Способ получения иммобилизованных на коллагеновом носителе антибиотиков

Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к способу получения иммобилизованных на коллагеновом носителе антибиотиков, характеризующемуся тем, что предварительно зачищенные, измельченные на полосы шириной 2-4 см и промытые в мыльном растворе шкуры прудовых рыб из ряда: карп, толстолобик, белый амур и сазан, замачивают в растворе хлорида натрия с массовой концентрацией 3% в течение 10 мин, затем обезжиривают в растворе с массовой концентрацией 0,1% к массе сырья ферментного комплекса липоризина, содержащего 1 часть протеазы и 2 части липазы, в течение 30 мин, а затем промывают в дистиллированной воде до отсутствия остатков ферментного комплекса, далее промытые шкуры замачивают в перекоксидно-щелочном растворе, состоящем из смеси пероксида водорода с массовой концентрацией 3% и гидроксида натрия с массовой концентрацией 2%, взятых в соотношении 6:4, и выдерживают в течение 2-3 ч при температуре 20-25°С, обработанные таким образом шкуры промывают в дистиллированной воде в течение 20 мин, затем шкуры заливают раствором уксусной кислоты с массовой концентрацией 1,5 – 6%, или раствором аскорбиновой кислоты с массовой концентрацией 7%, или лимонной кислоты с массовой концентрацией 1,5%, или янтарной кислоты с массовой концентрацией 1,5%, или молочной кислоты с массовой концентрацией 1,5% и выдерживают в течение 5 сут, полученную массу нейтрализуют раствором гидроксида натрия до рН 5,5-6,5, затем гомогенизируют, а далее в гомогенную массу вводят антибиотики широкого действия в дозировке 1,5-2,5 мг/см³, затем полученную массу разливают в виде пленки и отправляют на сублимационную сушку, которую проводят в вакуум-сублимационной машине при вакууме от 6·10^-1 мбар до 8·10^-1 мбар в течение 10-15 ч, высушенные коллагеновые материалы нарезаются на пластинки и герметично упаковываются. Настоящее изобретение обеспечивает расширение спектра возможного действия на микроорганизмы, снижение отрицательного действия высоких концентраций уксусной кислоты и расширение области возможного применения коллагеновой субстанции в качестве асептического средства или материала. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 пр.

 

Изобретение относится к медицинской и косметической промышленности и предназначено для лечения ран путем применения иммобилизованных на коллагеновом носителе антибиотиков.

Известен способ получения иммобилизованных антибиотиков, включающий основу, представляющую собой фосфат или гидроксифосфат кальция, или их смесь, а также привитую к поверхности группу –Р–О– и антибиотик, содержащий непротонированные амино- или спиртовые группы с содержанием последнего 0,5-2,0 массовых процентов от основы. Способ включает отработку фосфата (гироксифосфата) сшивающим агентом с последующим взаимодействием с антибиотиком, содержащим непротонированные амино- или спиртовые группы, а в качестве сшивающего агента используется пентахлорид фосфата в количестве 0,5-7,0 мас. % от количества фосфата или гидрофосфата кальция [заявка № 2006102533, дата публикации заявки: 10.08.2007].

К недостаткам изобретения относятся: использование искусственного носителя в качестве основы; необходимость сшивки основы; использование химических реагентов; многооперационность (трудоемкость) технологии; поверхностное воздействие, а также отсутствие биосовместимости основы с тканями человека.

Также известен способ получения системы-носителя для направленной доставки антибиотиков пенициллинового и антрациклинового ряда с использованием нанопорошка, обладающего магнитными свойствами благодаря тому, что состоит из аморфного нанопорошка диоксида кремния, допированного диоксидом марганца, которое проводят методом испарения импульсным электронным пучком в газе низкого давления, обладающий высокой пористостью и площадью, удельной активностью и биосовместимостью, что позволяет контролировать процесс доставки лекарственного вещества [Патент РФ № 2708894, дата подачи заявки: 27.12.2018, опубликовано: 12.12.2019 Бюл. № 35].

К недостаткам способа следует отнести сложность и высокую стоимость конечного продукта, ограниченность области применения.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения коллагеновой основы с асептическими свойствами [Патент № 2739396, Бюл. № 36 от 23.12.20 г.] из шкур рыб внутренних водоемов и расширяющий ассортимент коллагеновых субстанций для медицины и косметологии.

К основным недостаткам способа относятся: высокая концентрация уксусной кислоты, создающей низкий рН коллагеновой массы, достаточно узкий перечень микроорганизмов, подвергшихся действию иммобилизованных ионов серебра (Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli, Klebsiella spp., Bordetella pertussis, Haemophilus influenza, Enterobacter spp.).

Технической задачей изобретения является: расширение спектра возможного действия на микроорганизмы; снижение отрицательного действия высоких концентраций уксусной кислоты и расширение областей возможного применения коллагеновой субстанции в качестве асептического средства или материала.

Рыбный коллаген имеет ряд преимуществ по сравнению с коллагеном наземных животных:

- гипоаллергенность;

- безопасность;

- упрощенная пространственная структура (всего 3 уровня, напоминающая тропоколлаген);

- растворимость (в процессе выделения коллагена получают гидрат, а не гидролизат, что обеспечивает нативную структуру молекулы и свойства вне организма, что особенно важно для медицины и косметологии);

- совместимость по геометрическим размерам с порами кожи человека и возможность проникновения в дермальные слои;

- стимуляция синтеза собственного коллагена;

- возможность адресной доставки;

- сырьевая доступность;

- низкая стоимость (шкуры рыб – отход разделки рыбы – бросовый материал);

- снижение напряженности окружающей среды от производства рыбы и рыбных продуктов;

- возможность расширить и разнообразить терапевтические и косметические средства и материалы, создание новых средств по уходу послеоперационных и хронических больных.

Коллагеновая молекула уникальна по своему химическому составу. Основу структурной организации коллагенового волокна составляют ориентированные в продольном и поперечном направлении, сдвинутые на четверть ступенчато расположенные параллельные ряды тропоколлагеновых молекул (фиг. 1), что обусловливает поперечную исчерченность фибрилл с периодом от 60 до 70 нм. Варьирование периода обусловлено тем, что коллаген — не индивидуальный белок, а семейство сходных белков с некоторыми структурными отличиями, зависящими от их анатомической функции и вида организма.

На фиг. 1 показаны тропоколлагеновые молекулы:

а — структура коллагена (по Ричу и Крику);

б — различные уровни структурной организации коллагена (по Кону):

1 — третичная структура;

2 — молекула тропоколлагена;

3 — коллагеновое волокно.

Установлено, что N- и C-концевые участки, не принимая участия в образовании тройной спирали, не имеют регулярного строения и содержат окисленные остатки лизина, которые, взаимодействуя друг с другом, образуют межмолекулярные поперечные сшивки.

Особенности строения наделяют коллагеновую молекулу высокой сорбционной емкостью за счет формирования большого числа водородных связей и гидрофобных взаимодействий. Именно это обстоятельство дает возможность получать иммобилизованные формы антибиотиков.

На фиг.2 приведена структурная формула молекулы гентамицина. На примере гентамицина видно, что антибиотик имеет соответствующие функциональные группы, способствующие образованию центров иммобилизации.

Для решения поставленной технической задачи предложен способ получения иммобилизованных на коллагеновом носителе антибиотиков, характеризующийся тем, что предварительно зачищенные, измельченные на полосы шириной 2-4 см и промытые в мыльном растворе шкуры прудовых рыб (карпа, толстолобика, белого амура и сазана), замачивают в растворе хлорида натрия с массовой концентрацией 3 % в течение 10 минут, затем обезжиривают в растворе с массовой концентрацией 0,1% к массе сырья ферментного комплекса липоризина, содержащего 1 часть протеазы и 2 части липазы, в течение 30 минут, а затем промывают в дистиллированной воде до отсутствия остатков ферментного комплекса, далее промытые шкуры замачивают в перекоксидно-щелочном растворе, состоящем из смеси пероксида водорода с массовой концентрацией 3 % и гидроксида натрия с массовой концентрацией 2 %, взятых в соотношении 6:4, и выдерживают в течение 2-3 часов при температуре 20-25^о С, обработанные таким образом шкуры промывают в дистиллированной воде в течение 20 мин, затем шкуры заливают раствором уксусной кислоты с массовой концентрацией 1,5 – 6 %, или раствором аскорбиновой кислоты с массовой концентрацией 7%, или лимонной кислоты с массовой концентрацией 1,5%, или янтарной кислоты с массовой концентрацией 1,5%, или молочной кислоты с массовой концентрацией 1,5% и выдерживают в течение 5 суток, полученную массу нейтрализуют раствором гидроксида натрия до рН 5,5-6,5, затем гомогенизируют, а далее в гомогенную массу вводят антибиотики широкого действия (например, полимексин В или гентамицин), которые хорошо изучены при действии на большинство грамотрицательных бактерий, а также на такие микроорганизмы как Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli, Klebsiella spp., Bordetella pertussis, Haemophilus influenza, Enterobacter spp.), антибиотики вводятся в коллагеновый раствор в дозировке 1,5-2,5 мг/см³, затем полученная масса отправляется на сублимационную сушку, которую проводят в вакуум-сублимационной машине при вакууме от 6·10 ^-1 мбар до 8·10 ^-1 мбар в течение 10-15 часов, либо на формирование коллагеновой пленки, которую сушат при температуре плюс 50°С до влажности 5-10%, высушенные коллагеновые материалы нарезаются на пластинки и герметично упаковываются.

Способ получения иммобилизованных на коллагеновом носителе антибиотиков осуществляется следующим образом.

Шкуры, полученные при разделке пресноводных рыб (карп, толстолобик, сазан, белый амур), зачищают от жира, прирезей мышечной ткани и механических загрязнений, измельчают на полосы шириной 2-4 см и промывают в мыльном растворе в течение 30 мин.

Затем с целью удаления остатков моющего средства шкуры промываются проточной водой.

Промытые шкуры замачивают в растворе хлорида натрия с массовой концентрацией 3 % в течение 10 минут, обезжиривают в растворе с массовой концентрацией 0,1% к массе сырья ферментного комплекса липоризина, содержащего 1 часть протеазы и 2 части липазы, в течение 30 минут, а затем промывают в дистиллированной воде до отсутствия остатков ферментного комплекса.

Далее промытые шкуры замачивают в перекоксидно-щелочном растворе, состоящем из смеси пероксида водорода с массовой концентрацией 3 % и гидроксида натрия с массовой концентрацией 2 %, взятых в соотношении 6:4, и выдерживают в течение 2-3 часов при температуре 20-25^оС, обработанные таким образом шкуры промывают в дистиллированной воде в течение 20 мин.

Затем шкуры заливают раствором уксусной кислоты с концентрацией 1,5 – 6 % и выдерживают в течение 5 суток.

Полученную массу нейтрализуют раствором гидроксида натрия до рН 5,5 – 6,5 и гомогенизируют до однородного состояния.

В гомогенную массу вводят антибиотики широкого действия (например, полимексин В или гентамицин), которые хорошо изучены при действии на большинство грамотрицательных бактерий, а также на такие микроорганизмы как: Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli, Klebsiella spp., Bordetella pertussis, Haemophilus influenza, Enterobacter spp.) в дозировке 1,5-2,5 мг/см³.

Полученную массу разливают слоем до 0,5 см и замораживают в течение 1,5-2 часов при t= -40°C.; сушку осуществляют в вакуум- сублимационной сушилке при вакууме от 6·10^-1 до 8·10^-1 мбар .

Либо массу разливают слоем до 0,5 см и сушат в виде пленки при температуре 50°С и скорости движения воздуха 2-5 м/с до влажности материала 5-10%.

Высушенные коллагеновые материалы нарезают на пластинки и герметично упаковывают.

Пример 1.

Шкуры, полученные при разделке пресноводных рыб (карп, толстолобик, сазан, белый амур), зачищают от жира, прирезей мышечной ткани и механических загрязнений, измельчают на полосы шириной 2-4 см и промывают в мыльном растворе в течение 30 мин.

Затем с целью удаления остатков моющего средства шкуры промываются проточной водой.

Промытые шкуры замачивают в растворе хлорида натрия с массовой концентрацией 3 % в течение 10 минут, обезжиривают в растворе с массовой концентрацией 0,1% к массе сырья ферментного комплекса липоризина, содержащего 1 часть протеазы и 2 части липазы, в течение 30 минут, а затем промывают в дистиллированной воде до отсутствия остатков ферментного комплекса.

Далее промытые шкуры замачивают в перекоксидно-щелочном растворе, состоящем из смеси пероксида водорода с массовой концентрацией 3 % и гидроксида натрия с массовой концентрацией 2 %, взятых в соотношении 6:4, и выдерживают в течение 2-3 часов при температуре 20-25оС, обработанные таким образом шкуры промывают в дистиллированной воде в течение 20 мин.

Затем шкуры заливают раствором уксусной кислоты с концентрацией 1,5 – 6 % и выдерживают в течение 5 суток.

Полученную массу нейтрализуют раствором гидроксида натрия до рН 5,5 – 6,5 и гомогенизируют до однородного состояния.

В гомогенную массу вводят антибиотик широкого действия полимексин В в дозировке 1,5-2,5 мг/см³.

Полученную массу разливают слоем до 0,5 см и замораживают в течение 1,5-2 часов при t = -40°C.; сушку осуществляют в вакуум (дефис) сублимационной сушилке при вакууме от 6·10^-1 до 8·10^-1 мбар .

Высушенные коллагеновые материалы нарезают на пластинки и герметично упаковывают.

Пример 2.

Шкуры, полученные при разделке пресноводных рыб (карп, толстолобик, сазан, белый амур), зачищают от жира, прирезей мышечной ткани и механических загрязнений, измельчают на полосы шириной 2-4 см и промывают в мыльном растворе в течение 30 мин.

Затем с целью удаления остатков моющего средства шкуры промываются проточной водой.

Промытые шкуры замачивают в растворе хлорида натрия с массовой концентрацией 3 % в течение 10 минут, обезжиривают в растворе с массовой концентрацией 0,1% к массе сырья ферментного комплекса липоризина, содержащего 1 часть протеазы и 2 части липазы, в течение 30 минут, а затем промывают в дистиллированной воде до отсутствия остатков ферментного комплекса.

Далее промытые шкуры замачивают в перекоксидно-щелочном растворе, состоящем из смеси пероксида водорода с массовой концентрацией 3 % и гидроксида натрия с массовой концентрацией 2 %, взятых в соотношении 6:4, и выдерживают в течение 2-3 часов при температуре 20-25оС, обработанные таким образом шкуры промывают в дистиллированной воде в течение 20 мин.

Затем шкуры заливают раствором уксусной кислоты с концентрацией 1,5 – 6 % и выдерживают в течение 5 суток.

Полученную массу нейтрализуют раствором гидроксида натрия до рН 5,5 – 6,5 и гомогенизируют до однородного состояния.

В гомогенную массу вводят антибиотик широкого действия гентамицин в дозировке 1,5-2,5 мг/см³.

Полученную массу разливают слоем до 0,5 см и сушат в виде пленки при температуре 50°С и скорости движения воздуха 2-5 м/с до влажности материала 5-10%.

Высушенные коллагеновые материалы нарезают на пластинки и герметично упаковывают.

Пример 3.

Шкуры, полученные при разделке пресноводных рыб (карп, толстолобик, сазан, белый амур), зачищают от жира, прирезей мышечной ткани и механических загрязнений, измельчают на полосы шириной 2-4 см и промывают в мыльном растворе в течение 30 мин.

Затем с целью удаления остатков моющего средства шкуры промываются проточной водой.

Промытые шкуры замачивают в растворе хлорида натрия с массовой концентрацией 3 % в течение 10 минут, обезжиривают в растворе с массовой концентрацией 0,1% к массе сырья ферментного комплекса липоризина, содержащего 1 часть протеазы и 2 части липазы, в течение 30 минут, а затем промывают в дистиллированной воде до отсутствия остатков ферментного комплекса.

Далее промытые шкуры замачивают в перекоксидно-щелочном растворе, состоящем из смеси пероксида водорода с массовой концентрацией 3 % и гидроксида натрия с массовой концентрацией 2 %, взятых в соотношении 6:4, и выдерживают в течение 2-3 часов при температуре 20-25оС, обработанные таким образом шкуры промывают в дистиллированной воде в течение 20 мин.

Затем шкуры заливают раствором аскорбиновой кислоты с концентрацией 7 % и выдерживают в течение 5 суток.

Полученную массу нейтрализуют раствором гидроксида натрия до рН 5,5 – 6,5 и гомогенизируют до однородного состояния.

В гомогенную массу вводят антибиотик широкого действия гентамицин в дозировке 1,5-2,5 мг/см³.

Полученную массу разливают слоем до 0,5 см и сушат в виде пленки при температуре 50°С и скорости движения воздуха 2-5 м/с до влажности материала 5-10%.

Высушенные коллагеновые материалы нарезают на пластинки и герметично упаковывают.

Пример 4.

Шкуры, полученные при разделке пресноводных рыб (карп, толстолобик, сазан, белый амур), зачищают от жира, прирезей мышечной ткани и механических загрязнений, измельчают на полосы шириной 2-4 см и промывают в мыльном растворе в течение 30 мин.

Затем с целью удаления остатков моющего средства шкуры промываются проточной водой.

Промытые шкуры замачивают в растворе хлорида натрия с массовой концентрацией 3 % в течение 10 минут, обезжиривают в растворе с массовой концентрацией 0,1% к массе сырья ферментного комплекса липоризина, содержащего 1 часть протеазы и 2 части липазы, в течение 30 минут, а затем промывают в дистиллированной воде до отсутствия остатков ферментного комплекса.

Далее промытые шкуры замачивают в перекоксидно-щелочном растворе, состоящем из смеси пероксида водорода с массовой концентрацией 3 % и гидроксида натрия с массовой концентрацией 2 %, взятых в соотношении 6:4, и выдерживают в течение 2-3 часов при температуре 20-25оС, обработанные таким образом шкуры промывают в дистиллированной воде в течение 20 мин.

Затем шкуры заливают раствором лимонной кислоты с концентрацией 1,5 % и выдерживают в течение 5 суток.

Полученную массу нейтрализуют раствором гидроксида натрия до рН 5,5 – 6,5 и гомогенизируют до однородного состояния.

В гомогенную массу вводят антибиотик широкого действия гентамицин в дозировке 1,5-2,5 мг/см³.

Полученную массу разливают слоем до 0,5 см и сушат в виде пленки при температуре 50°С и скорости движения воздуха 2-5 м/с до влажности материала 5-10%.

Высушенные коллагеновые материалы нарезают на пластинки и герметично упаковывают.

Пример 5.

Шкуры, полученные при разделке пресноводных рыб (карп, толстолобик, сазан, белый амур), зачищают от жира, прирезей мышечной ткани и механических загрязнений, измельчают на полосы шириной 2-4 см и промывают в мыльном растворе в течение 30 мин.

Затем с целью удаления остатков моющего средства шкуры промываются проточной водой.

Промытые шкуры замачивают в растворе хлорида натрия с массовой концентрацией 3 % в течение 10 минут, обезжиривают в растворе с массовой концентрацией 0,1% к массе сырья ферментного комплекса липоризина, содержащего 1 часть протеазы и 2 части липазы, в течение 30 минут, а затем промывают в дистиллированной воде до отсутствия остатков ферментного комплекса.

Далее промытые шкуры замачивают в перекоксидно-щелочном растворе, состоящем из смеси пероксида водорода с массовой концентрацией 3 % и гидроксида натрия с массовой концентрацией 2 %, взятых в соотношении 6:4, и выдерживают в течение 2-3 часов при температуре 20-25оС, обработанные таким образом шкуры промывают в дистиллированной воде в течение 20 мин.

Затем шкуры заливают раствором янтарной кислоты с концентрацией 1,5 % и выдерживают в течение 5 суток.

Полученную массу нейтрализуют раствором гидроксида натрия до рН 5,5 – 6,5 и гомогенизируют до однородного состояния.

В гомогенную массу вводят антибиотик широкого действия гентамицин в дозировке 1,5-2,5 мг/см³.

Полученную массу разливают слоем до 0,5 см и сушат в виде пленки при температуре 50°С и скорости движения воздуха 2-5 м/с до влажности материала 5-10%.

Высушенные коллагеновые материалы нарезают на пластинки и герметично упаковывают.

Пример 6.

Шкуры, полученные при разделке пресноводных рыб (карп, толстолобик, сазан, белый амур), зачищают от жира, прирезей мышечной ткани и механических загрязнений, измельчают на полосы шириной 2-4 см и промывают в мыльном растворе в течение 30 мин.

Затем с целью удаления остатков моющего средства шкуры промываются проточной водой.

Промытые шкуры замачивают в растворе хлорида натрия с массовой концентрацией 3 % в течение 10 минут, обезжиривают в растворе с массовой концентрацией 0,1% к массе сырья ферментного комплекса липоризина, содержащего 1 часть протеазы и 2 части липазы, в течение 30 минут, а затем промывают в дистиллированной воде до отсутствия остатков ферментного комплекса.

Далее промытые шкуры замачивают в перекоксидно-щелочном растворе, состоящем из смеси пероксида водорода с массовой концентрацией 3 % и гидроксида натрия с массовой концентрацией 2 %, взятых в соотношении 6:4, и выдерживают в течение 2-3 часов при температуре 20-25оС, обработанные таким образом шкуры промывают в дистиллированной воде в течение 20 мин.

Затем шкуры заливают раствором молочной кислоты с концентрацией 1,5 % и выдерживают в течение 5 суток.

Полученную массу нейтрализуют раствором гидроксида натрия до рН 5,5 – 6,5 и гомогенизируют до однородного состояния.

В гомогенную массу вводят антибиотик широкого действия гентамицин в дозировке 1,5-2,5 мг/см³.

Полученную массу разливают слоем до 0,5 см и сушат в виде пленки при температуре 50°С и скорости движения воздуха 2-5 м/с до влажности материала 5-10%.

Высушенные коллагеновые материалы нарезают на пластинки и герметично упаковывают.

Реализация предлагаемого способа позволяет расширить спектр возможного действия на микроорганизмы;

– снизить отрицательное действие высоких концентраций уксусной кислоты;

– расширить область возможного применения коллагеновой субстанции в качестве асептического средства или материала.

1. Способ получения иммобилизованных на коллагеновом носителе антибиотиков, характеризующийся тем, что предварительно зачищенные, измельченные на полосы шириной 2-4 см и промытые в мыльном растворе шкуры прудовых рыб из ряда: карп, толстолобик, белый амур и сазан, замачивают в растворе хлорида натрия с массовой концентрацией 3% в течение 10 мин, затем обезжиривают в растворе с массовой концентрацией 0,1% к массе сырья ферментного комплекса липоризина, содержащего 1 часть протеазы и 2 части липазы, в течение 30 мин, а затем промывают в дистиллированной воде до отсутствия остатков ферментного комплекса, далее промытые шкуры замачивают в перекоксидно-щелочном растворе, состоящем из смеси пероксида водорода с массовой концентрацией 3% и гидроксида натрия с массовой концентрацией 2%, взятых в соотношении 6:4, и выдерживают в течение 2-3 ч при температуре 20-25^оС, обработанные таким образом шкуры промывают в дистиллированной воде в течение 20 мин, затем шкуры заливают раствором уксусной кислоты с массовой концентрацией 1,5 – 6%, или раствором аскорбиновой кислоты с массовой концентрацией 7%, или лимонной кислоты с массовой концентрацией 1,5%, или янтарной кислоты с массовой концентрацией 1,5%, или молочной кислоты с массовой концентрацией 1,5% и выдерживают в течение 5 сут, полученную массу нейтрализуют раствором гидроксида натрия до рН 5,5-6,5, затем гомогенизируют, а далее в гомогенную массу вводят антибиотики широкого действия в дозировке 1,5-2,5 мг/см³, затем полученную массу разливают в виде пленки и отправляют на сублимационную сушку, которую проводят в вакуум-сублимационной машине при вакууме от 6·10^-1 мбар до 8·10^-1 мбар в течение 10-15 ч, высушенные коллагеновые материалы нарезаются на пластинки и герметично упаковываются.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что коллагеновую пленку сушат при температуре плюс 50°С до влажности 5-10%.