Способ получения биологических продуктов из молочных зубов

Изобретение относится к области биотехнологии, предполагающей получение биоматериалов для регенеративной медицины, в частности к способу биотехнологической обработки молочных зубов. Для осуществления указанного способа используют естественно выпавшие молочные зубы или молочные зубы, удаленные по ортодонтическим показаниям. Сначала производят транспортировку полученного материала, его отмывку. Затем после первичной трехкратной отмывки зуба стерильным раствором Хенкса с антибиотиками его дополнительно обрабатывают при помощи ультразвуковой ванны с частотой ультразвуковых волн 40 кГц в течение 2 минут, используя стерильный раствор Хенкса с Гентамицином 8 мкг/ мл. Далее после аспирации содержимого канала зуба в шприц его переносят в центрифужную пробирку и инкубируют ее в течение 2 минут в термошейкере при температуре 37°С. Полная питательная среда, в которой ресуспендируют осадок клеток, включает 10% FBS, тестированную на поддержание роста МСК. После помещения клеток в культуральный флакон его помещают на 1 час в термошейкер при температуре +37°С, скорости 50 об/мин. Далее осматривают состояние клеток при помощи инвертированного микроскопа. При культивировании в СО₂-инкубаторе смену среды проводят каждые 5 суток; на 4 пассаже определяют количество и жизнеспособность клеток в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего. После чего проводят криоконсервацию МСК. При этом после аспирации содержимого канала для получения МСК зуб обрабатывают 3% раствором гипохлорита натрия, 3% раствором перекиси водорода, убирают эмаль, цемент, обнажают околопульпарный дентин с помощью алмазного бора с водяным охлаждением. Затем подвергают материал низкочастотной ультразвуковой обработке с частотой 24-40 кГц. Перед деминерализацией проводят контроль состояния поверхностей материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, которое имеет значение от 11 до 17, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, которое имеет значение от 2,6 до 3,3. Деминерализуют материал в 2,4Н-4,8Н растворе соляной кислоты. После деминерализации оценивают ее эффективность, исследуя поверхности материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, которое принимает значение от 0,25 до 0,65, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, которое принимает значение от 0,4 до 0,55. Деминерализованный дентин промывают в апирогенной воде, замораживают при температуре -60°С, лиофилизируют, расфасовывают, упаковывают и стерилизуют радиационным способом. Настоящее изобретение позволяет одновременно получить культуру мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и деминерализованного дентина из молочных зубов. 2 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологий, получению биоматериалов для регенеративной медицины, а именно -одновременному получению культуры мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и деминерализованного дентина из молочных зубов.

Известен способ извлечения пульпы зуба для получения культуры стволовых клеток [1], включающий забор и подготовку материала, его отмывку, ферментативную обработку, выделение суспензии клеток, их идентификацию

Недостатком метода является снижение качества получаемого клеточного материала из-за агрессивности ряда технологий обработки, утилизация ценного ювенильного биоматериала - дентина, который может быть использован для нужд регенеративной медицины.

Известен способ получения фибробластоподобных клеток из пульпы молочных зубов [2], включающий получение, транспортировку, отмывку материала, инкубирование с сывороткой плодов коровы, контроль стерильности забора, ферментативную обработку и забор содержимого канала молочного зуба с центрифугированием и инкубированием при комнатной температуре; инактивацию фермента, удаление надосадочной жидкости, ресуспендирование осадка клеток в полной питательной среде; культивирование в CO₂-инкубаторе со сменой питательных сред, центрифугирование кондиционированной культуральной среды.

Недостатком способа является высокая частота контаминации материала из-за его недостаточной первичной обработки. Инкубирование при комнатной температуре не обеспечивает полноценной ферментативной обработки биоматериала, снижает выход клеток и качество биологических продуктов в целом. При этом способе также происходит утилизация ценного ювенильного биоматериала- дентина, который может быть использован для нужд регенеративной медицины. Данный способ взят нами за прототип.

Целью изобретения является разработка технологии

одновременного получения культуры мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и деминерализованного дентина из молочных зубов.

Эта цель достигается тем, что из молочных зубов получают МСК и деминерализованный дентин, при этом используют также молочные зубы, удаленные по ортодонтическим показаниям в условиях стоматологических учреждений при добровольном согласии родителей детей; после первичной трехкратной отмывки зуба стерильным раствором Хенкса с антибиотиками его дополнительно обрабатывают при помощи ультразвуковой ванны с частотой ультразвуковых волн 40 кГц в течение 2 минут, используя стерильный раствор Хенкса с Гентамицином 8 мкг/ мл; после аспирации содержимого канала зуба в шприц с ферментом его переносят в центрифужную пробирку и инкубируют ее в течение 2 минут в термошейкере при температуре 37°; полная питательная среда, в которой ресуспендируют осадок клеток, включает 10% FBS, тестированную на поддержание роста МСК; после помещения клеток в культуральный флакон его помещают на 1 час в термошейкер при температуре +37°С, скорости 50 об/ мин; осматривают состояние клеток при помощи инвертированного микроскопа; при культивировании в CO₂-инкубаторе смену среды проводят каждые 5 суток; на 4 пассаже определяют количество и жизнеспособность клеток в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего; проводят криоконсервацию МСК; после аспирации содержимого канала для получения МСК зуб обрабатывают 3% раствором гипохлорита натрия, 3% раствором перекиси водорода; убирают эмаль, цемент, обнажают околопульпарный дентин с помощью алмазного бора с водяным охлаждением; подвергают материал низкочастотной ультразвуковой обработке с частотой 24-40 кГц; перед деминерализацией проводят контроль состояния поверхностей материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1, которое имеет значение от 11 до 17, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида 1 1660 см-1, которое имеет значение от 2,6 до 3,3; деминерализуют материал в 2,4Н-4,8Н растворе соляной кислоты; после деминерализации оценивают ее эффективность, исследуя поверхности материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида 1 1660 см-1, которое принимает значение от 0,25 до 0,65, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида 1 1660 см-1, которое принимает значение от 0,4 до 0,55; деминерализованный дентин промывают в апирогенной воде, замораживают при температуре -60°С, лиофилизируют, расфасовывают, упаковывают и стерилизуют радиационным способом.

Предлагаемый способ одновременного безотходного получения МСК и деминерализованного дентина значительно оптимизирует производственный цикл, снижает время, расход сырья и трудозатраты, позволяя получить продукты для регенеративной медицины, в частности обладающие оптимальными остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами для успешной регенерации костной ткани.

Использование помимо естественно выпавших молочных зубов, зубы у детей, удаленные по ортодонтическим показаниям расширяет возможности получения биоматериала.

Дополнительная обработка зуба при помощи ультразвуковой ванны значительно снижает количество случаев контаминации материала.

Инкубирование содержимого канала зуба в шприце с ферментом в центрифужной пробирке в течение 2 минут в термошейкере при температуре 37° повышает качество ферментной обработки, выход клеток и качество получаемых биопродуктов в целом.

Низкочастотная ультразвуковая обработка с частотой 24-40 кГц позволяет выполнить первичную стерилизацию будущих биоматериалов. Этапный контроль эффективности деминерализации материала с помощью оптического метода, спектральная оценка поверхностей дентина до и после деминерализации стандартизирует характеристики получаемого продукта.

Способ реализуется следующим образом. Забор удаленных по ортодонтическим показаниям или естественно выпавших молочных зубов проводят как в домашних условиях, так и в условиях стоматологических учреждений при добровольном согласии родителей детей. Молочный зуб помещают в транспортировочный флакон со стерильным раствором Хенкса с антибиотиком.

После доставки в лабораторию зуб изымают из флакона, переносят в культуральную чашку Петри, проводят первичную отмывку биоматериала сначала трижды стерильным раствором Хенкса с антибиотиками, затем при помощи ультразвуковой ванны с частотой ультразвуковых волн 40 кГц в течение 2 минут, используя стерильный раствор Хенкса с Гентамицином 8 мкг/ мл.

После отмывки зуб переносят при помощи стерильных инструментов в стерильную пробирку с раствором Хенкса и помещают в медицинский холодильник на 24 часа. Параллельно исследуют качество забора биоматериала на стерильность, для чего в транспортировочный флакон с раствором вносят 10 мкл эмбриональной телячьей сыворотки, герметично закрывают флакон крышкой и переносят ее в термостат на 24 часа при температуре 37°.

При отсутствии признаков контаминации в инсулиновый шприц набирают 0,2 мл 0,1% коллагеназы из панкреаса краба ООО «БиолоТ». Иглу шприца вводят в канал молочного зуба и аспирируют его содержимое в шприц; переносят полученный материал в центрифужную пробирку и инкубируют ее в течение 2 мин в термошейкере при температуре 37°.

Инактивируют действие фермента, добавляя в пробирку 2 мл стерильного 0,02% раствора Версена и 1 мл 10% полной ростовой среды α-МЕМ с глютамином; центрифугируют в холодовой центрифуге при температуре+4°С, скорости вращения 1200 об./мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость утилизируют; осадок клеток ресуспендируют в полной питательной среде, включающей αМЕМ с глютамином, 10% FBS, тестированную на поддержание роста МСК, 8 мкг/мл гентамицина. Подсчитывают количество выделенных жизнеспособных клеток в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего.

Высевают клетки в дозе 1×10 жизнеспособных кл./см² в культуральный флакон с аналогичной полной питательной средой. Для равномерного распределения клеток по дну культурального пластика флакон помещают на 1 час в термошейкер, например, ES-20 Biosan Латвия, при температуре +37°С, скорости вращения 50 об/ мин. Осматривают состояние клеток при помощи инвертированного микроскопа.

Культивирование проводят в СО₂-инкубаторе при температуре +37°С, 5% СО₂ и постоянной влажности. Смену среды проводят каждые 5 суток, при этом кондиционированную культуральную среду из флакона с клетками полностью отбирают пипеткой; центрифугируют ее в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1500 об./мин в течение 10 минут, после чего возвращают в культуральный флакон и добавляют свежую среду в соотношении 1:1. По достижении 80% конфлюентности клеточного монослоя проводят пересев клеток из расчета 1:2. На 4 пассаже при получении в достаточном количестве клеток определяют их количество и жизнеспособность в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего; проводят криоконсервацию МСК.

После аспирации содержимого канала для получения МСК зуб обрабатывают 3% раствором гипохлорита натрия, 3% раствором перекиси водорода. Убирают эмаль, цемент, обнажают околопульпарный дентин с помощью алмазного бора с водяным охлаждением. Подвергают материал низкочастотной ультразвуковой обработке с частотой 24-40 кГц.

Перед деминерализацией проводят контроль состояния поверхностей материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1, которое имеет значение от 11 до 17, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1, которое имеет значение от 2,6 до 3,3. Деминерализуют материал в 2,4Н-4,8Н растворе соляной кислоты. После деминерализации оценивают ее эффективность, исследуя поверхности материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1, которое принимает значение от 0,25 до 0,65, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида 1 1660 см-1, которое принимает значение от 0,4 до 0,55. Деминерализованный дентин промывают в апирогенной воде, замораживают при температуре -60°С, лиофилизируют, расфасовывают, упаковывают и стерилизуют радиационным способом.

Способ иллюстрируется клиническими примерами.

Пример 1. У ребенка П, 9 лет выпал молочный зуб. Мама ребенка переложила его в транспортный флакон и доставила его в биотехнологический центр. По предложенному способу была получена культура МСК и деминерализованный дентин. Клетки прижизненно окрашивали антителами к поверхностным маркерам CD90, CD105, CD73, CD10, CD44, CD45, CD34, CD117, CD14. Для каждой из исследуемых популяций клеток определяли количество окрашенных клеток и среднюю интенсивность флюоресценции. Клетки соответствовали иммунофенотипу МСК.

Характеристика полученных линий МСК: Клеток имели высокий индекс адгезии (90±0,2% - 96±0,5%), относительно одинаковый индекс пролиферации (1,8±0,3), процент жизнеспособных клеток в культуре был от 90 до 97,8%. Клетки использовали для создания клеточно- тканевых трансплантатов.

Для получения дентина материал подвергали низкочастотной ультразвуковой обработке с частотой 24 кГц. Перед деминерализацией отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1 имело значение 11, отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1 имело значение 2,6. После деминерализации в 2,4Н растворе соляной кислоты отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1 имело значение 0,25; отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида 1 1660 см-1 0,4. Деминерализованный дентин использовали для выполнения костной пластики в стоматологии.

Пример 2. У ребенка Л, 10 лет в стоматологической клинике по ортодонтическим показаниям был удален молочный зуб. Врач переложил его в транспортный флакон и служба доставила его в биотехнологический центр. По предложенному способу была получена культура МСК и деминерализованный дентин.

Клетки прижизненно окрашивали антителами к поверхностным маркерам CD90, CD105, CD73, CD10, CD44, CD45, CD34, CD117, CD14. Для каждой из исследуемых популяций клеток определяли количество окрашенных клеток и среднюю интенсивность флюоресценции. Клетки соответствовали иммунофенотипу МСК. Характеристика полученных линий МСК: Клеток имели высокий индекс адгезии (90 ±0,2% - 96 ±0,5%), относительно одинаковый индекс пролиферации (1,8 ±0,3), процент жизнеспособных клеток в культуре был от 90 до 97,8%>. Клетки использовали для создания клеточно-тканевых трансплантатов.

Для получения дентина материал подвергали низкочастотной ультразвуковой обработке с частотой 40 кГц. Перед деминерализацией отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1 имело значение 17, отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1 имело значение 3,3.

После деминерализации в 4,8Н растворе соляной кислоты отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1 имело значение 0,65; отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида 1 1660 см-1 0,55. Деминерализованный дентин использовали для выполнения костной пластики в стоматологии.

Способ может использоваться в специализированных биотехнологических центрах для получения культур клеток, биоматериалов для доклинической и клинической практики в области регенеративной медицины.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Патент RU 2679082 С1 от 05.02.2019 «Способ извлечения пульпы зуба для получения культуры стволовых клеток »

2. Патент RU 2726554 С1 от 27.02.2020 « Способ получения и культивирования фибробластоаподобных клеток из пульпы молочных зубов».

Способ биотехнологической обработки молочных зубов, включающий использование естественно выпавших молочных зубов, транспортировку, отмывку материала, его инкубирование, контроль стерильности, ферментативную обработку и забор содержимого канала молочного зуба с центрифугированием и инкубированием; инактивацию фермента, удаление надосадочной жидкости, ресуспендирование осадка клеток в полной питательной среде α-МЕМ с глютамином, включающей 10% FBS, 8 мкг/мл гентамицина; культивирование в CO₂-инкубаторе с последовательной сменой питательных сред, центрифугирование кондиционированной культуральной среды и получение культуры клеток; отличающийся тем, что из молочных зубов получают МСК и деминерализованный дентин, при этом используют также молочные зубы, удаленные по ортодонтическим показаниям в условиях стоматологических учреждений при добровольном согласии родителей детей; после первичной трехкратной отмывки зуба стерильным раствором Хенкса с антибиотиками его дополнительно обрабатывают при помощи ультразвуковой ванны с частотой ультразвуковых волн 40 кГц в течение 2 минут, используя стерильный раствор Хенкса с Гентамицином 8 мкг/ мл; после аспирации содержимого канала зуба в шприц его переносят в центрифужную пробирку и инкубируют ее в течение 2 минут в термошейкере при температуре 37°С; полная питательная среда, в которой ресуспендируют осадок клеток, включает 10% FBS, тестированную на поддержание роста МСК; после помещения клеток в культуральный флакон его помещают на 1 час в термошейкер при температуре +37°С, скорости 50 об/ мин; осматривают состояние клеток при помощи инвертированного микроскопа; при культивировании в СО₂-инкубаторе смену среды проводят каждые 5 суток; на 4 пассаже определяют количество и жизнеспособность клеток в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего; проводят криоконсервацию МСК; после аспирации содержимого канала для получения МСК зуб обрабатывают 3% раствором гипохлорита натрия, 3% раствором перекиси водорода; убирают эмаль, цемент, обнажают околопульпарный дентин с помощью алмазного бора с водяным охлаждением; подвергают материал низкочастотной ультразвуковой обработке с частотой 24-40 кГц; перед деминерализацией проводят контроль состояния поверхностей материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, которое имеет значение от 11 до 17, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, которое имеет значение от 2,6 до 3,3; деминерализуют материал в 2,4Н-4,8Н растворе соляной кислоты; после деминерализации оценивают ее эффективность, исследуя поверхности материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, которое принимает значение от 0,25 до 0,65, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см^-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см^-1, которое принимает значение от 0,4 до 0,55; деминерализованный дентин промывают в апирогенной воде, замораживают при температуре -60°С, лиофилизируют, расфасовывают, упаковывают и стерилизуют радиационным способом.