Штамм "prrs-1sbc" вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и вакцинных препаратов, вакцина против репродуктивно-респираторного синдрома свиней и способ получения вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней (варианты)
Владельцы патента RU 2779552:
Федеральное казенное предприятие "Щелковский биокомбинат" (RU)
Изобретение относится к области ветеринарии, ветеринарной биотехнологии и касается производства профилактических и диагностических препаратов. Представлен штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и вакцинных препаратов, относящийся к роду Arterivirus, семейству Arteriviridae, порядку Nidovirales, депонированный в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» под №2928. Представлена вакцина для профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней, содержащая аттенуированный штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней с титром 4,0-7,5 lg ТЦД50/см3 и смесь сахарозы, пептона и желатозы. Представлены варианты вакцины, где в качестве стабилизатора используют смесь сахарозы, пептона, желатозы и трис-HCl буфер, или в качестве стабилизатора используют смесь сахарозы, пептона, желатозы, трис-HCl буфер, этилендиаминтетрауксусную кислоту, или в качестве стабилизатора используют смесь сахарозы, пептона, желатозы, трис-HCl буфер, этилендиаминтетрауксусную кислоту и хитозан. Предложен способ получения вакцины для профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней, включающий инфицирование перевиваемой культуры клеток вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, репродукции вируса в перевиваемой культуре клеток, сбор вируссодержащего материала с последующим получением иммунизирующего антигена вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и добавление к нему стабилизатора, в качестве вируссодержащего материала используют аттенуированный штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней с титром 4,0-7,5 lg ТЦД50/см3, а в качестве перевиваемой культуры клеток используют клетки МА-104, или клетки Vero, или клетки Marc-145, или клетки CV1, причем репродукцию вируса проводят при температуре 36-38°С в течение 72-120 час при рН 7,2-7,4, а иммунизирующий антиген вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней получают путем 1-2-х кратным замораживанием и оттаиванием инфицированных клеток с последующим центрифугированием при 1000-2000 тыс. об/мин в течение 15-20 мин и отделением супернатанта, а вакцину получают добавлением к супернатанту стабилизатора. Изобретение позволяет повысить иммуногенность целевого продукта при длительном хранении целевого продукта. 6 н.п. ф-лы, 1 табл.
Изобретение относится к области ветеринарии, ветеринарной биотехнологии для производства профилактических препаратов, используемый в научно-исследовательских институтах и предприятиях биологической промышленности при конструировании биопрепаратов, в частности вакцин против репродуктивно-респираторного синдрома свиней.
Известен Штамм Porcine reproductive and respiratory syndrome virus рода Arterivirus КМИЭВ-35 для изготовления вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней и способ получения вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, включающем получение вируссодержащего материала из штамма вируса, выращенного в перевиваемой культуре клеток [Патент ЕР 0835930 В1, Штамм porcine reproductive and respiratory syndrome virus рода arterivirus кмиэв-35 для изготовления вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, МПК C12N 7/00, A61K 39/00, опубликовано: 30.10.2006].
Однако известная вакцина недостаточно иммуногенна при более длительном сроке ее хранения.
Известен также штамм «КПР-96» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней Штамм Porcine reproductive and respiratory syndrome virus рода Arterivirus «КПР-96» для изготовления вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней и способ получения вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, включающем получение вируссодержащего материала из штамма вируса, выращенного в перевиваемой культуре клеток [Патент РФ №2295567, Штамм porcine reproductive and respiratory syndrome virus рода arterivirus «КПР-96» для изготовления вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, МПК C12N 7/00, C12R 1/93, опубликовано: 20.03.2007, Бюл. №8].
Однако известная вакцина также недостаточно иммуногенна при более длительном сроке ее хранения.
Техническим решением предлагаемого изобретения является повышение иммуногенности целевого продукта при длительном хранении целевого продукта.
Предложена группа изобретений, объединенная единым изобретательским замыслом с достижением единого технического результата.
Поставленная задача достигается получением штамма «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и вакцинных препаратов, относящийся к роду Arterivirus, семейству Arteriviridae, порядку Nidovirales, депонированного 10.07.2019 в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» под №2928, для изготовления диагностических и вакцинных препаратов, а также для целей патентной процедуры (см. приложение - удостоверение).
Поставленная задача решается также в вакцине для профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней, содержащей вируссодержащий материал из аттенуированного штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и стабилизатор тем, что в качестве вируссодержащего материала используют аттенуированный штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней с титром 4,0-7,5 lg ТЦД50/см3, а в качестве стабилизатора используют смесь сахарозы, пептона и желатозы, при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| сахароза | 15,0-25,0 |
| пептон | 6,0-8,0 |
| желатоза | 1,5-3,0 |
| Штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного | |
| синдрома свиней с инфекционной активностью | |
| 4,0-7,5 lg ТЦД50/см3 | остальное |
Поставленная задача решается также в вакцине для профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней, содержащей вируссодержащий материал из аттенуированного штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и стабилизатор тем, что в качестве вируссодержащего материала используют аттенуированный штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней с титром 4,0-7,5 lg ТЦД50/см3, а в качестве стабилизатора используют смесь сахарозы, пептона, желатозы и трис-HCl буфер, при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| сахароза | 15,0-25,0 |
| пептон | 6,0-8,0 |
| желатоза | 1,5-3,0 |
| 0,03-0,05М трис-HCl буфер с рН 7,4-7,8 | 0,006-0,01 |
| Штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного | |
| синдрома свиней с инфекционной активностью 4,0-7,5 lg | |
| ТЦД50/см3 | остальное |
Поставленная задача решается также в вакцине для профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней, содержащей вируссодержащий материал из аттенуированного штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и стабилизатор тем, что в качестве вируссодержащего материала используют аттенуированный штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней с титром 4,0-7,5 lg ТЦД50/см3, а в качестве стабилизатора используют смесь сахарозы, пептона, желатозы, трис-HCl буфер и этилендиаминтетрауксусная кислота, при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| сахароза | 15,0-25,0 |
| пептон | 6,0-8,0 |
| желатоза | 1,5-3,0 |
| 0,03-0,05М трис-HCl буфер с рН 7,4-7,8 | 0,006-0,01 |
| этилендиаминтетрауксусная кислота | 0,03-0,1 |
| Штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного | |
| синдрома свиней с инфекционной активностью 4,0-7,5 lg | |
| ТЦД50/см3 | остальное |
Поставленная задача решается также в вакцине для профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней, содержащей вируссодержащий материал из аттенуированного штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и стабилизатор тем, что в качестве вируссодержащего материала используют аттенуированный штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней с титром 4,0-7,5 lg ТЦД50/см3, а в качестве стабилизатора используют смесь сахарозы, пептона, желатозы, трис-HCl буфер, этилендиаминтетрауксусная кислота и хитозан, при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| сахароза | 15,0-25,0 |
| пептон | 6,0-8,0 |
| желатоза | 1,5-3,0 |
| 0,03-0,05М трис-HCl буфер с рН 7,4-7,8 | 0,006-0,01 |
| этилендиаминтетрауксусная кислота | 0,03-0,1 |
| хитозан | 0,5-1,0 |
| Штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного | |
| синдрома свиней с инфекционной активностью 4,0-7,5 lg | |
| ТЦД50/см3 | остальное |
Поставленная задача решается также в способе получения вакцины для профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней, включающий инфицирование перевиваемой культуры клеток вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, репродукции вируса в перевиваемой культуре клеток, сбор вируссодержащего материала с последующим получением иммунизирующего антигена вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и добавление к нему стабилизатора тем, что в качестве вируссодержащего материала используют аттенуированный штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней с титром 4,0-7,5 lg ТЦД50/см3, а в качестве перевиваемой культуры клеток используют клетки МА-104, или клетки Vero, или клетки Marc-145, или клетки CV1, причем репродукцию вируса проводят при температуре 36-38°С в течение 72-120 час при рН 7,2-7,4, а иммунизирующий антиген вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней получают путем 1-2-х кратным замораживанием и оттаиванием инфицированных клеток с последующим центрифугированием при 1000-2000 тыс. об/мин в течение 15-20 мин и отделением супернатанта, а вакцину получают добавлением к супернатанту стабилизатора.
Родословная штамма: Прототип штамма, эпизоотический изолят вируса «PRRS-1SBC» был выделен на ФКП «Щелковский биокомбинат» от поросенка из ЛПХ Владимирской области Судогодского района Головинского сельского поселения. Вирусный материал был выделен на первичной культуре клеток альвеолярных макрофагов свиней (АМС) и подтвержден результатами ПЦР, а также в перекрестной реакции нейтрализации на культуре клеток МА-140 с использованием иммунной сыворотки крови свиней к эталонному штамму вируса РРСС, нормальной сыворотки крови здорового поросенка, свободной от антител к вирусу РРСС (контроль) и положительной сыворотки крови к парвовирусу свиней (контроль). Вирус РРСС штамма «PRRS-1SBC», как и референтный штамм вируса РРСС, нейтрализуется антителами иммунной сыворотки и проявляет цитопатогенное действие на культуре клеток МА-140 в присутствии нормальной сыворотки здорового поросенка.
Для выделения вируса PRRS из патологического материала использовали первичную культуру альвеолярных макрофагов свиней АМС, которую получали от клинически здоровых поросят в возрасте 4-6 недель. Дальнейшую адаптацию и аттенуацию вируса проводили прямыми последовательными пассажами на перевиваемой культуре клеток почки зеленой мартышки Vero (8 пассажей) и почки эмбриона макаки - резус МА-104 (15 пассажей). Селективный отбор штамма проводили по продуктивности, безвредности для целевых животных, иммуногенной и антигенной активности. Тип и структура нуклеиновой кислоты штамма «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней: линейная позитивная одноцепочечная РНК размером 15 тысяч нуклеотидов. Морфология вириона: Вирионы вируса PRRS представляют собой сферические или аморфные частицы диаметром от 45 до 100 нм. Они состоят из изометрического нуклеокапсида диаметром от 25 до 35 нм и липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются гликопротеиновые выступы длиной от 12 до 15 нм. Вирион состоит из нуклеокапсидного (N), мембранного (М) и оболочечного (Е) протеинов. В состав оболочки вириона входят липиды и углеводы как часть гликопротеинов. На поверхности оболочки находятся поверхностные гликонротеины GS и GL. Размер вириона: сферические или аморфные частицы диаметром от 45 до 100 нм. Устойчивость к действию внешних факторов и химических веществ: Вирус PRRS оболочечный, неустойчив к физико-химическому воздействию липидных растворителей (хлороформом, эфиром) и детергентов (деоксихолатом хлорида, Triton Х-100, NP-40), за исключением фреона-113, не ингибируется антибиотиками. Вирус стабилен при рН в пределах от 5.0 до 7.0. Устойчив при хранении при температуре от минус 20 до минус 70 С. Культуральные признаки: При репродукции в перевиваемой культуре клеток Vero или МА-104 накапливается на 25-м пассаже на уровне 5,5±0,5 lg ТЦД50/см3. Патогенность для организма: Апатогенен для естественно восприимчивых и лабораторных животных. Вирулентность: Авирулентен для естественно восприимчивых животных при контактном, аэрозольном, парентеральном и внутриутробном заражении. Антигенные свойства. Вирус штамма «PRRS-1SBC» стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. При вакцинации антиген штамма «PRRS-1SBC» индуцирует образование специфических антител, выявляемых в иммуноферментном анализе (ИФА). Вирусоспецифические антигены, общие для всех серотипов вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней штамма «PRRS-1SBC», выявляются с помощью иммунофлюоресцентного или иммунопероксидазного анализа или ИФА.
Известна перевиваемая культура клеток МА-104 [Европейский патент ЕР 0835930 В1, European vaccine strains of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), МПК C12N 7/00, A61K 39/12, A61K 39/295, опубликовано: 31.01.2001, Бюл. №2001/5].
Известна перевиваемая культура клеток почки зеленой мартышки Vero [Патент РФ №2606848, Способ определения биологической активности вирусов кори, эпидемического паротита и краснухи при производстве ассоциированных препаратов (варианты), МПК C12N 7/00, C12N 5/00, опубликовано: 10.01.2017, Бюл. №1].
Известна первичная культура клеток Marc-145 [Патент РФ №2295567, Штамм "КПР-96" вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов, мпк C12N 7/00, C12R 1/93, опубликовано: 20.03.2007, Бюл. №8].
Известна первичная культура клеток CV1 [Европейский патент ЕР 0 835930 В1, European vaccine strains of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), МПК C12N 7/00, A61K 39/12, A61K 39/295, опубликовано: 31.01.2001, Бюл. №2001/5].
В патентной и научно-технической литературе неизвестны технические решения аналогичные заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию изобретения «новизна».
Заявленная композиция решает актуальную проблему ветеринарии - профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней, т.е. предложение «промышленно применимо».
В отечественной литературе не известно, что применение штамма «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для получения вакцины и сочетанное использование выше указанных отличительных признаков, взятых в определенных соотношениях компонентов, увеличивает сроки хранения целевого продукта с сохранением его иммуногенности против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, что приводит к достижению технического результата. Следовательно, изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».
Изобретение иллюстрируется на следующих примерах:
Пример 1. Вируссодержащий материал готовят известным способом [Патент РФ №2295567, Штамм porcine reproductive and respiratory syndrome virus рода arterivirus кмиэв-35 для изготовления вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, МПК C12N 7/00, C12R 1/93, опубликовано: 20.03.2007, Бюл. №8] путем размножения на 3-суточной перевиваемую культуру клеток МА-104, выращенной в клинских матрасах с хорошо сформировавшимся монослоем, которую заражают аттенуированный штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, а в качестве перевиваемой культуры клеток используют клетки МА-104, причем репродукцию вируса проводят при температуре 36°С в течение 120 час при рН 7,2, причем сбор вируса производят при накапливании вируса инфекционной активности 4,0 lg ТЦД50/см3, а иммунизирующий антиген вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней получают 1-но кратным замораживанием и оттаиванием инфицированных клеток с последующим центрифугированием при 1000 тыс. об/мин в течение 20 мин и отделением супернатанта.
Далее к вируссодержащему материалу добавляют стабилизатор - смесь сахарозы, пептона и желатозы, получая вакцину 1 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| сахароза | 15,0 |
| пептон | 6,0 |
| желатоза | 1,5 |
| Штамм «PRRS-1 SBC» вируса репродуктивно-респираторного | |
| синдрома свиней с инфекционной активностью 4,0 lg | |
| ТЦД50/см3 | остальное |
Пример 2. Вируссодержащий материал готовят известным способом [Патент РФ №2295567, Штамм porcine reproductive and respiratory syndrome virus рода arterivirus кмиэв-35 для изготовления вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, МПК C12N 7/00, C12R 1/93, опубликовано: 20.03.2007, Бюл. №8] путем размножения на 2-суточной перевиваемую культуру клеток МА-104, выращенной в клинских матрасах с хорошо сформировавшимся монослоем, которую заражают аттенуированный штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, а в качестве перевиваемой культуры клеток используют клетки МА-104, причем репродукцию вируса проводят при температуре 38°С в течение 72 час при рН 7,2, причем сбор вируса производят при накапливании вируса инфекционной активности 7,5 lg ТЦД50/см3, а иммунизирующий антиген вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней получают 2-х кратным замораживанием и оттаиванием инфицированных клеток с последующим центрифугированием при 2000 тыс. об/мин в течение 15 мин и отделением супернатанта.
Далее к вируссодержащему материалу добавляют стабилизатор - смесь сахарозы, пептона и желатозы, получая вакцину 2 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| сахароза | 25,0 |
| пептон | 8,0 |
| желатоза | 3,0 |
| Штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного | |
| синдрома свиней с инфекционной активностью 7,5 lg | |
| ТЦД50/см3 | остальное. |
Пример 3. Вируссодержащий материал готовят известным способом [Патент РФ №2295567, Штамм porcine reproductive and respiratory syndrome virus рода arterivirus кмиэв-35 для изготовления вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, МПК C12N 7/00, C12R 1/93, опубликовано: 20.03.2007, Бюл. №8] путем размножения на 3-суточной перевиваемую культуру клеток Vero, выращенной в клинских матрасах с хорошо сформировавшимся монослоем, которую заражают аттенуированный штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного синдрома Vero, причем репродукцию вируса проводят при температуре 36°С в течение 120 час при рН 7,2, причем сбор вируса производят при накапливании вируса инфекционной активности 4,0 lg ТЦД50/см3, а иммунизирующий антиген вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней получают 1-но кратным замораживанием и оттаиванием инфицированных клеток с последующим центрифугированием при 1000 тыс. об/мин в течение 20 мин и отделением супернатанта.
Далее к вируссодержащему материалу добавляют стабилизатор - смесь сахарозы, пептона и желатозы, получая вакцину 3 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| сахароза | 15,0 |
| пептон | 6,0 |
| желатоза | 1,5 |
| Штамм «PRRS-1 SBC» вируса репродуктивно-респираторного | |
| синдрома свиней с инфекционной активностью 4,0 lg | |
| ТЦД50/см3 | остальное |
Пример 4. Вируссодержащий материал готовят известным способом [Патент РФ №2295567, Штамм porcine reproductive and respiratory syndrome virus рода arterivirus кмиэв-35 для изготовления вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, МПК C12N 7/00, C12R 1/93, опубликовано: 20.03.2007, Бюл. №8] путем размножения на 2-суточной перевиваемую культуру клеток Vero, выращенной в клинских матрасах с хорошо сформировавшимся монослоем, которую заражают аттенуированный штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, а в качестве перевиваемой культуры клеток используют клетки Vero, причем репродукцию вируса проводят при температуре 38°С в течение 72 час при рН 7,2, причем сбор вируса производят при накапливании вируса инфекционной активности 7,5 lg ТЦД50/см3, а иммунизирующий антиген вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней получают 2-х кратным замораживанием и оттаиванием инфицированных клеток с последующим центрифугированием при 2000 тыс. об/мин в течение 15 мин и отделением супернатанта.
Далее к вируссодержащему материалу добавляют стабилизатор - смесь сахарозы, пептона и желатозы, получая вакцину 4 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| сахароза | 25,0 |
| пептон | 8,0 |
| желатоза | 3,0 |
| Штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного | |
| синдрома свиней с инфекционной активностью 7,5 lg | |
| ТЦД50/см3 | остальное. |
Пример 5. Вируссодержащий материал готовят известным способом [Патент РФ №2295567, Штамм porcine reproductive and respiratory syndrome virus рода arterivirus кмиэв-35 для изготовления вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, МПК C12N 7/00, C12R 1/93, опубликовано: 20.03.2007, Бюл. №8] путем размножения на 3-суточной перевиваемую культуру клеток Marc-145, выращенной в клинских матрасах с хорошо сформировавшимся монослоем, которую заражают аттенуированный штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, а в качестве перевиваемой культуры клеток используют клетки Marc-145, причем репродукцию вируса проводят при температуре 36°С в течение 120 час при рН 7,2, причем сбор вируса производят при накапливании вируса инфекционной активности 4,0 lg ТЦД50/см3, а иммунизирующий антиген вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней получают 1-но кратным замораживанием и оттаиванием инфицированных клеток с последующим центрифугированием при 1000 тыс. об/мин в течение 20 мин и отделением супернатанта.
Далее к вируссодержащему материалу добавляют стабилизатор - смесь сахарозы, пептона и желатозы, получая вакцину 5 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| сахароза | 15,0 |
| пептон | 6,0 |
| желатоза | 1,5 |
| Штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного | |
| синдрома свиней с инфекционной активностью 4,0 lg | |
| ТЦД50/см3 | остальное |
Пример 6. Вируссодержащий материал готовят известным способом [Патент РФ №2295567, Штамм porcine reproductive and respiratory syndrome virus рода arterivirus кмиэв-35 для изготовления вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, МПК C12N 7/00, C12R 1/93, опубликовано: 20.03.2007, Бюл. №8] путем размножения на 2-суточной перевиваемую культуру клеток Marc-145, выращенной в клинских матрасах с хорошо сформировавшимся монослоем, которую заражают аттенуированный штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, а в качестве перевиваемой культуры клеток используют клетки Marc-145, причем репродукцию вируса проводят при температуре 38°С в течение 72 час при рН 7,2, причем сбор вируса производят при накапливании вируса инфекционной активности 7,5 lg ТЦД50/см3, а иммунизирующий антиген вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней получают 2-х кратным замораживанием и оттаиванием инфицированных клеток с последующим центрифугированием при 2000 тыс. об/мин в течение 15 мин и отделением супернатанта.
Далее к вируссодержащему материалу добавляют стабилизатор - смесь сахарозы, пептона и желатозы, получая вакцину 6 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| сахароза | 25,0 |
| пептон | 8,0 |
| желатоза | 3,0 |
| Штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного | |
| синдрома свиней с инфекционной активностью 7,5 lg | |
| ТЦД50/см3 | остальное |
Пример 7. Вируссодержащий материал готовят известным способом [Патент РФ №2295567, Штамм porcine reproductive and respiratory syndrome virus рода arterivirus кмиэв-35 для изготовления вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, МПК C12N 7/00, C12R 1/93, опубликовано: 20.03.2007, Бюл. №8] путем размножения на 3-суточной перевиваемую культуру клеток CV1, выращенной в клинских матрасах с хорошо сформировавшимся монослоем, которую заражают аттенуированный штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, а в качестве перевиваемой культуры клеток используют клетки CV1, причем репродукцию вируса проводят при температуре 36°С в течение 120 час при рН 7,2, причем сбор вируса производят при накапливании вируса инфекционной активности 4,0 lg ТЦД50/см3, а иммунизирующий антиген вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней получают путем 1-но кратным замораживанием и оттаиванием инфицированных клеток с последующим центрифугированием при 1000 тыс. об/мин в течение 20 мин и отделением супернатанта.
Далее к вируссодержащему материалу добавляют стабилизатор - смесь сахарозы, пептона и желатозы, получая вакцину 7 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| сахароза | 15,0 |
| пептон | 6,0 |
| желатоза | 1,5 |
| Штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного | |
| синдрома свиней с инфекционной активностью 4,0 lg | |
| ТЦД50/см3 | остальное |
Пример 8. Вируссодержащий материал готовят известным способом [Патент РФ №2295567, Штамм porcine reproductive and respiratory syndrome virus рода arterivirus кмиэв-35 для изготовления вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, МПК C12N 7/00, C12R 1/93, опубликовано: 20.03.2007, Бюл. №8] путем размножения на 2-суточной перевиваемую культуру клеток CV1, выращенной в клинских матрасах с хорошо сформировавшимся монослоем, которую заражают аттенуированный штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, а в качестве перевиваемой культуры клеток используют клетки CV1, причем репродукцию вируса проводят при температуре 38°С в течение 72 час при рН 7,2, причем сбор вируса производят при накапливании вируса инфекционной активности 7,5 lg ТЦД50/см3, а иммунизирующий антиген вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней получают путем 2-х кратным замораживанием и оттаиванием инфицированных клеток с последующим центрифугированием при 2000 тыс. об/мин в течение 15 мин и отделением супернатанта.
Далее к вируссодержащему материалу добавляют стабилизатор - смесь сахарозы, пептона и желатозы, получая вакцину 8 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| сахароза | 25,0 |
| пептон | 8,0 |
| желатоза | 3,0 |
| Штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного | |
| синдрома свиней с инфекционной активностью 7,5 lg | |
| ТЦД50/см3 | остальное |
Биологическую активность вакцин, полученных согласно примерам 1-8 и известного технического решения, определяли путем титрования, титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча в модификации Ашмарина и выражали в lg ТЦД50/см3. Результаты приведены в таблице.
Из данных таблицы следует, что биологическая активность вакцины против PRRS сухой культуральной маркированной в условиях хранения, при 4°С практически не снизилась на протяжении 4 лет (срок наблюдения). Учитывая вакцинальную дозу - 4,0 lg ТЦД50/см3 на животное, через 4 года хранения количество доз согласно сохраненной биологической активности препарата не изменилась. В то же время использование прототипа показало снижение титра вируса после сушки вакцины и, соответственно меньшее количество прививных доз во флаконе, которое стабильно сохранялось только в течении 12 месяцев (срок годности вакцины).
Таким образом, полученная вакцина заявляемым способом против репродуктивно-респираторного синдрома свиней обладает более высокой иммуногенной активностью через 2-4 года хранения ее хранении в сравнении с известным техническим решением (предлагаемое техническое решение в 5,6-28 раз более эффективно, чем прототип).
1. Штамм «PRRS-1SBC» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней рода Arterivirus, семейства Arteriviridae, порядка Nidovirales, депонированный в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» под номером 2928, для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.
2. Вакцина для профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней, содержащая вируссодержащий материал из аттенуированного штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и стабилизатор, отличающаяся тем, что в качестве вируссодержащего материала используют аттенуированный штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней по п. 1 с титром 4,0-7,5 lg ТЦД50/см3, а в качестве стабилизатора используют смесь сахарозы, пептона и желатозы, при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| сахароза | 15,0-25,0 |
| пептон | 6,0-8,0 |
| желатоза | 1,5-3,0 |
| Штамм по п. 1 с инфекционной активностью 4,0-7,5 lg | |
| ТЦД50/см3 | остальное |
3. Вакцина для профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней, содержащая вируссодержащий материал из аттенуированного штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и стабилизатор, отличающаяся тем, что в качестве вируссодержащего материала используют аттенуированный штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней по п. 1 с титром 4,0-7,5 lg ТЦД50/см3, а в качестве стабилизатора используют смесь сахарозы, пептона, желатозы и трис-HCl буфер, при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| сахароза | 15,0-25,0 |
| пептон | 6,0-8,0 |
| желатоза | 1,5-3,0 |
| 0,03-0,05 М трис-HCl буфер с рН 7,4-7,8 | 0,006-0,01 |
| Штамм по п. 1 с инфекционной активностью 4,0-7,5 lg | |
| ТЦД50/см3 | остальное |
4. Вакцина для профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней, содержащая вируссодержащий материал из аттенуированного штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и стабилизатор, отличающаяся тем, что в качестве вируссодержащего материала используют аттенуированный штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней по п. 1 с титром 4,0-7,5 lg ТЦД50/см3, а в качестве стабилизатора используют смесь сахарозы, пептона, желатозы, трис-HCl буфер и этилендиаминтетрауксусную кислоту, при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| сахароза | 15,0-25,0 |
| пептон | 6,0-8,0 |
| желатоза | 1,5-3,0 |
| 0,03-0,05 М трис-HCl буфер с рН 7,4-7,8 | 0,006-0,01 |
| этилендиаминтетрауксусная кислота | 0,03-0,1 |
| Штамм по п. 1 с инфекционной активностью 4,0-7,5 lg | |
| ТЦД50/см3 | остальное |
5. Вакцина для профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней, содержащая вируссодержащий материал из аттенуированного штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и стабилизатор, отличающаяся тем, что в качестве вируссодержащего материала используют аттенуированный штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней по п. 1 с титром 4,0-7,5 lg ТЦД50/см3, а в качестве стабилизатора используют смесь сахарозы, пептона, желатозы, трис-HCl буфер, этилендиаминтетрауксусную кислоту и хитозан, при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| сахароза | 15,0-25,0 |
| пептон | 6,0-8,0 |
| желатоза | 1,5-3,0 |
| 0,03-0,05 М трис-HCl буфер с рН 7,4-7,8 | 0,006-0,01 |
| этилендиаминтетрауксусная кислота | 0,03-0,1 |
| хитозан | 0,5-1,0 |
| Штамм по п. 1 с инфекционной активностью 4,0-7,5 lg | |
| ТЦД50/см3 | остальное |
6. Способ получения вакцины для профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней, включающий инфицирование перевиваемой культуры клеток вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, репродукции вируса в перевиваемой культуре клеток, сбор вируссодержащего материала с последующим получением иммунизирующего антигена вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и добавление к нему стабилизатора, отличающийся тем, что в качестве вируссодержащего материала используют аттенуированный штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней по п. 1 с титром 4,0-7,5 lg ТЦД50/см3, а в качестве перевиваемой культуры клеток используют клетки МА-104, или клетки Vero, или клетки Marc-145, или клетки CV1, причем репродукцию вируса проводят при температуре 36-38°С в течение 72-120 час при рН 7,2-7,4, а иммунизирующий антиген вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней получают путем 1-2-х кратным замораживанием и оттаиванием инфицированных клеток с последующим центрифугированием при 1000-2000 тыс. об/мин в течение 15-20 мин и отделением супернатанта, а вакцину получают добавлением к супернатанту стабилизатора.
