюируют с помощью буфера (30 мМ HEPES pH=7.4, 500 мМ NaCl, 300 мМ имидазол, 1 мМ β-меркаптоэтанол). Собирают фракции с максимальным пиком поглощения при длине волны 280 нм.

Элюированные с Ni-NTA колонки фракции объединяют, разводят в два раза буфером (10 мМ NaKPO₄ pH=6.8, 10 мМ β-меркаптоэтанол) и наносят на катионообменную колонку Mono S 5/50 (GE Healthcare), уравновешенную буфером (10 мМ NaKPO₄ pH=6.8, 250 мМ NaCl, 10 мМ β-меркаптоэтанол). Колонку промывают буфером (10 мМ NaKPO₄ pH=6.8, 250 мМ NaCl, 10 мМ β-меркаптоэтанол). Связавшиеся с колонкой белки элюируют с помощью градиента соли от 500 мМ NaCl до 850 мМ NaCl в буфере 10 мМ NaKPO₄ pH=6.8, 10 мМ β-меркаптоэтанол. Собирают фракции объемом 1 мл. Фракции с максимальным пиком поглощения при длине волны 280 нм анализируют с помощью ДСН-ПААГ в 12%-ом акриламидном геле (Фиг. 2), как описано (Laemmli, 1970). Рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre эффективно элюируется с колонки при 700 мМ NaCl. Результат анализа фракций, собранных в процессе очистки рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre, приведен на Фиг. 2. Видно, что с Mono S колонки элюируется белок с молекулярным весом около 45 кДа, что соответствует ожидаемому. Фракции, сошедшие с колонки Mono S, и содержащие максимально чистый рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre, диализуют против буфера 20 мМ ацетат натрия pH=5.0, 40 мМ NaCl, 2 мМ ДТТ. Замораживают в жидком азоте в аликвотах и хранят при -80°С. Для проверки активности белка 6His-S-NLS-Cre размораживают аликвоту, проводят функциональный тест на рекомбинацию in vitro (Фиг. 5 и 6) и анализируют образец рекомбинантного белка с помощью ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга (Фиг. 3 и 4).

Пример 4.

Процедура определения идентичности и концентрации очищенного рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre

Концентрацию очищенного рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre определяют спектрофотометрически, измеряя поглощение образца белка при длине волны 280 нм по сравнению с буфером для диализа на спектрофотометре NanoDrop ND-8000 (ThermoFisher Scientific). Для расчета концентрации белка используют коэффициент молярной экстинкции для белка 6His-S-NLS-Cre, рассчитанный по его аминокислотной последовательности, и составляющий 50550. При этом 1 единица оптической плотности при длине волны 280 нм соответствует концентрации белка в 0.91 мг/мл.

Идентичность очищенного рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre определяют с помощью ДСН-ПААГ в 10% акриламидном геле и Вестерн-блоттинга. Готовят образцы лизатов бактериальных клеток штамма E.coli BL21 (DE3)/pET32v11-Cre до индукции синтеза рекомбинантного белка (0ч) и после культивации клеток штамма в среде, содержащий индуктор ИПТГ в концентрации 1 мМ в течение 3 часов при +37°С. Готовят образцы, содержащие 0.85 и 1.7 мкг очищенного белка 6His-S-NLS-Cre. Проводят электрофорез белков в 10%-ом акриламидном геле и окрашивают гель красителем Кумасси. На Фиг. 3 показано, что очищенный рекомбинантный белок 6-His-S-NLS-Cre (дорожки «0.85 мкг» и «1.7 мкг») мигрирует в геле на уровне между полосами маркера молекулярного веса 37 и 50 кДа, что близко к ожидаемому молекулярному весу белка 6His-S-NLS-Cre в 46.2 кДа. Чистота очищенного белка (дорожки «0.85 мкг» и «1.7 мкг») составляет более 90%. Детектируемое в геле количество белка 6-His-S-NLS-Cre и отсутствие в геле интенсивных полос низкого молекулярного веса, которые могли бы указывать на деградацию белка 6-His-S-NLS-Cre, указывают на стабильность полученного рекомбинантного белка при повторном замораживании и оттаивании.

Для подтверждения идентичности очищенного белка проводят Вестерн-блот анализ. Проводят электрофоретическое разделение описанных выше образцов в 10%-ом акриламидном геле, переносят белки из геля на PVDF мембрану (Millipore) c помощью прибора для электропереноса SV20-SDB (Sigma). Мембрану блокируют в буфере TBS-T (50 мМ Трис-HCl pH=8.0, 138 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 0.05% Tween-20), содержащем 5% сухое обезжиренное молоко (TBS-T5%). Далее инкубируют мембрану в течение 16 часов при +4°С в буфере TBS-T5% с мышиными моноклональными антителами к 6-ти гистидиновому эпитопу (Sigma, #H1029) в разведении 1:2000. Мембрану три раза промывают в буфере TBS-T и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре со вторичными антителами против иммуноглобулинов мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена (GE Healthcare, #NA931V), в разведении 1:5000. Мембрану три раза промывают в буфере TBS-T, детектируют связавшиеся антитела с помощью набора реагентов Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore). Хемилюминесценцию детектируют с помощью системы гель-документации ChemiDoc XRS (Bio-Rad). На Фиг. 4 показан результат Вестерн-блот анализа. Видно, что с помощью антител к 6-ти гистидиновому эпитопу детектируются полосы с молекулярным весом немного ниже 50 кДа (дорожки «3 ч», «0.85 мкг» и «1.7 мкг»), что соответствует ожидаемому молекулярному весу белка 6His-S-NLS-Cre в 46.2 кДа. Важно отметить, что интенсивная иммунореактивная полоса ожидаемого молекулярного веса присутствует лишь в образце лизата клеток штамма E.coli BL21 (DE3)/pET32v11-Cre после индукции синтеза рекомбинантного белка (дорожка «3 ч»), но не в неидуцированном клеточном лизате (дорожка «0 ч»), в котором детектируется лишь слабая иммунореактивная полоса, которая отражает синтез белка в отсутствии индукции экспрессии за счет «подтекания» промотора lacUV5 в геноме E.coli, контролирующего экспрессию T7 РНК-полимеразы. Эти результаты подтверждают идентичность очищенного рекомбинантного белка. В дорожках «0.85 мкг» и «1.7 мкг» детектируются полосы с молекулярным весом менее 37 кДа, которые представляют собой либо продукты деградации очищенного белка, либо продукты преждевременной терминации синтеза белка в клетках E.coli. Интенсивность окрашивания этих полос обусловлена высокой концентрацией белка в анализированных образцах. Как видно, из Фиг. 3, интенсивность низкомолекулярных полос существенно слабее полосы в геле, соответствующей очищенному белку Cre, что указывает на стабильность белка 6His-S-NLS-Cre.

Пример 5.

In vitro тест на сайт-специфическую рекомбинацию

Для проведения реакции рекомбинации in vitro в качестве субстрата используют плазмиду pBl-Lox-PSMC-Lox-F3 размером 4347 п.н. (SEQ ID NO 4), в которой нуклеотидная последовательность терминатора транскрипции из гена PSMC5 человека, фланкирована двумя однонаправленными сайтами LoxP. В результате действия рекомбиназы Cre из кольцевого плазмидного субстрата вырезается фрагмент ДНК с образованием двух кольцевых продуктов рекомбинации размером 3183 п.н. и 1560 п.н. (Фиг. 5). Продукты реакции и субстрат линеаризуют, используя эндонуклеазу рестрикции EcoRI и анализируют с помощью электрофореза в 1%-ом агарозном геле. При гидролизе субстрата эндонуклеазой рестрикции EcoRI образуются фрагменты ДНК длиной 4298, 313, 114 и 18 п.н., обозначены S на Фиг. 6, за исключением фрагмента длиной 18 п.н., который не детектируется в геле; при гидролизе продуктов реакции образуются фрагменты длиной 3051, 114 и 18 п.н. (R1) и 1560 п.н. (R2). Схема проведения in vitro теста на сайт-специфическую рекомбинацию показана на Фиг. 5.

Для проведения реакции рекомбинации готовят смесь объемом 40 мкл, содержащую 50 мМ Трис-HCl pH=7.5, 10 мМ MgCl₂, 30 мМ NaCl, 1 мкг плазмидной ДНК, 1 мкМ 6-His-S-NLS-Cre. Реакцию инкубируют при +37°С в течение 30 минут. Далее, для инактивации рекомбиназы Cre реакцию инкубируют 10 мин при +70°С. После этого к реакции добавляют 5 мкл 10-ти кратного буфера “Orange” «ThermoFisher Scientific», 4 мкл воды и 1 мкл (10 ед. активности) эндонуклеазы рестрикции EcoRI «ThermoFisher Scientific»). Инкубируют реакцию при +37°С в течение 1 часа. Добавляют 1 мкл протеиназы K (20 мкг/мкл, «Sigma-Aldrich») и инкубируют реакцию 10 минут при +56°С для протеолиза Cre и высвобождения продуктов реакции. Анализируют продукты реакции в 1%-ом агарозном геле.

На Фиг. 6 показан результат теста на сайт-специфическую рекомбинацию. При инкубации плазмидной ДНК pBl-Lox-PSMC-Lox-F3 с рекомбинантным белком 6-His-S-NLS-Cre (образец Cre+) при +37°С образуются продукты реакции (R1 и R2) ожидаемого размера. При инкубации плазмиды без добавления белка детектируется лишь фрагменты исходного субстрата (S) длиной 4298, 313 и 114 п.н.. Так как фрагменты длиной 313 и 114 п.н. образуются при гидролизе, как субстрата, так и продуктов реакции, то именно появление продуктов реакции длиной 3051 п.н. (R1) и 1560 п.н. (R2) указывает на прохождение Cre-опосредованной рекомбинации.

Основные характеристики клеток (по данным паспорта штамма)

1. Родовое и видовое название штамма-хозяина (реципиента): Escherichia coli

2. Номер или наименование штамма: BL21(DE3)/pET32v11-Cre

3. Способ получения штамма: получен трансформацией.

4. Область применения штамма: получение рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre

5. Продукт, синтезируемый штаммом: белок 6His-S-NLS-Cre

6. Активность (продуктивность) штамма, а также другие производственные показатели: 17 мкг белка на 1 мл среды

7. Способ определения активности штамма с указанием метода: in vitro тест на рекомбинацию

8. Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма: среда LB + 15% глицерина в ампулах на -80°С

9. Способ, условия и состав сред для размножения штамма: среда LB, содержащая 50 мкг/мл ампициллина

10. Группа уровня риска штамма: I

11. Генетические особенности штамма:

а. Генотип штамма хозяина (мутации, делеции, инверсии, наличие плазмид или профагов, устойчивость (чувствительность) к антибиотикам, фагам и т.д., прочие генетические особенности): генотип штамма генотип штамма BL21 (DE3): F^- ompT gal dcm lon hsdS_B(r_B^-m_B^-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB⁺]_K-12(λ^S)

б. Описание рекомбинантной плазмиды

Название плазмиды: pET32v11-Cre

Размер плазмиды pET32v11-Cre: 6648 пар нуклеотидов

Полная нуклеотидная последовательность плазмиды: SEQ ID NO: 2.

в. Сведения о векторе, на основе которого сконструирована плазмида:

Название вектора; pET-32a(+)

Происхождение вектора и его основных генетических элементов;

Вектор pET-32a(+) содержит:

- ген устойчивости к ампициллину (β-лактамаза)

- ген lac репрессора (lacI) из E.coli

- точку начала репликации из плазмид ColE1/pBR322 из E.coli.

- точку начала репликации из бактериофага f1

- ген rop из E.coli, кодирующий белок, регулирующий копийность плазмиды

- кодирующую последовательность гена тиоредоксина trxA из E.coli

г. Сведения о клонированной ДНК

Видовая принадлежность донорного организма: Escherichia virus P1

Общие сведения о клонированном фрагменте, размер и включенные в его состав гены; плазмида содержит кДНК гена Cre длиной 1026 п.н., кодируемого геномом бактериофага P1 (Genebank Acc.: NC_005856.1)

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Abremski, K., and R. Hoess. 1984. Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein. J Biol Chem. 259:1509-1514.

Abremski, K., R. Hoess, and N. Sternberg. 1983. Studies on the properties of P1 site-specific recombination: evidence for topologically unlinked products following recombination. Cell. 32:1301-1311.

Akagi, K., V. Sandig, M. Vooijs, M. Van der Valk, M. Giovannini, M. Strauss, and A. Berns. 1997. Cre-mediated somatic site-specific recombination in mice. Nucleic Acids Res. 25:1766-1773.

Araki, K., M. Araki, J. Miyazaki, and P. Vassalli. 1995. Site-specific recombination of a transgene in fertilized eggs by transient expression of Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci USA. 92:160-164.

Austin, S., M. Ziese, and N. Sternberg. 1981. A novel role for site-specific recombination in maintenance of bacterial replicons. Cell. 25:729-736.

Baubonis, W., and B. Sauer. 1993. Genomic targeting with purified Cre recombinase. Nucleic Acids Res. 21:2025-2029.

Bezborodova, O.A., I.V. Alekseenko, E.R. Nemtsova, A.A. Pankratov, O.B. Filyukova, R.I. Yakubovskaya, M.B. Kostina, V.K. Potapov, and E.D. Sverdlov. 2018. The Antitumor Efficacy of a Complex Based on Two-Vector System for Coexpression of the Suicide Gene Fcu1 and Cre Recombinase. Dokl Biochem Biophys. 483:326-328.

Block, H., B. Maertens, A. Spriestersbach, N. Brinker, J. Kubicek, R. Fabis, J. Labahn, and F. . 2009. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463:439-473.

Branda, C.S., and S.M. Dymecki. 2004. Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice. Dev Cell. 6:7-28.

Cai, D., K.B. Cohen, T. Luo, J.W. Lichtman, and J.R. Sanes. 2013. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nat Methods. 10:540-547.

Cantor, E.J., and S. Chong. 2001. Intein-mediated rapid purification of Cre recombinase. Protein Expr Purif. 22:135-140.

D'Astolfo, D.S., R.J. Pagliero, A. Pras, W.R. Karthaus, H. Clevers, V. Prasad, R.J. Lebbink, H. Rehmann, and N. Geijsen. 2015. Efficient intracellular delivery of native proteins. Cell. 161:674-690.

de Wit, T., D. Drabek, and F. Grosveld. 1998. Microinjection of cre recombinase RNA induces site-specific recombination of a transgene in mouse oocytes. Nucleic Acids Res. 26:676-678.

Ennifar, E., J.E. Meyer, F. Buchholz, A.F. Stewart, and D. Suck. 2003. Crystal structure of a wild-type Cre recombinase-loxP synapse reveals a novel spacer conformation suggesting an alternative mechanism for DNA cleavage activation. Nucleic Acids Res. 31:5449-5460.

Gage, P.J., B. Sauer, M. Levine, and J.C. Glorioso. 1992. A cell-free recombination system for site-specific integration of multigenic shuttle plasmids into the herpes simplex virus type 1 genome. J Virol. 66:5509-5515.

Ghosh, K., and G.D. Van Duyne. 2002. Cre-loxP biochemistry. Methods. 28:374-383.

Gurumurthy, C.B., A.R. O'Brien, R.M. Quadros, J. Adams, Jr., P. Alcaide, S. Ayabe, J. Ballard, S.K. Batra, M.C. Beauchamp, K.A. Becker, G. Bernas, D. Brough, F. Carrillo-Salinas, W. Chan, H. Chen, R. Dawson, V. DeMambro, J. D'Hont, K.M. Dibb, J.D. Eudy, L. Gan, J. Gao, A. Gonzales, A.R. Guntur, H. Guo, D.W. Harms, A. Harrington, K.E. Hentges, N. Humphreys, S. Imai, H. Ishii, M. Iwama, E. Jonasch, M. Karolak, B. Keavney, N.C. Khin, M. Konno, Y. Kotani, Y. Kunihiro, I. Lakshmanan, C. Larochelle, C.B. Lawrence, L. Li, V. Lindner, X.D. Liu, G. Lopez-Castejon, A. Loudon, J. Lowe, L.A. Jerome-Majewska, T. Matsusaka, H. Miura, Y. Miyasaka, B. Morpurgo, K. Motyl, Y.I. Nabeshima, K. Nakade, T. Nakashiba, K. Nakashima, Y. Obata, S. Ogiwara, M. Ouellet, L. Oxburgh, S. Piltz, I. Pinz, M.P. Ponnusamy, D. Ray, R.J. Redder, C.J. Rosen, N. Ross, M.T. Ruhe, L. Ryzhova, A.M. Salvador, S.S. Alam, R. Sedlacek, K. Sharma, C. Smith, K. Staes, L. Starrs, F. Sugiyama, S. Takahashi, T. Tanaka, A.W. Trafford, Y. Uno, L. Vanhoutte, F. Vanrockeghem, B.J. Willis, C.S. Wright, Y. Yamauchi, X. Yi, K. Yoshimi, X. Zhang, Y. Zhang, M. Ohtsuka, S. Das, D.J. Garry, T. Hochepied, P. Thomas, J. Parker-Thornburg, A.D. Adamson, A. Yoshiki, et al. 2019. Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation. Genome Biol. 20:019-1776.

Jo, D., A. Nashabi, C. Doxsee, Q. Lin, D. Unutmaz, J. Chen, and H.E. Ruley. 2001. Epigenetic regulation of gene structure and function with a cell-permeable Cre recombinase. Nat Biotechnol. 19:929-933.

Kalderon, D., B.L. Roberts, W.D. Richardson, and A.E. Smith. 1984. A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell. 39:499-509.

Kalinichenko, S.V., M.V. Shepelev, and I.V. Korobko. 2017. A gel-less isolation of untagged plasmid DNA insert from vector backbone in homogeneous format. Anal Biochem. 521:28-30.

Kang, Q., Z. Sun, Z. Zou, M. Wang, Q. Li, X. Hu, and N. Li. 2018. Cell-penetrating peptide-driven Cre recombination in porcine primary cells and generation of marker-free pigs. PLoS One. 13.

Kolb, A.F., and S.G. Siddell. 1996. Genomic targeting with an MBP-Cre fusion protein. Gene. 183:53-60.

Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227:680-685.

Lakso, M., B. Sauer, B. Mosinger, Jr., E.J. Lee, R.W. Manning, S.H. Yu, K.L. Mulder, and H. Westphal. 1992. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA. 89:6232-6236.

Lin, Q., D. Jo, K.D. Gebre-Amlak, and H.E. Ruley. 2004. Enhanced cell-permeant Cre protein for site-specific recombination in cultured cells. BMC Biotechnol. 4:1472-6750.

Livet, J., T.A. Weissman, H. Kang, R.W. Draft, J. Lu, R.A. Bennis, J.R. Sanes, and J.W. Lichtman. 2007. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450:56-62.

, M.B., D.J. Rose, G. Plunkett, 3rd, M. Rusin, A. Samojedny, H. Lehnherr, M.B. Yarmolinsky, and F.R. Blattner. 2004. Genome of bacteriophage P1. J Bacteriol. 186:7032-7068.

Low, B.E., P.M. Kutny, and M.V. Wiles. 2016. Simple, Efficient CRISPR-Cas9-Mediated Gene Editing in Mice: Strategies and Methods. Methods Mol Biol:3661-3668_3662.

Lu, C., and H.P. Erickson. 1997. Expression in Escherichia coli of the thermostable DNA polymerase from Pyrococcus furiosus. Protein Expr Purif. 11:179-184.

Luckow, B., A. Hanggli, H. Maier, S. Chilla, R.P. Loewe, S. Dehmel, D. Schlondorff, P. Loetscher, H.G. Zerwes, and M. Muller. 2009. Microinjection of Cre recombinase protein into zygotes enables specific deletion of two eukaryotic selection cassettes and enhances the expression of a DsRed2 reporter gene in Ccr2/Ccr5 double-deficient mice. Genesis. 47:545-558.

Mack, A., B. Sauer, K. Abremski, and R. Hoess. 1992. Stoichiometry of the Cre recombinase bound to the lox recombining site. Nucleic Acids Res. 20:4451-4455.

Martin, S.S., E. Pulido, V.C. Chu, T.S. Lechner, and E.P. Baldwin. 2002. The order of strand exchanges in Cre-LoxP recombination and its basis suggested by the crystal structure of a Cre-LoxP Holliday junction complex. J Mol Biol. 319:107-127.

McLellan, M.A., N.A. Rosenthal, and A.R. Pinto. 2017. Cre-loxP-Mediated Recombination: General Principles and Experimental Considerations. Curr Protoc Mouse Biol. 7:1-12.

Metje-Sprink, J., J. Menz, D. Modrzejewski, and T. Sprink. 2019. DNA-Free Genome Editing: Past, Present and Future. Front Plant Sci. 9.

Orban, P.C., D. Chui, and J.D. Marth. 1992. Tissue- and site-specific DNA recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA. 89:6861-6865.

Peakman, T.C., R.A. Harris, and D.R. Gewert. 1992. Highly efficient generation of recombinant baculoviruses by enzymatically medicated site-specific in vitro recombination. Nucleic Acids Res. 20:495-500.

Peitz, M., K. Pfannkuche, K. Rajewsky, and F. Edenhofer. 2002. Ability of the hydrophobic FGF and basic TAT peptides to promote cellular uptake of recombinant Cre recombinase: a tool for efficient genetic engineering of mammalian genomes. Proc Natl Acad Sci USA. 99:4489-4494.

Plummer, N.W., E.K. Ungewitter, K.G. Smith, H.H. Yao, and P. Jensen. 2017. A new mouse line for cell ablation by diphtheria toxin subunit A controlled by a Cre-dependent FLEx switch. Genesis. 55:19.

Ponsaerts, P., J.P. Brown, D. Van den Plas, L. Van den Eeden, D.R. Van Bockstaele, P.G. Jorens, V.F. Van Tendeloo, J. Merregaert, P.B. Singh, and Z.N. Berneman. 2004. Messenger RNA electroporation is highly efficient in mouse embryonic stem cells: successful FLPe- and Cre-mediated recombination. Gene Ther. 11:1606-1610.

Raines, R.T., M. McCormick, T.R. Van Oosbree, and R.C. Mierendorf. 2000. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326:362-376.

Santoro, S.W., and P.G. Schultz. 2002. Directed evolution of the site specificity of Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci USA. 99:4185-4190.

Sauer, B. 1998. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods. 14:381-392.

Sauer, B., and N. Henderson. 1988. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proc Natl Acad Sci USA. 85:5166-5170.

Schlake, T., and J. Bode. 1994. Use of mutated FLP recognition target (FRT) sites for the exchange of expression cassettes at defined chromosomal loci. Biochemistry. 33:12746-12751.

, F., N. Doerflinger, C. , O. Wendling, P. Chambon, and N.B. Ghyselinck. A directional strategy for monitoring Cre-mediated recombination at the cellular level in the mouse.

Shmerling, D., C.P. Danzer, X. Mao, J. Boisclair, M. Haffner, M. Lemaistre, V. Schuler, E. Kaeslin, R. Korn, K. , B. Ledermann, B. Kinzel, and M. . 2005. Strong and ubiquitous expression of transgenes targeted into the beta-actin locus by Cre/lox cassette replacement. Genesis. 42:229-235.

Siegel, R.W., R. Jain, and A. Bradbury. 2001. Using an in vivo phagemid system to identify non-compatible loxP sequences. FEBS Lett. 505:467-473.

Singh, P., J.C. Schimenti, and E. Bolcun-Filas. 2015. A mouse geneticist's practical guide to CRISPR applications. Genetics. 199:1-15.

Sternberg, N., and D. Hamilton. 1981. Bacteriophage P1 site-specific recombination. I. Recombination between loxP sites. J Mol Biol. 150:467-486.

Titus, D.E. 1991. Cloning of DNA inserts. In Promega Protocols and Applications Guide. D.E. Titus, editor, USA. 52-53.

Turan, S., M. Galla, E. Ernst, J. Qiao, C. Voelkel, B. Schiedlmeier, C. Zehe, and J. Bode. 2011. Recombinase-mediated cassette exchange (RMCE): traditional concepts and current challenges. J Mol Biol. 407:193-221.

Turan, S., C. Zehe, J. Kuehle, J. Qiao, and J. Bode. 2013. Recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) - a rapidly-expanding toolbox for targeted genomic modifications. Gene. 515:1-27.

Van Duyne, G.D. 2015. Cre Recombinase. Microbiol Spectr. 3:0014-2014.

Will, E., H. Klump, N. Heffner, M. Schwieger, B. Schiedlmeier, W. Ostertag, C. Baum, and C. Stocking. 2002. Unmodified Cre recombinase crosses the membrane. Nucleic Acids Res. 30.

Xu, J., and Y. Zhu. 2018. A rapid in vitro method to flip back the double-floxed inverted open reading frame in a plasmid. BMC Biotechnol. 18:018-0462.

Zhang, C., C.A. Myers, Z. Qi, R.D. Mitra, J.C. Corbo, and J.J. Havranek. 2015. Redesign of the monomer-monomer interface of Cre recombinase yields an obligate heterotetrameric complex. Nucleic Acids Res. 43:9076-9085.

--->

<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт

биологии гена Российской академии наук (Institute of Gene Biology Russian

Academy of Sciences)

<120> Штамм клеток Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующих

сайт-специфическую рекомбиназу Cre

<160> 4

<210> 1

<211> 5596

<212> ДНК

<213> artificial sequence

<220>

<223> Плазмидная конструкция pET32v11

<400> 1

gatcccgcga aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct 60

ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca tatgcaccat catcatcatc 120

attcttctgg tctggtgcca cgcggttctg gtatgaaaga aaccgctgct gctaaattcg 180

aacgccagca catggacagc ccagatctgg gtaccgacga cgacgacaag gccatgggca 240

gatctgaaaa cctgtacttt cagagcggat ccccggaatt cccgggtcga ctcgatcgag 300

cggccgcatc gtgactgact gacgatctcg agcaccacca ccaccaccac tgagatccgg 360

ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag 420

cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta 480

tatccggatt ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt 540

ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt 600

cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct 660

ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg 720

tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga 780

gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc 840

ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga 900

gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta caatttcagg 960

tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc 1020

aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag 1080

gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg 1140

ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt 1200

gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt 1260

tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt 1320

attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa 1380

tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag 1440

agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac 1500

aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac 1560

tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac 1620

cacgatgcct gcagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac 1680

tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact 1740

tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg 1800

tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt 1860

tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat 1920

aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta 1980

gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa 2040

tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga 2100

aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac 2160

aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt 2220

tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc 2280

gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat 2340

cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag 2400

acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc 2460

cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag 2520

cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac 2580

aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg 2640

gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct 2700

atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc 2760

tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga 2820

gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga 2880

agcggaagag cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg 2940

catatatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagtataca 3000

ctccgctatc gctacgtgac tgggtcatgg ctgcgccccg acacccgcca acacccgctg 3060

acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct 3120

ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg aggcagctgc 3180

ggtaaagctc atcagcgtgg tcgtgaagcg attcacagat gtctgcctgt tcatccgcgt 3240

ccagctcgtt gagtttctcc agaagcgtta atgtctggct tctgataaag cgggccatgt 3300

taagggcggt tttttcctgt ttggtcactg atgcctccgt gtaaggggga tttctgttca 3360

tgggggtaat gataccgatg aaacgagaga ggatgctcac gatacgggtt actgatgatg 3420

aacatgcccg gttactggaa cgttgtgagg gtaaacaact ggcggtatgg atgcggcggg 3480

accagagaaa aatcactcag ggtcaatgcc agcgcttcgt taatacagat gtaggtgttc 3540

cacagggtag ccagcagcat cctgcgatgc agatccggaa cataatggtg cagggcgctg 3600

acttccgcgt ttccagactt tacgaaacac ggaaaccgaa gaccattcat gttgttgctc 3660

aggtcgcaga cgttttgcag cagcagtcgc ttcacgttcg ctcgcgtatc ggtgattcat 3720

tctgctaacc agtaaggcaa ccccgccagc ctagccgggt cctcaacgac aggagcacga 3780

tcatgcgcac ccgtggggcc gccatgccgg cgataatggc ctgcttctcg ccgaaacgtt 3840

tggtggcggg accagtgacg aaggcttgag cgagggcgtg caagattccg aataccgcaa 3900

gcgacaggcc gatcatcgtc gcgctccagc gaaagcggtc ctcgccgaaa atgacccaga 3960

gcgctgccgg cacctgtcct acgagttgca tgataaagaa gacagtcata agtgcggcga 4020

cgatagtcat gccccgcgcc caccggaagg agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca 4080

tcggtcgaga tcccggtgcc taatgagtga gctaacttac attaattgcg ttgcgctcac 4140

tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 4200

cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcc agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg 4260

ggcaacagct gattgccctt caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg 4320

ctggtttgcc ccagcaggcg aaaatcctgt ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat 4380

gagctgtctt cggtatcgtc gtatcccact accgagatgt ccgcaccaac gcgcagcccg 4440

gactcggtaa tggcgcgcat tgcgcccagc gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca 4500

gtgggaacga tgccctcatt cagcatttgc atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc 4560

cagtcgcctt cccgttccgc tatcggctga atttgattgc gagtgagata tttatgccag 4620

ccagccagac gcagacgcgc cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc 4680

tggtgaccca atgcgaccag atgctccacg cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa 4740

ataatactgt tgatgggtgt ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg 4800

caggcagctt ccacagcaat ggcatcctgg tcatccagcg gatagttaat gatcagccca 4860

ctgacgcgtt gcgcgagaag attgtgcacc gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt 4920

tctaccatcg acaccaccac gctggcaccc agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg 4980

acaatttgcg acggcgcgtg cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac 5040

tgtttgcccg ccagttgttg tgccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc 5100

gcttccactt tttcccgcgt tttcgcagaa acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa 5160

acggtctgat aagagacacc ggcatactct gcgacatcgt ataacgttac tggtttcaca 5220

ttcaccaccc tgaattgact ctcttccggg cgctatcatg ccataccgcg aaaggttttg 5280

cgccattcga tggtgtccgg gatctcgacg ctctccctta tgcgactcct gcattaggaa 5340

gcagcccagt agtaggttga ggccgttgag caccgccgcc gcaaggaatg gtgcatgcaa 5400

ggagatggcg cccaacagtc ccccggccac ggggcctgcc accataccca cgccgaaaca 5460

agcgctcatg agcccgaagt ggcgagcccg atcttcccca tcggtgatgt cggcgatata 5520

ggcgccagca accgcacctg tggcgccggt gatgccggcc acgatgcgtc cggcgtagag 5580

gatcgagatc gatctc 5596

<210> 2

<211> 6648

<212> ДНК

<213> artificial sequence

<220>

<223> Плазмидная конструкция pET32v11-Cre:

gatcccgcga aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct 60

ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca tatgcaccat catcatcatc 120

attcttctgg tctggtgcca cgcggttctg gtatgaaaga aaccgctgct gctaaattcg 180

aacgccagca catggacagc ccagatctgg gtaccgacga cgacgacaag gccatgggca 240

gatctgaaaa cctgtacttt cagagcggat ccccggaatt cgagctcccc aagaagaaga 300

ggaaggtgtc caatttactg accgtacacc aaaatttgcc tgcattaccg gtcgatgcaa 360

cgagtgatga ggttcgcaag aacctgatgg acatgttcag ggatcgccag gcgttttctg 420

agcatacctg gaaaatgcta ctgtccgttt gccggtcgtg ggcggcatgg tgcaagttga 480

ataaccggaa atggtttccc gcagaacctg aagatgttcg cgattatctt ctatatcttc 540

aggcgcgcgg tctggcagta aaaactatcc agcaacattt gggccagcta aacatgcttc 600

atcgtcggtc cgggctgcca cgaccaagtg acagcaatgc tgtttcactg gttatgcggc 660

ggatccgaaa agaaaacgtt gatgccggtg aacgtgcaaa acaggctcta gcgttcgaac 720

gcactgattt cgaccaggtt cgttcactca tggaaaatag cgatcgctgc caggatatac 780

gtaatctggc atttctgggg attgcttata acaccctgtt acgtatagcc gaaattgcca 840

ggatcagggt taaagatatc tcacgtactg acggtgggag aatgttaatc catattggca 900

gaacgaaaac gctggttagc accgcaggtg tagagaaggc acttagcctg ggggtaacta 960

aactggtcga gcgatggatt tccgtctctg gtgtagctga tgatccgaat aactacctgt 1020

tttgccgggt cagaaaaaat ggtgttgccg cgccatctgc caccagccag ctatcaactc 1080

gcgccctgga agggattttt gaagcaactc atcgattgat ttacggcgct aaggatgact 1140

ctggtcagag atacctggcc tggtctggac acagtgcccg tgtcggagcc gcgcgagata 1200

tggcccgcgc tggagtttca ataccggaga tcatgcaagc tggtggctgg accaatgtaa 1260

atattgtcat gaactatatc cgtaacctgg atagtgaaac aggggcaatg gtgcgcctgc 1320

tggaagatgg cgattaggtc gactcgatcg agcggccgca tcgtgactga ctgacgatct 1380

cgagcaccac caccaccacc actgagatcc ggctgctaac aaagcccgaa aggaagctga 1440

gttggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt 1500

cttgaggggt tttttgctga aaggaggaac tatatccgga ttggcgaatg ggacgcgccc 1560

tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt 1620

gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc 1680

ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta 1740

cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc 1800

tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg 1860

ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt 1920

ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat 1980

tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga 2040

acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa 2100

ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt 2160

gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg 2220

ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg 2280

gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg 2340

agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag 2400

caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca 2460

gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg 2520

agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc 2580

gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg 2640

aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgcagcaat ggcaacaacg 2700

ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac 2760

tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg 2820

tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg 2880

gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact 2940

atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa 3000

ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 3060

aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 3120

ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct 3180

ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt 3240

tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 3300

cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct 3360

gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc 3420

gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 3480

tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa 3540

ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg 3600

gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg 3660

ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga 3720

tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt 3780

ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct 3840

gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga 3900

acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcctgat gcggtatttt 3960

ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatatg gtgcactctc agtacaatct 4020

gctctgatgc cgcatagtta agccagtata cactccgcta tcgctacgtg actgggtcat 4080

ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc 4140

ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc 4200

accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagct gcggtaaagc tcatcagcgt ggtcgtgaag 4260

cgattcacag atgtctgcct gttcatccgc gtccagctcg ttgagtttct ccagaagcgt 4320

taatgtctgg cttctgataa agcgggccat gttaagggcg gttttttcct gtttggtcac 4380

tgatgcctcc gtgtaagggg gatttctgtt catgggggta atgataccga tgaaacgaga 4440

gaggatgctc acgatacggg ttactgatga tgaacatgcc cggttactgg aacgttgtga 4500

gggtaaacaa ctggcggtat ggatgcggcg ggaccagaga aaaatcactc agggtcaatg 4560

ccagcgcttc gttaatacag atgtaggtgt tccacagggt agccagcagc atcctgcgat 4620

gcagatccgg aacataatgg tgcagggcgc tgacttccgc gtttccagac tttacgaaac 4680

acggaaaccg aagaccattc atgttgttgc tcaggtcgca gacgttttgc agcagcagtc 4740

gcttcacgtt cgctcgcgta tcggtgattc attctgctaa ccagtaaggc aaccccgcca 4800

gcctagccgg gtcctcaacg acaggagcac gatcatgcgc acccgtgggg ccgccatgcc 4860

ggcgataatg gcctgcttct cgccgaaacg tttggtggcg ggaccagtga cgaaggcttg 4920

agcgagggcg tgcaagattc cgaataccgc aagcgacagg ccgatcatcg tcgcgctcca 4980

gcgaaagcgg tcctcgccga aaatgaccca gagcgctgcc ggcacctgtc ctacgagttg 5040

catgataaag aagacagtca taagtgcggc gacgatagtc atgccccgcg cccaccggaa 5100

ggagctgact gggttgaagg ctctcaaggg catcggtcga gatcccggtg cctaatgagt 5160

gagctaactt acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc 5220

gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg 5280

ccagggtggt ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc ttcaccgcct 5340

ggccctgaga gagttgcagc aagcggtcca cgctggtttg ccccagcagg cgaaaatcct 5400

gtttgatggt ggttaacggc gggatataac atgagctgtc ttcggtatcg tcgtatccca 5460

ctaccgagat gtccgcacca acgcgcagcc cggactcggt aatggcgcgc attgcgccca 5520

gcgccatctg atcgttggca accagcatcg cagtgggaac gatgccctca ttcagcattt 5580

gcatggtttg ttgaaaaccg gacatggcac tccagtcgcc ttcccgttcc gctatcggct 5640

gaatttgatt gcgagtgaga tatttatgcc agccagccag acgcagacgc gccgagacag 5700

aacttaatgg gcccgctaac agcgcgattt gctggtgacc caatgcgacc agatgctcca 5760

cgcccagtcg cgtaccgtct tcatgggaga aaataatact gttgatgggt gtctggtcag 5820

agacatcaag aaataacgcc ggaacattag tgcaggcagc ttccacagca atggcatcct 5880

ggtcatccag cggatagtta atgatcagcc cactgacgcg ttgcgcgaga agattgtgca 5940

ccgccgcttt acaggcttcg acgccgcttc gttctaccat cgacaccacc acgctggcac 6000

ccagttgatc ggcgcgagat ttaatcgccg cgacaatttg cgacggcgcg tgcagggcca 6060

gactggaggt ggcaacgcca atcagcaacg actgtttgcc cgccagttgt tgtgccacgc 6120

ggttgggaat gtaattcagc tccgccatcg ccgcttccac tttttcccgc gttttcgcag 6180

aaacgtggct ggcctggttc accacgcggg aaacggtctg ataagagaca ccggcatact 6240

ctgcgacatc gtataacgtt actggtttca cattcaccac cctgaattga ctctcttccg 6300

ggcgctatca tgccataccg cgaaaggttt tgcgccattc gatggtgtcc gggatctcga 6360

cgctctccct tatgcgactc ctgcattagg aagcagccca gtagtaggtt gaggccgttg 6420

agcaccgccg ccgcaaggaa tggtgcatgc aaggagatgg cgcccaacag tcccccggcc 6480

acggggcctg ccaccatacc cacgccgaaa caagcgctca tgagcccgaa gtggcgagcc 6540

cgatcttccc catcggtgat gtcggcgata taggcgccag caaccgcacc tgtggcgccg 6600

gtgatgccgg ccacgatgcg tccggcgtag aggatcgaga tcgatctc 6648

<210> 3

<211> 411

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> Белок 6-His-S-NLS-Cre

<400> 3

Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser 16

1 5 10 15

Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp 32

20 25 30

Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Gly Arg Ser 48

35 40 45

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ser Pro Glu Phe Glu Leu Pro Lys 64

50 55 60

Lys Lys Arg Lys Val Ser Asn Leu Leu Thr Val His Gln Asn Leu Pro 80

65 70 75 80

Ala Leu Pro Val Asp Ala Thr Ser Asp Glu Val Arg Lys Asn Leu Met 96

85 90 95

Asp Met Phe Arg Asp Arg Gln Ala Phe Ser Glu His Thr Trp Lys Met 112

100 105 110

Leu Leu Ser Val Cys Arg Ser Trp Ala Ala Trp Cys Lys Leu Asn Asn 128

115 120 125

Arg Lys Trp Phe Pro Ala Glu Pro Glu Asp Val Arg Asp Tyr Leu Leu 144

130 135 140

Tyr Leu Gln Ala Arg Gly Leu Ala Val Lys Thr Ile Gln Gln His Leu 160

145 150 155 160

Gly Gln Leu Asn Met Leu His Arg Arg Ser Gly Leu Pro Arg Pro Ser 176

165 170 175

Asp Ser Asn Ala Val Ser Leu Val Met Arg Arg Ile Arg Lys Glu Asn 192

180 185 190

Val Asp Ala Gly Glu Arg Ala Lys Gln Ala Leu Ala Phe Glu Arg Thr 208

195 200 205

Asp Phe Asp Gln Val Arg Ser Leu Met Glu Asn Ser Asp Arg Cys Gln 224

210 215 220

Asp Ile Arg Asn Leu Ala Phe Leu Gly Ile Ala Tyr Asn Thr Leu Leu 240

225  230 235 240

Arg Ile Ala Glu Ile Ala Arg Ile Arg Val Lys Asp Ile Ser Arg Thr 256

245 250 255

Asp Gly Gly Arg Met Leu Ile His Ile Gly Arg Thr Lys Thr Leu Val 272

260 265 270

Ser Thr Ala Gly Val Glu Lys Ala Leu Ser Leu Gly Val Thr Lys Leu 288

275 280 285

Val Glu Arg Trp Ile Ser Val Ser Gly Val Ala Asp Asp Pro Asn Asn 304

290 295 300

Tyr Leu Phe Cys Arg Val Arg Lys Asn Gly Val Ala Ala Pro Ser Ala 320

305 310 315 320

Thr Ser Gln Leu Ser Thr Arg Ala Leu Glu Gly Ile Phe Glu Ala Thr 336

325 330 335

His Arg Leu Ile Tyr Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Gln Arg Tyr Leu 352

340 345 350

Ala Trp Ser Gly His Ser Ala Arg Val Gly Ala Ala Arg Asp Met Ala 368

355 360 365

Arg Ala Gly Val Ser Ile Pro Glu Ile Met Gln Ala Gly Gly Trp Thr 384

370 375 380

Asn Val Asn Ile Val Met Asn Tyr Ile Arg Asn Leu Asp Ser Glu Thr 400

385 390 395 400

Gly Ala Met Val Arg Leu Leu Glu Asp Gly Asp 411

405 410

<210> 4

<211> 4743

<212> ДНК

<213> artificial sequence

<220>

<223> Плазмидная конструкция pBl-Lox-PSMC-Lox-F3

<440> 4

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120

gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180

caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240

ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300

cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360

agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420

cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtacccc 660

acccgggtgg aaaatcgatg ggcccgcggc cgctctagaa gtactctcga gtaaactcct 720

cttcagacct aataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatattaa gggttattga 780

atattatcgg gaattaattc tttggatcca ctagtgtcga ggtcaacggc cgcatgtatg 840

ccctgcgaga acggcgagtc catgtcactc aggaggactt tgagatggca gtagccaagg 900

tataggcctc catctttgtg cctttgccag tggtggctct ggggcagtgg gctagggcat 960

gtgtgtgttc gtaacttaat gttcattctc tctcccaccc ctaggtcatg cagaaggaca 1020

gtgagaaaaa catgtccatc aagaaattat ggaagtgagt ggacagcctt tgtgtgtatc 1080

tctccaataa agctctgtgg gccaagtcct ctaggactcc agtctgttaa tgagggctgt 1140

gctgttcaag gaccaggtcc aggcaccacc aatagacaaa aggatttatt tggaaatttc 1200

caaacctgcc agatgtggca ctcgccaagc cctaggccca ccctcctcac caagctccaa 1260

agggcaacac cagtcctccc agcctcccca ttcaccttac cctggcctcc acatgcacat 1320

accccatacc tcaggccatg ctagagaact ggagtgtccc ctccccggcc caagccgctg 1380

gagaggcagc cctctggcat cccaggagat gatggcggcc agagccgctt gcatagattg 1440

aggaaagaaa agaaggaggc acctaacagg ctccctgaaa acccccaact tacccctgta 1500

caaaaaaagt ggctcccaca tagaaaactt gctcccaaaa tagtgcaaat acccaaagga 1560

aaggaaaaaa ccagcagcaa ggctgggctt gtaggaatgg caaagaactt tggtttagaa 1620

aggctaggaa gagtctgggc tgcacctcct cttcctagcc cagctcccca gagccagctc 1680

tgaccctcgc cccaggggga gtctgtaaac atgcaaaccc agcagccttt ggttcggaaa 1740

tgtcttacaa tgtcaaagca cagcctccag cagtcctact tgggcctgcc tgcagggggg 1800

cagaggaggc atctgctgaa cccaattaaa gccaatgcaa aaagtataag gctttgggga 1860

ccaagcaaca aggaatccta tcactacatt tataagacta aagctggaga gtagagggtg 1920

acagcagaca ctcctcaccc cagcctacgt gtctgcggcc ccagcaagga cccagagggt 1980

ggtctccctc caggctccag ggctgggaag aaagatccct gagcagttag gtcaggcgaa 2040

ttcccagcac ctgttccagt tcctgccttc gctgctgcac ctggagaagg gagaaaccaa 2100

gtggctcagg cctttgctac tcacggccaa aggagggaaa acagggcaga gcctcacctt 2160

ggcaaagatg tgcctgccta ctgcttcctg ggcccagggc tggtggtaga aagcagctcg 2220

tctctccggc cgttgacggt atcgataagc ttgatctaga actagtggat ctaaactcct 2280

cttcagacct aataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatattaa gggttattga 2340

atattatcgg gaattcgata tcaagcttat cgataccgtc gacggtatcg ataagcttga 2400

agttcctata ctatttgaag aataggaact tcggaatagg aacttcaaga tccccctggc 2460

gaaggaattc ctgcagccca tcgaattcct gcagcccggg ggatccacta gttctagagc 2520

ggccgccacc gcggtggagc tccagctttt gttcccttta gtgagggtta attgcgcgct 2580

tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac 2640

acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac 2700

tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc 2760

tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 2820

cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 2880

actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 2940

gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 3000

ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 3060

acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 3120

ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 3180

cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 3240

tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 3300

gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 3360

ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 3420

acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 3480

gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 3540

ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 3600

tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 3660

gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 3720

tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 3780

ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 3840

taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc 3900

cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 3960

gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 4020

gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg 4080

tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 4140

gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 4200

ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 4260

ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 4320

cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata 4380

ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 4440

gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 4500

ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 4560

ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 4620

tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 4680

ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 4740

cac 4743

Свободный текст перечня последовательностей

<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии

гена Российской академии наук (Institute of Gene Biology Russian Academy of

Sciences)

<120> Штамм клеток Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующих

сайт-специфическую рекомбиназу Cre

<160> 4

<210> 1

<211> 5596

<212> ДНК

<213> artificial sequence

<220>

<223> Плазмидная конструкция pET32v11:

102-311 п.н. -> прямая цепь, 210 п.н.; рамка считывания, кодирующая химерный

белок, включающий 6-ти гистидиновый эпитоп, сайт расщепления тромбином, S-эпитоп,

сайты расщепления энтерокиназой и TEV протеазой.

1088-1945 п.н. -> прямая цепь, 858 п.н.; ген устойчивости к ампициллину

(β-лактамаза) 4140-5219 нт -> обратная цепь, 1080 п.н.; ген lac репрессора

(lacI) из E.coli 3137-3328 п.н. -> обратная цепь, 192 п.н.; ген rop из E.coli,

кодирующий белок,

регулирующий копийность плазмиды

<210> 2

<211> 648

<212> ДНК

<213> artificial sequence

<220>

<223> Плазмидная конструкция pET32v11-Cre:

102-1334 п.н. -> прямая цепь, 1233 п.н.; рамка считывания, кодирующая

рекомбинантный белок 6-His-S-NLS-Cre

2140-2997 п.н. -> прямая цепь, 858 п.н.; ген устойчивости к ампициллину

(β-лактамаза)

5192-6271 п.н. -> обратная цепь, 1080 п.н.; ген lac репрессора (lacI) из

E.coli

4189-4380 п.н. -> обратная цепь, 192 п.н.; ген rop из E.coli, кодирующий

белок, регулирующий копийность плазмиды

<210> 3

<211> 411

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> Белок 6-His-S-NLS-Cre:

2-7: 6-гистидиновый эпитоп (HHHHHH)

11-16: Сайт расщепления тромбином (LVPRGS)

19-33: S-эпитоп из панкреатической РНКазы А (KETAAAKFERQHMDS)

39-43: Сайт расщепления энтерокиназы (DDDDK)

49-55: Сайт расщепления TEV протеазы (ENLYFQS)

63-69: Сигнал ядерной локализации из большого Т антигена вируса SV40, NLS

(PKKKRKV)

70-411: аминокислотная последовательность белка Cre без стартового метионина

(2-343 а.о.)

<210> 4

<211> 4743

<212> ДНК

<213> artificial sequence

<220>

<223> Плазмидная конструкция pBl-Lox-PSMC-Lox-F3:

3755-4612 п.н. -> прямая цепь, 858 п.н.; ген устойчивости к ампициллину

(β-лактамаза)

<---

1. Рекомбинантная плазмида pET32v11-Cre, имеющая последовательность SEQ ID NO: 2 и обеспечивающая синтез рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre, имеющего последовательность SEQ ID NO: 3, в клетках Escherichia coli, за счет расположения гена рекомбиназы Cre в 3’-области относительно T7 промотора и lac оператора и в 5’-области относительно T7 терминатора, и полученная путем клонирования кДНК рекомбиназы Cre в вектор pET32v11, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1, таким образом, чтобы кДНК рекомбиназы Cre с N-концевой NLS находилась в одной рамке считывания с 6-гистидиновым и S-эпитопами и аминокислотными последовательностями сайтов расщепления тромбина, энтерокиназы и протеазы TEV.

2. Штамм клеток Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующий рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre, который имеет последовательность SEQ ID NO: 3, и полученный путем трансформации штамма клеток Escherichia coli BL21(DE3) плазмидой по п.1.

3. Способ получения белка 6His-S-NLS-Cre, имеющего последовательность SEQ ID NO: 3, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre по п.2, индукцию синтеза рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre, имеющего последовательность SEQ ID NO: 3, получение клеточного лизата и очистку белка 6His-S-NLS-Cre, имеющего последовательность SEQ ID NO: 3, с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии и катионообменной хроматографии.

4. Способ по п.3, в котором выход каталитически активной рекомбиназы Cre составляет около 17 мкг с 1 мл культуры.