Всесоюзная !i ^ . *;.,,г;.;л vrviiwmff'k^--':i ila \ till • tit-' 1 i.anss"t.tri-*n i bhb.fl^otsha

 

300992

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистических

Респтблик

Зависимый от патента №

МПК С 07с 103/52

Заявлено 15.VII.1969 (Ko 1349142/23-4)

Приоритет 15.VII.1968, М P 1768934.8, ФРГ

Комитет по делает изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

УДК 547.964.4 07 (088.8) Опубликовано 071Ч.1971. Бюллетень № 13

Дата опубликования описания 26.V.1971

Авторы изобретения

Иностранцы

Ойген Верле и Ханс Фритц (Федеративная Республика Германии) Иностранная фирма

«Фарбенфабрикен Байер А. Г.» (Федеративная Республика Германии) Заявитель

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ

Известен способ выделения полипептидов, заключающийся в том, что полипептид-(I) ковалентно связывается с растворимым или нерастворимым Yoñèòåëåì и получающийся в результате этого аддукт приводится в воде в соприкосновение с раствором, содержащим полипептид, способный образовывать с полипептидом-(1) соответствующий комплекс, который очищают путем промывания или хроматографическнм способом, переводят далее в диссоциированное состояние действием киСлого буфера и затем элюируют целевой продукт.

Для выделения ингибиторов энзимов энзим, ингибированый соответствующим ингибитором энзимов, ковалентно связывается с соответствующим носителем, получающееся нерастворимое в воде вещество вводится в соприкосновение с раствором ингнбитора энзимов и образующийся комплекс очищается посредством промывания, переводится далее в диссоциированное состояние и затем отдел%тая ингибитор энзимов.

Применяющиеся в известном способе нерастворимые или растворимые носители представляют собой главным образом полимерные вещества, которые должны содержать функциональные группы, способствующие в соответствии с методами химии пептидов проте«анию химической реакции с вышеуказанными полипептидамн, энзимами и ингибиторами пентидов. Среди вышеупомянутых полимерных продуктов в первую очередь следует указать такие макромолекулярные продукты, которые содержат в своем составе ангидридные, хлорангидридные, изоцианатные, а также азидные группы и, кроме того, такие смолы, которые содержат активированный атом фтора. Могут применяться также и известные, содержащие

1р в составе своих макромолекул карбоксильные группы, ионообменные смолы. В силу вышеуказанного обстоятельства большинство из приведенных продуктов обозначается как

А-смолы. При введении в вышеупомянутые

15 смолы групп основного характера получают так называемые полиаморфные смолы, в которых один отрицательный заряд смолы ослабляется до приблизительно нейтрального; такие смолы в последующем изложении будт обозна20 чаться как N-смолы.

В результате исследований было найдено, что известный способ может быть в значительной степени улучшен, если в качестве носителя использовать N-смолу, так как они иммет

25 в большинстве случаев значительно более высокую способность к связыванию, чем А-CMOлы. При применении этих смол подлежащие выделению вещества могут быть изолированы при значительно более мягких условиях, на30 пример при значительно более низком значе300992 нии рН, чем в случае применения А-смол.

Кроме того, N-смолы связывают также энзимы и ингибиторы энзимов с гораздо более низким изоэлектрическим потенциалом, причем при аналогичном значении изоэлектрического потенциала А-смолы или совсем не связывают вышеуказанные вещества, или сапзывают их только в незначительном количестве. Так, например, N-калликреин-ингибигорная смола связывает калликреин, который совершенно не связывается А-калликреин-ин. гибиторной смолой, или смола на основе

N-трипсина связывает ингибиторы, выделенные из соевых бобов, куриного белка, а также из сыворотки, которые с помощью смолы

А-трипсина или не связываются совсем, нли связываются в очень незначительной степени.

N-смолы получаются в том случае, если система, состоящая из вещества-носителя и энзима или из вещества-носителя и ингибитора энзима, соответствующим образом совмещается с алифатическим или/и ароматическим нолиамином, у которого свободна только одна аминогруппа, а остальные аминогруппы защищены ацильными группами. В качестве аминов могут быть использованы, например, N,N-диметилэтилендиамин, агматин, N-метилN - (3-аминопропил) -пиперазин, 4-аминопиридин, 2-аминопиридин, 3-амино-1-циклогексиламинопропан и другие.

По предлагаемому способу получающиеся и фиксирующиеся на N-смоле комплексы в целях удаления сопутствующих веществ и загрязнений, присутствующих в составе препарата, основательно промываются водой и буферными растворами, после чего образовавшиеся комплексные соединения переводятся в диссоциированное состояние путем изменения рН реакционной смеси, и/или путем изменения концентоации ионов, и/или путем вытеснения с помощью конкурентноопособных и тормозящих соединений или субстратов для трипсина, таких, как, например, триптамин или я-бутиламин, и/или путем добавления таких продуктов, которые, как, например, мочевина и соли гуанидина, способствуют ослаблению или полному прекращению молекулярного обменного взаимодействия, что в соответствующих случаях производится путем обратимого денатурирования использующихся протеинов.

Среди энзимов, которые могут быть crc;>aцентрированы из собственных в большей или меньшей степени загрязненных растворов; а затем очищены и выделены, в первую очередь следует отметить такие продукты, как, например, трипсин, химотрипсин, калликреин, плазмин, пенсии, ренин, рибонуклеаза, тромбин, амилаза, параин, гиалуронидаза, карбопепгидаза А и Б, панкреитопептидаза Е, пенициллиназа и холинэстераза.

Среди ингибиторов энзимов, которые могут быть очищены, сконцентрированы и выделены, используя предлагаемый способ, в первую очередь следует отметить обычные извесгпые ингибиторы типа калликреинтрипсина (инги5

10 битор Кунитца, тразилол R), специфические, например, оказывающие ингибирующее действие исключительно на трипсин, так называемые ингибиторы трипсина, получаемые из панкреатических желез свиней и крупного рогатого скота, из семенных пузырей и из семян растений и картофеля.

Помимо вышеуказанного предлагаемый способ концентрирования энзимов и их ингибиторов представляет возможность подыскивать новые ингибиторы для известных в настоящее время энзимов и, наоборот, подыскивать новые энзимы, которые могут быть ингибироаа.ны при использовании соответствующих инги15 биторов энзимов. В первом случае соответствующий энзим ковалентно связывается с всществом-носителем и после этого образовавшийся в результате аддукт обрабатываегся растворами, которые содержат соответствую20 щие ингибиторы для подвергающегося обработке энзима, в течение такого промежутка времени, пока не уменьшится биологическая активность данного энзима. В последнем случае процесс осуществляют аналогичным

25 образом, но в обратной последовательности.

Преимуществом предлагаемого способа концентрирования энзимов и их ингибиторов является возможность обрабатывать также и такие полипептиды, энзимы и их ингибиторы, 30 концентрирование которых из их загрязненных растворов ранее было связано с серьезными затруднениями, а в некоторых случаях было просто невозможно, причем указанное концентрирование, последующая очистка н

35 выделение производятся очень простым способом с хорошими выходами и степенью чистоты.

Пример 1. Получение водонерастворимой смолы N-трипсина.

40 200 мг смолы ЕМА-31 фирмы Монсанто до бавляют при перемешивании к охлажденной до 0 — 4 С смеси, состоящей из 20 мл 0,1>/О-ного гексаметилилендиамина и 75 мл солянобуферного раствора (0,1 М триэтаноламина, 45 0,1 М поваренной соли) с рН 7,8. Полученную суспензию гомогенизируют в течение непро" должительного времени, перемешивают и через 2 мин после добавления смолы совмещают с охлажденным до 0 — 4 С раствором 1 г

50 трипсина в 75 мл соляно-буферного раствора.

По истечении 4 мин медленного перемешивания полученную реакционную смесь совмещают с водным раствором 4 г N,N-диметилэтилендиамина (1: 1). рН 7,8 устанавливают с

55 помощью 2 N раствора НС1. Охлажденную реакционную смесь перемешивают 2 час и центрифугируют. В образовавшемся растворе находится еще 320 мг трипсина, что означает, что 68О/О взятого в реакцию трипсина связы60 вается с водонерастворимой смолой. Полученную водонерастворимую смолу N-трипсина смешивают с двойным объемом порошка целлюлозы Целлекс ХФ, после чего выливают в охлажденную до 0 — 4 С колонну и затем про65 мывают (как правило в течение ночи) соляно300992 буферным расгвором, состоящим из 0,1 М триэтаноламина, 0,1 М поваренной соли и

0,01 М хлористого кальция и с рН 7,8, пока в промывочной жидкости больше не будет обнаруживаться трипсин. Аналогично смолу

N-трипсина получают при использовании вместо N,N-диметилэтилендиамина других аминов;

Пример 2. Выделение ингибиторов с помощью смолы N-трипсина. а) Специальный ингибитор трипсина из папкреатических желез свиней.

Экстракт, образующийся при обработке высокомолекулярного белкового вещества из панкреатических желез свиней 3О/о-ной перхлоркислотой, содержит ингибитор, удельная активность которого составляет 0,014 ImU на

1 мг биурет-протеина. 1 ImU для трипсина ингибирует около 1 мг Trypure Novo R.

Смолу N-трипсина, полученную из 10 г трипсина, прибавляют к нейтральному раствору, содержащему ингибитор (2,14 л, 745000 ImU для трипсина), при охлаждении до температуры 0 — 4 С. После медленного перемешивания в течение 2 час при температуре 0 — 4 С реакционную смесь центрифугируют, отбрасывая жидкую часть. Образовавшийся нерастворимый комплекс ингибитора со смолой трипсина после этого трижды перемешивают с соляно-буферным раствором, содержащим в своем составе 0,1 М триэтаноламина, 0,1 М поваренной соли и 0,01 М хлористого кальция, при температуре 0 — 4 С и образовавшуюся при центрифугировании жидкую фазу вновь отбрасывают. Затем комплекс со смолой вносят в 0,2 М раствор хлористого калия, величину рН суспензии устанавливают равной 2,0 путем добавления соответствующего количества 2 N раствора НС1 и после добавления соляной кислоты реакционную массу перемешивают при охлаждении в течение 1,5 час. Наконец, вышеуказанную суспснзию снова центрифугируют и образовавшийся остаток, состоящий из смолы-энзима и смолыкомплекса, еще один раз, как это описано выше, обрабатывают 0,2 М раствором хлористо= го калия с соляной кислотой, рН которого равно 2,0. В объединенных жидких фазах, образовавшихся в результате центрифугирования, находится такое количество ингибитора, которое составляет 68,5>/р взятого для выделения количества. Удельная активность препарата ингибитора составляет 0,32 ImU/ìã биуретпротеина, а после отделения соли на колонке, наполненной Сефадексом — Г-25 (ДекстрапГель фирмы Фармакиа, Уппсала, Швеция), она составляет 2,73 ImU/ìã биурет-протеина.

Вымывание при использовании N-смолы происходит в значительно менее кислой ооласти, чем для А-смолы. б) Поливалентный калликреиновый ингибитор из органов крупного рогатого скота.

Ингибитор Кунитца (тразилол R) концентрируют аналогично концентрированию ингиби5

З0

З5

65 тора трипсина из панкреатических желез свиней с использованием смолы N-трипсина. Исходным материалом для получения вышеуказанного ингибитора служит технический ингибитор на основе калликреина. При использовании смолы N-трипсина образуется с выходом 86О/о чистый калликреиновый ингибитор с удельной активностью 3,75 ImU/ìã биуретпротеина. в) Ингибитор из бобов сои.

Трипсин — химотрипсин-ингибитор из бобов сои (мол. вес. продукта 23000) получают и концентрируют аналогично описанному выше.

Исходным препаратом служит технический препарат ингибитора (ингибитор из бобов сои, практически лиофильный, фирмы Серва, Гейдельберг) с удельной активностью 0,36 1mU/ëã биурет-протеина для трипсина. 149400 ImU для трипсина полностью связываются на нейтральной сйоле N-трипсина, полученной из

5 г трипсина. После одночасового перемешивания комплекса N-трипсиновая смола-ингибитор в 0,3 M буферном растворе хлористый калийсоляная кислота в жидкую фазу, образующуюся после центрифугирования, переходит

135000 ImU, что составляет 90 /о связанного количества. Удельная активность выделенного из бобов сои ингибитора после отделения солей при прохождении через колонну, наполненную Сефадексом — Г-25 (120)(3 см) и промываемую 0,1 М буфером на основе коллидинацетата с рН 8,0 составляет 2,0 ImU/ëã биурет-протеина, что соответствует приблизительно 6-кратному концентрированию.

Пример 3. Получение водонерастворимой ингибитор-(тразилол R)-смолы.

Для получения анионной А-смолы к 23 мл

0,2 М фосфатного буфера с рН 8,0 и 2,0 мл

0,1О/р-ного раствора гексаметилендиамина (ГМД) добавляют 120 мг смолы ЕМА-81 пли

EMA-31 фирмы Монсанто, гомогенизируют в течение непродолжительного промежутка времени, затем перемешивают и через 5 мин (при использовании смолы ЕМА-31 через 3 мин) после добавления смолы совмещают с раствором 200 мг (около 600000 ImU для трипсипа) трипсин-калликреинового ингибитора в 30 мл вышеуказанного фосфатного буфера. Реакционную смесь перемешивают 16 час в холодильнике, затем центрифугируют и определяют несвязанное количество ингибитора в жидкости, образовавшейся в результате центрифугирования. Осадок после центрифугирования представляющий собой смолу — ингибитор, многократно промывают 0,2 М триэтаноламинным буферным раствором с рН 7,8 до тех пор, пока промывные воды не будут содержать в своем составе ингибитор. Все вышеперечисленные операции производятся при температуре 0 — 4 С.

Для синтеза нейтральной N-смолы все исходные компоненты используются такие же, как указано выше. Через 8 мин после добавления раствора ингибитора к суспензии смо300992

Таблица 1

Обозначение смолы ингибитора

Время перемешивания после добавления ГМД или ЖИД, мин

Количество ингибитора, связанное со смолой, Смола

А-смола

92

81

ЕМА 31

ЕМА-81

ЕМА-81

N8-смола

Nq-смола

Количество ингибитора, связанное в смоле, (1ц) (для трипсина) Адсорби ров анное количество энзима, Тип ингибиторной смолы (мг) Трипсин

18

11,8

18,86

66,8

42,9

0

36

Химотрипсин

А 6

3,7

15,7

66,8

42,9

3,5

17

37

31 лы (марки ЕМА-81) к полученному раствору дополнительно прибавляют раствор 1,6 г

N,N-диметилэтилендиамина (ЯИД) в небольшом количестве воды (объемное соотношение

1:1 с рН 1,8, устанавливаемым с помощью

2N соляной кислоты. Полученную реакционную смесь перемешивают 2 час и центрифугируют. Образовавшуюся в результате центАдсорбпия и диссоциация трипсина и химотрипсина на анионных (А) и нейтральных ингибиторных смолах.

Адсорбция. Ингибиторную смолу добавляют к 20 мл 0,1 М триэтаноламинного буферного раствора с рН 7,8, в состав которого помимо аминного компонента входят еще 0,1 М хлористый натрий и 0,01 М хлористый калий и после этого совмещают с избытком энзима, растворенного в небольшом количестве указанного буферного раствора. После перемешивания полученной реакционной смеси в течение 2 час (возможно также в течение ночи) ее центрифугируют и затем определяют оставшееся количество энзи ма в образовавшейся жидкой фазе. Нерастворимый комплекс — смола промывается буферным раствором срН7,8, до тех пор, пока в промывных водах больше не будет наблюдаться энзиматической актив" В расчете на количество энзима, которое ингибируется в растворе таким же количеством ингибитора.

При однократном применении смолы

27,3 мг (б4% ); после четырехкратного применения 13 мг (30%"). рифугирования нерастворимую смолу-ингибитор повторно обрабатывают, как указано выше. Свойства N-смолы, при получении которой добавление хлоргидрата N,N-диметилэтилендиамина производится не через 8 мин, а уже через 5 мин к реакционной смеси, состоящей из смолы с ингибитором, представлены в табл. 1. ности. Все вышеперечисленные операции проводятся при температуре 0 — 4 C.

Диссоциация и элюирование. После последней операции промывания нерастворимый

10 комплекс энзима с ингибиторной смолой суспендируют в 50 мл 0,3 М раствора хлористого калия и необходимую величину рН суспензии устанавливают с помощью 2 N раствора соляной кислоты. После 2 час перемеши15 вания суспензию, которая имеет кислую реакцию, вновь центрифугируют и определяют энзиматическую активность жидкой фазы, образовавшейся при центрифугировании. Для. совершенно полного вымывания энзима из

20 смолы промывку производят, как правило, 3—

4 раза порциями по 50 мл, пока в жидкой фазе, образующейся при центр ифугировани и, больше не будет обнаруживаться заметное ко. личество энзима (табл. 2).

Таблица 2

Вымытое количество энзима, т. е, общее адсорбированное количество эизима, %, при рН

3,5 3,0 2,5 2,0 1,7

Для концентрирования калликреина с помощью нейтральной инги битор ной смолы (Ns и Ns) перед адсорбцией растворяют калликреин в 20 мл 0,1 М триэтаноламинного буферного раствора, который дополнительно

30 содержит всвоем составе 0,,1 М хлористого натрия и имеет рН 7 — 8, и после растворения

300992

Таблица 3

Вымытое количество калликреина (адсорбиров анное количество калликреина) 0,4 — 1 M раствором соли гуанидина, ч ., при РН

Адсорбиров анное количество каллиКоличество ингиб: тора, связанное в смоле, (lu)

Тип креина, ингибиторной смолы (КЯ)б

5,0

6,0

7,0 о6 в

9 790

24 940

1s

72

59

53

15

4,9

110,9

221, 9

Предмет изобретения

Составитель А. Акимова

Редактор Т. Г. Шарганова Техред 3, Н, Тараиенко Корректор Л. Б. Бадылама

Заказ 1319/13 Изд. № 589 Тираж 473 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, 7К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 ингибиторную смолу вносят в указанный раствор калликреина. После 14 «ас перемешивания (обычно в течение ночи, но в то же время вполне достаточно 2 «ас перемсшивания) центрифугируют полученную реакционную смесь и производят определение несвязанного калликреина в жидкой фазе, образовавшейся при центрифугировании. Нерастворимый комплекс калликреина и ингибиторной смолы промывается буферным раствором до полного освобождения от калликреина и протеина. Для трипсина 1 ImU ингибирует около

1 лг трипсина и соответствует 0,27 иг чистого ингибитора и 0,38 мг нашего препарата ингибитора.

1 КЕ (биологическая единица калликреина) выделяет около 0,7 нг протеина чистого калликреина. В расчете на количество энзима, которое ингибирует такое же количество ингиби-ора в растворе.

Смола N-трипсин получена в соответствии с описанием данного изобретения; смола Атрипсин получена аналогично, однако без добавления N,N-диметилэтилендиамина.

Элюирование калликреина из комплекса калликреина с ингибиторпой смолой производят с помощью 0,38 — 1 М раствора соли гуанидина, который доводится до необходимого значения рН буфером на основе ацетата натрия. Для полного вымывания калликреина

его комплекс со смолой необходимо перемешивать от 4 до 5 раз порциями по 20 мл с раствором соли гуанидина в течение 1 час и

10 после этого отделить центрифугированием ингибиторную смолу. Результаты приведены в табл. 3.

15 Способ выделения полипептидов путем взаимодействия полипептида- (I) c растворимым или нерастворимым носителем, обработки образующегося продукта в водной среде раствором полипептида, образующего с полипеп20 тидом-(I) комплекс, очистки комплекса промыванием, переведением комплекса в диссоциированное состояние действием кислого буфера и элюированием целевого продукта, отли«а ощийся тем, что продукт взаимодей25 ствия полипептида- (1) и носителя обрабатывают алифатическим и/или ароматическим полиамином с одной свободной аминогруппой и защищенными ацильными остатками OcTB.|Ibными аминогруппами,