Способ создания клеточных трансплантатов для лечения сахарного диабета 1-го типа

Изобретение относится к области клеточной инженерии, в частности к способу создания клеточных трансплантатов для лечения сахарного диабета 1 типа. Для осуществления указанного способа инсулин продуцирующие клетки и ММСК жировой ткани получают методом ферментативной обработки тканей с использованием раствора коллагеназы 1А в концентрации 0,1% с добавлением раствора Хенкса и среды для культивирования с добавлением 15 мМ HEPES. После чего ММСК жировой ткани высаживают на подложку в количестве 10×10³ ЯСК (ядросодержащих клеток)/см², культивируя с целью наращивания и очистки от нецелевых клеток на протяжении 10-14 дней. Полученные из поджелудочной железы островки центрифугируются на каскаде градиентов плотности с использованием фиколл-урографина для очистки островков от тканей поджелудочной железы и нецелевых клеток. Далее островки дезагрегируют методом ферментирования в растворе 0,25% Трипсина-ЭДТА с последующим центрифугированием с раствором Хенкса с добавлением 15 мМ HEPES. Затем инсулин продуцирующие клетки высаживаются на подложку в концентрации 10×10⁴ ЯСК/см² и культивируют их на протяжении 10-14 дней с чередованием сред DMEM с содержанием глюкозы 1 г/л в течение 8 дней и содержанием глюкозы 4,5 г/л в течении 2-6 дней. После культивирования инсулин продуцирующие клетки смешиваются с ММСК жировой ткани в соотношении 1:1 и инкапсулируются в альгинат натрия низкой вязкости 1%, полимеризованный добавлением BaCl2 в концентрации 2,2%, с добавлением физраствора - натрия хлорид 0,9%. Настоящее изобретение позволяет снизить иммуногенные свойства инсулин-продуцирующих конструкций, что помогает избежать фиброзирования и реакции «трансплантат против хозяина» при лечении сахарного диабета 1 типа. 1 пр.

 

Изобретение относится к области клеточной инженерии для лечения и профилактики осложнений сахарного диабета 1 типа (СД 1 типа) в частности, способ создания инкапсулированных инсулин-продуцирующих конструктов, которые могут быть использованы при трансплантации пациентам больным СД 1 типа для лечения инсулиновой недостаточности.

Экспериментальные и клинические исследования по лечению СД 1 типа с применением разного рода трансплантационных материалов проводятся уже на протяжении длительного времени [1, 2]. Однако пересадка поджелудочной железы и ее участков не привели к желаемому результату, так как для успешного и длительного функционирования подобных трансплантатов необходимо применение пожизненной иммуносупрессивной терапии, которая имеет широкий спектр побочных эффектов и тяжело переносится пациентами [3, 4, 5]. В связи с вышесказанным эта операция не получила широкого клинического распространения [5, 6, 7]. В настоящее время активно изучается трансплантация островковых клеток поджелудочной железы, синтезирующих инсулин. Данный подход характеризуется меньшими хирургическими рисками и потенциально высокой эффективностью в отношении снижения уровня глюкозы в периферической крови.

Из уровня техники известен способ создания имплантата для хирургического лечения сахарного диабета 1 типа, который состоит из суспензии клеток поджелудочной железы, помещенной в иммуноизолированное вместилище из пористого никелида титана с порами, через которые осуществляется обмен веществ (RU 2143867, A61F 2/02, опубл. 10.01.2000). Недостатком известного устройства является то, что составляющая импланта из никелида титана может приводить к развитию онкологических заболеваний.

Принципиально похожим изобретением является способ создания имплантата для лечения инсулинзависимого диабета в виде макрогранулы из гидрофильного геля (из агарозы, смеси агарозы и коллагена или агарозы и желатина), внутри которого инкапсулированы клетки (RU 2208636, C12N 11/04 и RU 2208636 C2 RU от 20.07.2003). Недостатком данного способа является его неточность, заключающаяся в образовании множества пустых гранул и их слипании. Данные гранулы, в связи с их хрупкостью, трудно извлечь после трансплантации.

Наиболее близким по своим признакам, принятым за прототип, является способ создания клеточный имплантат для лечения заболеваний печени и поджелудочной железы (RU 137198 U1, C12N 5/071 от 29.12.2012). Имплантат представляет собой биоинженерную конструкцию с подложкой в виде микрочастиц сферической формы из пористого сшитого желатина и аутологичных энтодермальных клеток человека. Имплантат не слипается и легко инъецируется без травмирования тканей. Имплантат крупнопористой структуры и создает оптимальные условия для адгезии и пролиферации клеток, что увеличивает их жизнеспособность. Недостатком данного способа является недостаточно длительная жизнеспособность клеточного компонента.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является снижение иммуногенности аллогенных трансплантируемых клеток и тканей поджелудочной железы, для предотвращения аутоиммунной агрессии реципиента и купирование воспалительных реакций, приводящих к фиброзированию и тромбированию инсулинпродуцирующих конструктов, что приводит к атрофии трансплантата.

Поставленная задача решается за счет того, что в заявляемом способе создания клеточных трансплантатов для лечения сахарного диабета 1-го типа используют со-культивирование инсулин-продуцирующих клеток поджелудочной железы с мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (ММСК), которое позволяет снизить локальную воспалительную реакцию при трансплантации инсулинпродуцирующего конструкта и позволяет сформировать строму, имитирующую клеточное микроокружение. Дополнительным аспектом, обеспечивающим иммуноизоляторные свойства конструкта, является его инкапсуляция в биоинертный материал, обладающий свойствами полупроницаемой мембраны. Таким образом созданные трансплантаты способствуют пролонгированному выживанию клеточного компонента и улучшению функциональной активности β-клеток.

В способе создания клеточных трансплантатов для лечения сахарного диабета 1-го типа, ИПК и ММСК жировой ткани инкапсулируют в иммуноизоляторный материал, согласно изобретению, клеточную составляющую (ИПК и ММСК) получают методом ферментативной обработки тканей поджелудочной железы и жировой ткани, соответственно, с использованием раствора коллагеназы 1А в концентрации 0,1% с добавлением раствора Хенкса и среды для культивирования с добавлением 15 мМ HEPES, после чего:

- ММСК жировой ткани после ферментации и отмывки раствором Хенкса высаживают на подложку в количестве 10×10³ ЯСК (ядросодержащих клеток)/см2, культивируя с целью наращивания и очистки от нецелевых клеток на протяжении 10-14 дней.

- полученные из поджелудочной железы островки после ферментации центрифугируются на каскаде градиентов плотности с использованием фиколл-урографина для очистки островков от тканей поджелудочной железы и нецелевых клеток. Далее островки дезагрегируют методом ферментирования в растворе 0,25% Трипсина-ЭДТА с последующим центрифугированием с раствором Хенкса с добавлением 15 мМ HEPES. Далее ИПК высаживаются на подложку в концентрации 10×10⁴ ЯСК/см2.

ИПК культивируют на протяжении 10-14 дней в два этапа с чередованием сред DMEM: 1. С низким содержанием глюкозы (1 г/л) в течении 8 дней для пролиферации и гомогенизации клеточного пула культуры; 2. С высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) в течении 2-6 дней для индукции инсулинпродуцирующих свойств. Смену сред производят каждые 48 часов, с отмывом культуры раствором Хенкса с добавлением 15 мМ HEPES. При достижении культурой 65% конфлуентности, производят пассаж культуры с применением метода трипсинизации, далее высаживают культуру ИПК на новую подложку в концентрации 10×10⁴ ЯСК/см². После культивирования инсулинпродуцирующие клетки смешиваются с ММСК жировой ткани в соотношении 1:1 и полученную клеточную составляющую инкапсулируют в альгинат натрия 1% вязкости с добавлением физраствора - натрия хлорид 0,9%, полимеризованный добавлением BaCl2 в концентрации 2,2%.

Пример осуществления заявляемого способа.

Полученные инсулин-продуцирующие клетки (ИПК) из биоптатов тканей крыс Wistar промывают PBS (Sigma, США) с 10Х антибиотиком и 1М HEPES (Sigma, США). Далее проводят механическую дезагрегацию и ферментативную обработку тканей. В результате ферментирования в растворе коллагеназы, полученные островки центрифугируют при 300g 10 минут на каскаде градиентов плотности для очищения от тканей и нецелевых клеток. Далее, ИПК из островков дезагрегируют методом ферментирования в растворе 0,25% Трипсина-ЭДТА. После чего добавляют раствор Хэнкса и 15 мМ HEPES и центрифугируют.

Полученные клетки засевают в культуральные флаконы площадью 25 см², с плотностью посева 40×10³ ЯСК/см² для ММСК и 40×10⁴ ЯСК/см² для ИПК в 5 мл соответствующей полной (ростовой) питательной среды и наращивают в CO2 инкубаторе при 5% CO2 и 20%О2. В качестве базовой среды для наращивания β-клеток поджелудочной железы используют RPMI 1640, для ММСКжт и ММСКкм - DMEM/F12, все ростовые среды содержат 10% сыворотки FBS, L-глютамина (200 mM/мл), пенициллина (100 Ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл), все реактивы производства Sigma, США.

После чего, ИПК культивируют на протяжении 10-14 дней с чередованием сред DMEM с низким и высоким содержанием глюкозы: с низким содержанием глюкозы (1 г/л) в течении 8 дней для пролиферации; с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) в течении 2-6 дней для индукции инсулин продуцирующих свойств. Смена сред производятся каждые 48 часов с отмывкой раствором Хенкса с добавлением 15 мМ HEPES.

При достижении культурой 65% конфлюэнтности, произведен пассаж культуры методом трипсинизации на новую подложку в концентрации 40×10⁴ ЯСК/см².

После культивирования ИПК смешиваются с ММСК 1:1, полученную клеточную составляющую инкапсулируют в альгинат натрия низкой вязкости 1% с добавлением физраствора (Натрия хлорид 0,9%) полимеризованный добавлением BaCl2 в концентрации 2,2%.

Процедура выделения ИПК включает следующие шаги:

1. Подготовка животного к забору материала путем усыпления эфирным наркозом в летальной концентрации в эксикаторе.

2. Процедура операции для забора биоматериала заключается во вскрытии брюшной полости в направлении от ануса к диафрагме препаровальными инструментами, для обнаружения поджелудочной железы и общего желчного потока. При пережатии двенадцатиперстной кишки, параллельно линии поджелудочной железы, в желчный пузырь вставляют игла шприца с раствором коллагеназы. Через желчный проток вводят шесть миллилитров раствора коллагеназы. Поджелудочную железу аккуратно удаляют целиком и помещают в 50 мл пробирку.

3. Далее добавляют пять миллилитров солевого раствора в пробирку и помещают на водяную баню на 20 минут (+37°C).

4. Пробирки из водяной бани переносят на лед, с последующим удалением жидкой фазы.

5. Ферментацию останавливают путем добавления 15 мл ледяного раствора 1.1 среды RPMI (+2-4°C).

6. Полученную массу на шейкере встряхивают с интервалом три раза/сек в течение одной минуты, не переворачивая пробирку. Далее пробирку помещают на лед.

7. В новую 50 мл пробирку через сито (500 мкм), смоченное холодной средой RPMI, процеживают ферментированную поджелудочную железу. Остатки поджелудочной железы вымывают из пробирки добавлением 30 мл RPMI, затем опять процеживают через сито. Далее пробирку помещают на лед, инкубируют 10 мин для осаждения на дно клеточной составляющей.

8. Супернатант собирают, оставляя 10-15 мл на дне клеточной суспензии. Затем доводят объем до 30 мл средой RPMI, осторожно перемешивая переворачивание пробирки 2-3 раза.

9. Центрифугируют пробирку на 215 g в течение 2 минут при комнатной температуре.

10. Аккуратно удаляют супернатант, не касаясь клеточного осадка. Затем пробирку с осадком переворачивают на лист бумаги, чтобы остатки среды стекли из пробирки, а клеточная составляющая осталась на дне пробирке. Для создания градиента с Фиколлом, необходимо удалить всю среду из пробирки.

11. Ресуспендируют осадок в 3 мл 25% Фиколла. Затем наслаивают градиент фиколла: поверх 3 мл 23% Фиколла, затем 2 мл 20% Фиколла и 2 мл 11% Фиколла.

12. Центрифугируют на 800 g 10 мин. Островки концентрируются на границе раздела фаз 11% и 20% Фиколла. Часть островков обнаруживают на границе раздела между 20% и 23% Фиколла.

13. Островки собирают с помощью автоматического дозатора. Далее клетки помещают в 50 мл пробирку с 6 мл холодного промывочного раствора. Процедуру промывки проводят 3 раза (центрифугируя на 250 g 1 минуту).

14. Далее центрифугируют островки на 250 g 5 минут. Супернатант удаляют.

15. К осадку добавляют 300 мкл трипсина и ресуспендируют.

16. Инкубируют 5 минут при 37°C на водяной бане.

17. Ресуспендируют островки 10 раз, используя автоматический дозатор.

18. Для остановки процесса ферментации добавляют полную питательную среду RPMI (10% FBS) и центрифугируют в течение 5 мин на 305g для осаждения отдельных клеток.

19. Далее удаляют супернатант и помещают в 1 мл полной питательной среды RPMI.

20. Клетки инкубируют при 37°C, 5% CO2 с содержанием кислорода и CO2 (5% и 5%, соответсвенно).

Для инкапсулирования используют раствор альгината натрия низкой вязкости 1% с добавлением физиологического раствора (Натрия хлорид 0,9%) для полимеризации с добавлением BaCl2 (Sigma, США) в концентрации 2,2%.

Проведение экспериментальной части.

Материалом для исследования служили клеточные культуры, полученные из биоптатов тканей крыс Wistar, умерщвленных путем цервикальной дислокации спинного мозга под наркозом диэтилового эфира (Sigma, США). Все работы проводились в соответствии с правилами работы с лабораторными животными, п. 6 «2». Методические рекомендации по содержанию лабораторных животных в вивариях научно-исследовательских институтов и учебных заведений РД-АПК 3.10.07.02-09» [2] и биоэтическими нормами. Полученные поджелудочные железы и биоптаты жировой ткани промывали PBS (Sigma, США) с 10Х антибиотиком и 1М HEPES (Sigma, США). Далее клеточную составляющую (ИПК и ММСК) получали методом ферментативной обработки тканей поджелудочной железы и жировой ткани, соответственно, с использованием раствора коллагеназы 1А в концентрации 0,1% с добавлением раствора Хенкса и среды для культивирования с добавлением 15 мМ HEPES, после чего:

- ММСК жировой ткани после ферментации и отмывки раствором Хенкса высаживали на подложку в количестве 10×10³ ЯСК (ядросодержащих клеток)/см2, культивируя с целью наращивания и очистки от нецелевых клеток на протяжении 10-14 дней.

- полученные из поджелудочной железы островки после ферментации центрифугировали на каскаде градиентов плотности с использованием фиколл-урографина для очистки островков от тканей поджелудочной железы и нецелевых клеток. Далее островки дезагрегировали методом ферментирования в растворе 0,25% Трипсина-ЭДТА с последующим центрифугированием с раствором Хенкса с добавлением 15 мМ HEPES. Далее ИПК высаживаются на подложку в концентрации 10×10⁴ ЯСК/см2.

Полученную суспензию клеточной массы промывали раствором Хенкса с последующим центрифугированием при 300g, 10 минут. Выделение ММСК из костного мозга крыс проводили вымыванием клеток из костномозгового канала бедренной кости по стандартной методике, с использованием среды DMEM/F12 содержащей 10% сыворотки FBS, L-глютамин (200 mM/мл), пенициллин (100 Ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл). Полученные клетки засевали в культуральные флаконы площадью 25 см², с плотностью посева 40×10³ ЯСК/см² в 5 мл соответствующей полной (ростовой) питательной среды и наращивали в CO2 инкубаторе при 5% CO2 и 20%О2. В качестве базовой среды для наращивания β-клеток поджелудочной железы использовали RPMI 1640, для ММСКжт и ММСКкм - DMEM/F12, все ростовые среды содержали 10% сыворотки FBS, L-глютамин (200 mM/мл), пенициллин (100 Ед/мл), стрептомициа (100 мкг/мл), все реактивы производства Sigma, США.

Для инкапсулирования использовался раствор альгината натрия низкой вязкости 1% с добавлением физраствора (Натрия хлорид 0,9%) и полимеризовали добавлением BaCl2 (Sigma, США) в концентрации 2,2%.

Варианты экспериментальных систем in vitro, отражающих процессы клеточного взаимодействия представлены ниже: клеточная система №1:

инкапсулированные в альгинатные капсулы монокультуры ИПК (иИПК); клеточная система №2:

инкапсулированные в альгинатные капсулы монокультуры ММСКжт (иММСКжт); клеточная система №3:

инкапсулированные в альгинатные капсулы монокультуры ММСКкм (иММСКкм); клеточная система №4:

инкапсулированные в альгинатных капсулах ИПК, сокультивированные с адгезированными на пластике ММСКжт (иИПК + аММСКжт);

клеточная система №5:

инкапсулированные в альгинатных капсулах ИПК, сокультивированные с адгезированными на пластике ММСКкм (иИПК + аММСКкм).

Системы сокультивирования №1-3 использовали в качестве контрольных монокультур для оценки функциональных и молекулярно-генетических изменений в экспериментальных системах сокультивирования №4-5. Все клеточные системы инкубировали в течение 24 и 48 часов. В качестве контроля для оценки уровня относительной экспрессии генов использовали клеточные системы с 3-х часовым периодом инкубации. Культивирование ММСК и ИПК в эксперименте осуществлялось в среде DMEM с L-глютамином, с высоким содержанием глюкозы 4,0 г/л (Sigma, США), все остальные компоненты соответствовали стандартному протоколу.

Исследование уровня относительной экспрессии генов теломеразной обратной транскриптазы (Tert) и проинсулина (Ins) в клетках осуществлялось в условиях нормоксии и гипоксии: культивирование клеток проводилось как в общепринятых (5% CO2 и 21% O2), так и в низкокислородных условиях (5% CO2 и 5% O2), идентичных газовому составу внутренней среды организма. Деполимеризация альгинатного покрытия осуществлялась обработкой раствором, содержащим 55Мм ЭДТА (Sigma, США) с добавлением 10 мМ HEPES с последующим центрифугированием (5 минут 1000 обр/мин). Выделение РНК из культур клеток проводили с использованием реагента ExtractRNA («Евроген», Россия) согласно протоколу производителя. Обратная транскрипция образцов РНК осуществлялась с применением наборов реагентов MMLV RT kit («Евроген», Россия). Для определения уровня экспрессии исследуемых генов проводили количественную ПЦР в режиме реального времени с использованием реагента qPCRmix-HS SYBR («Евроген», Россия) на амплификаторе CFX96 («Bio-Rad», США). В качестве нормировочного гена использовали гипоксантин фосфорибозилтрансферазу-1 (HPRT). Специфичность продуктов амплификации подтверждалась путем анализа кривых температурной диссоциации ампликонов (Melting curve analysis).

В проведенном исследовании оптимизирована методика получения, инкапсуляции, культивирования ИПК поджелудочной железы и их со-культивирование с ММСКжт и ММСКкм крыс в условиях in vitro.

Процедура включала следующие шаги:

1. Подготовка животного к забору материала путем усыпления эфирным наркозом в летальной концентрации в эксикаторе.

2. Процедура операции для забора биоматериала заключалась во вскрытии брюшной полости в направлении от ануса к диафрагме препаровальными инструментами для обнаружения поджелудочной железы и общего желчного потока. При пережатии двенадцатиперстной кишки, параллельно линии поджелудочной железы вставлялась игла шприца в желчный пузырь с раствором коллагеназы. Вводили шесть миллилитров раствора коллагеназы через желчный проток. Поджелудочная железа аккуратно удалялась целиком и помещалась в 50 мл пробирку.

3. Далее добавляли пять миллилитров солевого раствора в пробирку и помещали на водяную баню на 20 минут (+37°C).

4. Пробирки из водяной бани переносили на лед, с последующим удалением жидкой фазы.

5. Ферментацию останавливали путем добавления 15 мл ледяного раствора 1.1 RPMI (+2-4°C).

6. Полученную массу дестабилизировали на шейкере встряхиванием 3 раза/сек в течении 1 минуты, не переворачивая пробирку. Далее пробирку помещали на лед.

7. В новую 50 мл пробирку через сито (500 мкм), смоченное холодной средой RPMI, процеживали ферментированную поджелудочную железу. Остатки поджелудочной железы вымывали из пробирки 30 мл RPMI, затем процеживали через сито. Далее помещали пробирку на лед. Инкубировали 10 мин для осаждения клеточной составляющей на дно.

8. Собирали супернатант, оставляя 10-15 мл на дне. Затем доводили объем до 30 мл средой RPMI, осторожно перевернув 2-3 раза.

9. Центрифугировали пробирку в течение 2 минут на 215 g при комнатной температуре.

10. Аккуратно удаляли супернатант, не разбивая осадок. Затем пробирку с осадком переворачивали на лист бумаги, чтобы остатки среды стекли из пробирки. Важно! Необходимо удалить всю среду, для создания градиента с Фиколлом.

12. Затем ресуспендировали осадок в 3 мл 25% Фиколла. Затем наслаивали градиент фиколла: поверх 3 мл 23% Фиколла, затем 2 мл 20% Фиколла и 2 мл 11% Фиколла.

13. Центрифугировали на 800 g 10 мин. Островки концентрировались на границе раздела фаз 11% и 20% Фиколла. Часть островком обнаруживали на границе раздела между 20% и 23% Фиколла.

14. Островки собирали с помощью дозатора. Далее клетки помещали в 50 мл пробирку с 6 мл холодного промывочного раствора. Процедуру промывки осуществляли 3 раза (центрифугируя на 250 g 1 минуту).

15. Далее островки центрифугировали на 250 g 5 минут. Супернатант удаляли.

16. Добавляли к осадку 300 мкл трипсина и ресуспендировали.

17. Инкубировали 5 минут при 37°C на водяной бане.

18. Ресуспендировали островки 10 раз, используя автоматический дозатор на 1000 мкл.

19. Для остановки процесса ферментации добавляли полную питательную среду RPMI (10%FBS).

20. Центрифугировали в течение 5 мин на 305 g для осаждения отдельных клеток.

21. Далее удаляли супернатант и помещали в 1 мл полной питательной среды RPMI.

22. Клетки инкубировали при 37°C, 5% CO2 с разным содержанием кислорода (5% и 20%).

Получение и культивирование ММСК клеток осуществлялось по стандартным методикам.

Для выделения ММСКжт биоптаты жировой ткани промывали PBS с добавлением HEPES и антибиотика в 10-ти кратном объеме. Дезагрегация тканей проводилась коллагеназой-1А (Sigma, США). Полученную суспензию клеточной массы промывали раствором Хенкса с последующим центрифугированием при 300g 10 минут.

Выделение ММСК из костного мозга крыс проводили вымыванием клеток из костномозгового канала бедренной кости средой DMEM/F12 с 10% добавлением сыворотки FBS и L-глютамина (200 mM/мл), пенициллина (100 Ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл).

Выделенные клетки засевали в культуральные флаконы площадью 25 см² в 5 мл соответствующей ростовой питательной среды и наращивали в CO2 инкубаторе при 5% CO2 и 20%О2. Исследованные в эксперименте условия гипоксии in vitro являются наиболее приближенным состоянием для органов и тканей макроорганизма млекопитающих.

Были созданы тестовые системы сокультивирования (более подробно см. материалы и методы). Для инкапсулирования использовался раствор альгината натрия низкой вязкости 1% с добавлением физраствора (Натрия хлорид 0,9%), полимеризовали добавлением BaCl2 (Sigma, США) в концентрации 2,2%. Деполимеризация альгинатного покрытия для экстракции мРНК осуществлялась обработкой раствором, содержащим 55 Мм ЭДТА с добавлением 10 мМ HEPES с последующим центрифугированием (5 минут 1000 обр/мин).

При изучении жизнеспособности культур иИПК было показано положительное влияние условий сокультивирования в сочетании с гипоксией на такие показатели, как общий процент живых клеток и абсолютный показатель живых клеток. Эти результаты наиболее показательны в случае сокультивирования иИПК с ММСКкм. В контрольных системах (№2-3) в условиях гипоксии выявлено возрастание уровня экспрессии мРНК гена Tert в иММСК (км и жт) с увеличением общего количества клеток. В системах №4-5, вне зависимости от состава газовой среды, регистрировались аналогичные изменения в отношении общего количества клеток и их жизнеспособности аММСК (жт и км) и иИПК.

В проведенном нами исследовании выявлено увеличение относительного уровня экспрессии проинсулина монокультурой инкапсулированных ИПК в высококислородных условиях культивирования (через 24 часа) после стимуляции глюкозой; через 48 часов регистрируется рост уровня инсулина в супернатантах культур. Выявленные нами изменения связаны с накоплением клетками синтезированного инсулина в гранулах и его последующим выходом в окружающую среду. Необходимо отметить, что секреторная активность иИПК зависела от газового состава среды. При сокультивировании с аММСКжт и аММСКкм, инкапсулированные ИПК проявляли более высокую функциональную активность в низкокислородных условиях культивирования. В случае монокультур, в низкокислородных условиях продукция инсулина была ниже, чем в культуре иИПК при нормоксии. Сокультивирование иИПК с ММСК различного происхождения увеличивало секрецию инсулина в 2,5-4 раза по сравнению с базальным уровнем, как в стандартных условиях культивирования, так и в условиях гипоксии in vitro.

Исследование содержания цитокинов в супернатантах полученных культур позволило выявить, что инкапсуляция клеток ИПК приводит к снижению их цитокинпродуципующей активности. Наиболее значимые изменения затрагивали продукцию провоспалительного фактора TNF-a (более чем в 20 раз) в ММСКжт и ММСКкм. Выявлена разнонаправленная динамика изменений содержания про- и антивоспалительных цитокинов - TNF-a и IL-10, в зависимости от газового состава среды и системы культивирования.

Так, уровень TNF-a имеет тенденцию к понижению во всех культурах при высоком уровне кислорода, тогда как при гипоксии его уровень снижался только при сокультивировании с ММСКкм. Тогда как содержание IL-10 в супернатантах исследованных клеточных культур напротив, возрастало за исключением всех монокультур в низкокислородных условиях. В случае сокультивирования при гипоксии, повышенный уровень IL-12 в клеточных супернатантах может свидетельствовать о более высокой чувствительности к изменениям газового состава среды систем №4-5.

В то же время снижение содержания TNF-a, IL-12 и, напротив, повышение уровня продукции IL-10 в КСК №5 при гипоксии может свидетельствовать о преобладании реакций, направленных на подавление воспаления по сравнению с другими системами.

Известно, что IL-5 и IL-13 являются регуляторными цитокинами. Однако, учитывая условия изоляции клеточных систем от естественного микроокружения, сделать однозначных выводов о роли изменения содержания IL-5 и IL-13 в системах культивирования не представляется возможным и требует дополнительных исследований

Таким образом:

1. Инкапсуляция исследованных клеточных культур с использованием альгината натрия низкой вязкости, полимеризуемого двухвалентными ионами бария, позволяет поддерживать стабильный функциональный потенциал и жизнеспособность используемых клеток. Альгинатное покрытие не препятствует циркуляции питательных компонентов, продуктов метаболизма и секретируемых молекул, таких как цитокины, ростовые факторы и гормоны.

2. Сокультивирование (системы №4 и №5) в низкокислородных условиях способствует повышению выживаемости иИПК на 6% и 18%, соответственно. При культивировании в стандартной газовой среде (5%CO2/21%O2) данный эффект отсутствует.

3. Выявлено стимулирующее действие ММСК как жировой ткани, так и костного мозга, на уровень продукции инсулина (содержание инсулина в супернатантах клеточных культур и уровень экспрессии гена Ins) иИПК в условиях гипоксии. Уровень инсулина в супернатантах ко-культур (№4 и №5) в 3 раза превышал аналогичные значения, регистрируемые при исследовании монокультур иИПК.

4. Выявлена тенденция к изменению продукции цитокинов в сторону противовоспалительного профиля при сокультивировании иИПК с ММСК (жт и км), независимо содержания кислорода в газовой среде. Более значимые изменения регистрируются при сокультивировании иИПК с ММСКкм.

5. Выявлена зависимость уровня экспрессии мРНК гена Tert во всех исследуемых клеточных системах от состава газовой среды. В системах сокультивирования установлены разнонаправленные изменения уровня экспрессии мРНК гена Tert в ММСК (жт и км) и иИПК.

Таким образом, в заявляемом способе лечения сахарного диабета с использованием клеточного трансплантата, биотрансплантант содержит инкапсулированные в альгинатное покрытие инсулинпродуцирующие клетки и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) из жировой ткани. Способ создания технологии лечения сахарного диабета заключается в использовании подхода с инкапсулированием клеточной составляющей в иммуноизоляторный материал с пролонгированием жизнеспособности за счет использования клеток ММСК. Изобретение обеспечивает глюкозозависимую продукцию инсулина, приводит к снижению воспалительных процессов, что может позволить улучшить гликемический контроль.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Маслова О.В., Сунцов Ю.И., Болотская Л.Л., Казаков И.В. Эпидемиология сахарного диабета и прогноз его распространенности в Российской Федерации // Сахарный диабет. - 2011. - №1. - С. 15-18.

2. Методические рекомендации по содержанию лабораторных животных в вивариях научно-исследовательских институтов и учебных заведений РД-АПК 3.10.07.02-09 Министерство сельского хозяйства Российской Федерации // Москва, 2009.

3. Ярилин, А.А. Иммунология / А.А. Ярилин. - М: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 752.

4. Krishnan R, Агога RP, Alexander М, et al. Noninvasive evaluation of the vascular response to transplantation of alginate encapsulated islets using the dorsal skin-fold model. // Biomaterials. - 2014. - Vol. 35, (3). - P. 891-898.

5. Barkai U, Weir GC, Colton CK, et al. Enhanced oxygen supply improves islet viability in a new bioartificial pancreas // Cell Transplant. - 2013. - Vol. 22, (8). P. 1463-76.

6. Glenn J.D., Smith M.D., Calabresi P.A., Whartenby K.A. Mesenchymal stem cells differentially modulate effector CD8+T cell subsets and exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis // Stem Cells. - 2014. - Vol. 32, (10). - P. 2744-2755.

7. Lanz T.V., Opitz C.A., Ho P.P., Agrawal A., Lutz C., Weller M., Mellor A.L., Steinman L., Wick W., Platten M. Mouse mesenchymal stem cells suppress antigen-specific TH cell immunity independent of indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) // Stem Cells Dev. - 2010. - Vol. 19, (5). - P. 657-668.

Способ создания клеточных трансплантатов для лечения сахарного диабета 1-го типа, при котором инсулин продуцирующие клетки инкапсулируют в альгинат натрия низкой вязкости 1%, отличающийся тем, что инсулин продуцирующие клетки и ММСК жировой ткани получают методом ферментативной обработки тканей с использованием раствора коллагеназы 1А в концентрации 0,1% с добавлением раствора Хенкса и среды для культивирования с добавлением 15 мМ HEPES, после чего: ММСК жировой ткани высаживают на подложку в количестве 10×10³ ЯСК (ядросодержащих клеток)/см², культивируя с целью наращивания и очистки от нецелевых клеток на протяжении 10-14 дней; полученные из поджелудочной железы островки центрифугируются на каскаде градиентов плотности с использованием фиколл-урографина для очистки островков от тканей поджелудочной железы и нецелевых клеток, далее островки дезагрегируют методом ферментирования в растворе 0,25% Трипсина-ЭДТА с последующим центрифугированием с раствором Хенкса с добавлением 15 мМ HEPES, далее инсулин продуцирующие клетки высаживаются на подложку в концентрации 10×10⁴ ЯСК/см²; инсулин продуцирующие клетки культивируют на протяжении 10-14 дней с чередованием сред DMEM с содержанием глюкозы 1 г/л в течение 8 дней и содержанием глюкозы 4,5 г/л в течение 2-6 дней; после культивирования инсулин продуцирующие клетки смешиваются с ММСК жировой ткани в соотношении 1:1 и инкапсулируются в альгинат натрия низкой вязкости 1%, полимеризованный добавлением BaCl2 в концентрации 2,2%, с добавлением физраствора - натрия хлорид 0,9%.