Способ выделения звездчатых клеток печени

Авторы патента:

C12N5/071 - Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них (размножение растений из тканевых культур A01H 4/00)

Владельцы патента RU 2765912:

Государственное автономное учреждение здравоохранения Свердловской области "Центр специализированных видов медицинской помощи "Институт медицинских клеточных технологий" (RU)
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии и медицины, в частности к способу получения звёдчатых клеток печени. Для осуществления способа сначала получают мононуклеарные клетки в растворе ферментов коллагенезы и проназы Е. Для этого клетки выделяют из латеральной доли печени, тщательно ее измельчают и помещают в раствор ферментов, содержащий 3 мг коллагенезы и 3 мг проназы Е. Далее клетки ресуспендируют в растворе гистоденза, после чего центрифугируют для получения суспензии. После чего добавляют в суспезию раствор Гейса и повторно центрифугируют для отмывки от гистоденза. Далее осуществляют удаление супернатанта и ресуспендирование клеток в питательной среде. Настоящее изобретение позволяет получить звёздчатые клетки печени с более высоким уровнем жизнеспособности, а также с большим количеством полученных клеток на единицу массы печени и с меньшим расходом количества ферментов. 2 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для получения зведчатых клеток печени (ЗКП).

Известен способ получения зведчатых клеток печени путем перфузии печени с использованием ферментов: коллагеназа, проназа Е (Isolation and Time Lapse Microscopy of Highly Pure Hepatic Stellate Cells / Matthias Bartneck, Klaudia Theresa Warzecha, Carmen Gabriele Tag, Sibille Sauer-Lehnen, Felix Heymann, Christian Trautwein, Ralf Weiskirchen, Frank Tacke // Analytical Cellular Pathology. - 2015. P. 1-13.). Недостатком данного способа является значительный расход ферментов во время перфузии печени (длительность перфузии по 4,5 минуты со скоростью 6,5 мл в минуту): Проназа Е 14,6 мг и коллагеназа Р 21,9 U (14,6 мг) https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Roche/Bulletin/1/collprobul.pdf).

Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ получения зведчатых клеток печени методом перфузии печени с предварительным внутривенным введением инкапсулированного в липосомы дихлорметилендифосфа. Данный способ позволяет получить значительное количество звездчатых клеток печени с высоким уровнем жизнеспособности (Isolation and culture of hepatic stellate cells from mouse liver / Wenju Chang, Mengxuan Yang, Lujun Song, Kuntang Shen, Hongshan Wang, Xiaodong Gao, Min Li, Weixin Niu, and Xinyu Qin // Acta Biochimica et Biophysica Sinica. - 2014. - Vol. 46, №4. P 291-298).

Недостатком данного способа является значительный расход ферментов во время перфузии печени (длительность перфузии 8 минут со скоростью 6,5 мл в минуту): Проназа Е 26,0 мг и коллагеназа 26,0 мг).

Задачей данного изобретения является расширение арсенала материалов для получения зведчатых клеток печени (ЗКП).

Технический результат, который будет получен от использования изобретения, заключается в получении ЗКП с более высоким уровнем жизнеспособности, а также с большим количеством полученных клеток на единицу массы печени и с меньшим расходом количества ферментов (Проназы Е и коллагеназы).

Технический результат достигается тем, что в способе выделения звездчатых клеток печени, включающим получение мононуклеарных клеток в растворе ферментов коллагенеза и проназы Е, ресуспендирование в растворе гистоденза, последующего центрифугирования для получения суспензии, добавление в сусуспезию раствора Гейса и повторное центрифугирование для отмывки от гистоденза, удаление супернатанта и ресуспендирование клеток в питательной среде, клети выделяют из латеральной доли печени, тщательного ее измельчают и помещают в раствор ферментов, содержащий 3 мг коллагенеза и 3 мг проназы Е.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Эксперименты выполнены на 20 зрелых лабораторных мышах в возрасте 10 недель. Животные содержались в стандартных условиях лабораторного вивария при естественном освещении и сбалансировашшм рационе.

Выделение и идентификация звездчатых клеток печени.

1. Приготовление раствора ферментов: в 10 мл фосфатного буфера (PBS) суспендировали 3 мг коллагеназы, 3 мг проназы Е.

2. Лабораторная мышь наркотизирована, с использованием препарата «Золетил» (10 мг/кг).

3. Оперативным путем вскрыта передняя брюшная стенка и произведено удаление левой латеральной доли печени. Операционная рана ушита.

4. Выделенная доля печени подвергается механическому измельчению с использованием лезвия в стерильной чашке Петри.

5. Тщательно измельченная доля печени помещена в пробирку с ферментами (коллагеназой и проназой Е) в фосфатном буфере (пункт №1).

6. Пробирку с измельченной долей печени и ферментами поместить на водяную баню при 37°С в течение 45 минут, с шейкером со скоростью 1-2 цикла в секунду.

7. Суспензию клеток механически и ферментативно измельченной доли печени профильтровать через фильтры диаметром 70 мкм.

8. По градиенту плотности гистоденза (Histodenz, Sigma) провести разделение клеток. Для этого клетки ресуспендировать в растворе гистоденза (28,7%), суспензию клеток, которую получили, подслаивать к раствору гистоденза (7%). Далее центрифугировать при 600 g 17 мин. ЗКП оказываются в верхнем слое. Клетки собрать в другую пробирку. Суспензию клеток довести до объема 15 мл с помощью раствора Гейса (GBSS, Sigma) и затем цептрифугировать 15 мин. при 800 g с целью отмывки от гистоденза. После удаления супернатанта клетки ресуспендировать в питательной среде.

Выделенные, таким образом, клетки были использованы для дальнейшего иммуногистохимического и иммунофенотипического исследования.

Иммунофенотипирование ЗКП

Полученную суспензию ЗКП иммунофенотипировали непосредственно после выделения методом проточной цитометрии на проточном питометре Navios (Beckman Coulter, США). Производилась оценка эндогенной ретиноидной флуоресценции ЗКП. Для этого использовали моноклональные антитела, которые конъюгированы с флуорохромами (Becton Dickinson, США).

Непосредственно после выделения ЗКП характеризовались положительной флуоресценцией на ретинол и отрицательной на α-SMA-маркер миофибробластов a-гладкомышечный актин. Количество Ретинол положительных клеток составляет 99,4%,

количество SMA+клеток составляет 0,7%. Количество жизнеспособных клеток с положительной флуоресценцией на ретинол составило 98,9%. Количество выделенных ЗКП составило 2,88±0,17 на 1 грамм печени мыши. Достоверность отличий в сравниваемых выборках проведено с применением непараметрического (рангового) метода Манна-Уитни. Статистическая обработка данных проведена с помощью программного пакета SPSS Statistics (версия 17,0).

Примечание: - отличие от прототипа, достоверно с р<0,05

Анализируя данные заявляемого способа, следует отметить, жизнеспособность выделенных звездчатых клеток печени, их количество и чистота достоверно больше, чем в прототипе. При этом расход ферментов коллагеназа и проназа Е меньше, чем в прототипе.

Полученные результаты свидетельствуют, что заявляемый способ (выделение ЗКП без перфузии сосудов печени) эффективнее в плане получения количества звездчатых клеток печени и их жизнеспособности

Способ выделения звездчатых клеток печени, включающий получение мононуклеарных клеток в растворе ферментов коллагеназы и проназы E, ресуспендирование в растворе гистоденза, последующего центрифугирования для получения суспензии, добавление в сусуспезию раствора Гейса и повторное центрифугирование для отмывки от гистоденза, удаление супернатанта и ресуспендирование клеток в питательной среде, отличающийся тем, что выделение клеток осуществляют из латеральной доли печени, тщательного ее измельчения и помещения в раствор ферментов, содержащий 3 мг коллагеназы и 3 мг проназы Е.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к пептиду, содержащему менее чем 15 аминокислот, со способностью индуцировать цитотоксическую T-клетку (ЦТЛ) в присутствии антигенпрезентирующей(-их) клетки(-ок), экспрессирующей(-их) HLA-A*1101. Раскрыты полинуклеотид, кодирующий указанный пептид; композиция, эмульсия, набор, содержащие указанный полипептид; антигенпрезентирующие клетки, содержащие указанный полипептид.

Способ оценки противопсориатического действия наружного препарата на лабораторной модели имиквимод-индуцированного псориаза // 2764549

Настоящее изобретение относится к клеточной биологии и медицине, в частности к дерматологии, и раскрывает способ оценки противопсориатического действия наружного препарата на лабораторной модели имиквимод-индуцированного псориаза. Для осуществления указанного способа проводят иммуногистохимическое исследование биоптата пораженного участка кожи.

Дифференцировка in vitro плюрипотентных стволовых клеток в панкреатические эндодермальные клетки (пэк) и эндокринные клетки // 2764465

Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии и медицины, в частности к способам получения чувствительных к глюкозе в крови бета-клеток, секретирующих инсулин. Для осуществления указанных способов используют эндокринные клетки, секретирующие гормоны, которые одновременно экспрессируют INS и NKX6.1.

Способ выделения фибробластов из стромы роговицы // 2764077

Изобретение относится к клеточной биологии и медицине, в частности к способу выделения фибробластов из стромы роговицы. Для осуществления способа используют стромальные лентикулы, полученные при лазерной коррекции зрения.

Способ изготовления in vitro персонифицированного клеточнозаселенного сосудистого протеза // 2764051

Изобретение относится к медицине, а именно к сосудистой хирургии. Способ изготовления in vitro персонифицированного клеточнозаселенного сосудистого протеза заключается в формировании каркаса протеза из смеси полигидроксибутирата/валерата в концентрации от 3 до 7% (m/v) и с-поликапролактона в концентрации от 9 до 14% (m/v) методом электроспиннинга, покрытии каркаса аутологичным фибрином с дальнейшим заселением внутренней поверхности аутологичными колониеформирующими эндотелиальными клетками, выделенными из периферической крови, в количестве не менее 700000 клеток на 1 см2 и подготовке эндотелиального слоя в условиях пульсирующего проточного биореактора к дальнейшей имплантации в сосудистое русло.

Искусственные антигенпрезентирующие клетки и способы их применения // 2763798

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к искусственной антигенпрезентирующей клетке (aAPC), а также к способу ее получения. Также раскрыто применение вышеуказанной клетки в способе активации антигенспецифической T-клетки, способе индуцирования пролиферации T-клетки, способе экспансии субпопуляции из популяции T-клеток, а также в способе индуцирования T-клеточного ответа на антиген HPV-E7.

Способы выделения, культивирования и генетической инженерии популяций клеток иммунной системы для адоптивной терапии // 2763795

Настоящая группа изобретений относится к клеточной биологии. Предложен способ обогащения CD4+- и CD8+-T-клеток, который предусматривает проведение в замкнутой системе отбора CD4+-клеток и отбора CD8+-клеток из образца, содержащего первичные T-клетки человека, и комбинирование этих клеток в необходимом соотношении, составляющем приблизительно от 10:1 до 1:10.

Генно-клеточный везикулярный терапевтический препарат и способ терапии рассеянного склероза посредством трансплантации генно-клеточного везикулярного терапевтического препарата // 2762855

Настоящее изобретение относится к генетической инженерии и медицине, в частности к генно-клеточному везикулярному терапевтическому препарату для терапии рассеянного склероза и способу терапии рассеянного склероза путём трансплантации указанного препарата посредством однократного внутривенного введения.

Способ повышения количества прегнан х рецептора // 2762853

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу повышения количества прегнан Х рецептора. Способ включает культивирование линии клеток аденокарциномы ободочной кишки человека и предусматривает добавление в среду пероксида водорода до достижения его концентрации в среде 10, 50, 100 мкМ с инкубацией в течение 24 часов.

Способ повышения аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов in vitro // 2762852

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ повышения аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов in vitro у больных с онкологическими заболеваниями включает выделение клеток из венозной крови, их культивирование в условиях CO2-инкубатора при 37°С в питательной среде при концентрации клеток 1⋅106 кл/мл, новым является то, что инкубацию осуществляют в течение 4-х часов в среде, дополнительно содержащей 0,5 М глутаминовой кислоты и 48,5 мМ глицеральдегид-3-фосфата, при этом через 2 часа после начала инкубации в среду вносят раствор аргинина в конечной концентрации 2М.

Способ создания клеточных трансплантатов для лечения сахарного диабета 1-го типа // 2765913

Изобретение относится к области клеточной инженерии, в частности к способу создания клеточных трансплантатов для лечения сахарного диабета 1 типа. Для осуществления указанного способа инсулин продуцирующие клетки и ММСК жировой ткани получают методом ферментативной обработки тканей с использованием раствора коллагеназы 1А в концентрации 0,1% с добавлением раствора Хенкса и среды для культивирования с добавлением 15 мМ HEPES. После чего ММСК жировой ткани высаживают на подложку в количестве 10×103 ЯСК (ядросодержащих клеток)/см2, культивируя с целью наращивания и очистки от нецелевых клеток на протяжении 10-14 дней. Полученные из поджелудочной железы островки центрифугируются на каскаде градиентов плотности с использованием фиколл-урографина для очистки островков от тканей поджелудочной железы и нецелевых клеток. Далее островки дезагрегируют методом ферментирования в растворе 0,25% Трипсина-ЭДТА с последующим центрифугированием с раствором Хенкса с добавлением 15 мМ HEPES. Затем инсулин продуцирующие клетки высаживаются на подложку в концентрации 10×104 ЯСК/см2 и культивируют их на протяжении 10-14 дней с чередованием сред DMEM с содержанием глюкозы 1 г/л в течение 8 дней и содержанием глюкозы 4,5 г/л в течении 2-6 дней. После культивирования инсулин продуцирующие клетки смешиваются с ММСК жировой ткани в соотношении 1:1 и инкапсулируются в альгинат натрия низкой вязкости 1%, полимеризованный добавлением BaCl2 в концентрации 2,2%, с добавлением физраствора - натрия хлорид 0,9%. Настоящее изобретение позволяет снизить иммуногенные свойства инсулин-продуцирующих конструкций, что помогает избежать фиброзирования и реакции «трансплантат против хозяина» при лечении сахарного диабета 1 типа. 1 пр.