Способ получения цитохрома с

 

f C.

О П=И=C-А Н И Е 4eee v

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Зависимое от авт. свидетельства— (22) Заявлено 09.08.74(21) 2052319/28-13 (51) М. Кл.

С 07 g 7/03 с присоединением заявки № (23) Приоритет—

Государственный комитет

Совета Мнннетров СССР оо делам нвооретеннй н открытнй

ОпУбликовано 25 10 75Бюллетень № 39 (53) УДЫ 615.779.94 (088.8) Дата опубликования описания.:16.01.76 (72) Авторы изобретения

Б. И. Чумбурндэе и Н. 3. Шенгелидзе (71) Заявител Гбилисский государственный медицинский институт Грузинской ССР аявителн

Научно-исследовательский, институт акушерства н гинекологии (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИТОХРОМА С

Изобретение относится к- медицине.

Известен способ получения цитохрома

С, по которому дрожжевые клетки дважды промывают и отделяют центрифугированием. Затем их разрушают этилацетатом, после чего провод"т экстракцию водой в присутствии сульфата аммония (10%-ного насыщения) при рН раствора 7,0-7,5,уста= ..навливаемом аммиаком

После этого отделяют взвешенные час,тицы центрифугированием. Полученный фу гат диализуют, затем диализ пропускают через колонку ДЭАЭ- целлюлозы.

Полученную жидкость диализуют, подвергают повторной хроматографии на колонке КМ-целлюлозы, при этом цитохром С адсорбируется в верхнюю часть колонки.

Лесорбцию цитохрома С из колонки KMцеллюлозы осуществляют аммиаком. Элю-!

;ат диализуют и высушивают при температуо ре -75 С. Выход сырого фермента питохрома С при пересчете на высушенные дрожжи составляет 0,03%.

Цель изобретения — сокращение процесса и увеличение выхода продукта. йля этого экстракцию цитохрома С после разрушения дрожжевых клеток осу

IUBCTBJ15lKYf pBCTBOpOM QBXBpOGbl, & очистку продукта проводят последовательной

5;сорбцией его и статических условиях на, KN-целлюлозе и пропусканием элюата через колонку ДЭАЗ- целлюлозы и КМI целлюлозы.

Предлагаемый пособ заключается в

Ит следующем, Клетки пекарских дрожжей разрушаюп этнлацетатом и центрифугнруют при

5000 об/мин в течение 10 мин. Разру.шенные клетки промывают дистиллирован

35 ной водой два раза и повторно центрифу-Ф гируют.

Из разрушенных и промытых клеток экстрагируют цитохром С раствором сахароэы (0,25 М). Причем осуществляют

20 этот процесс в присутствии сульфата аммония до 10%-ного насыщения. Значение рН раствора с помощью 5%ного раство ра аммиака устанавливают 7,0-7,5. За,тем раствор оставляют в покое при 5о

25,10 С в -:ечение 2,5-3,0 часов. После

Г«» 1 1 ."1" 4 ел.= 1 ««Нд« д ) 4. Fi ="»

-аказ . 0 ч аж З

О У, СДПИС КОЕ ,;;,,,—,-„,.у, „„,„е„,.«.)-, .«О: „;„, «-;, -,« е а Министров 1;"ССР."->, "-, =:,, н ;к,; - «.".. -".,-,"-5 Р л*-шскаг«и «6., д. 4» 5

--":,.пиал i Г!Д "« а "ент ", г. Ужгород ул. Гагарина 101 этого его центрифугируют прк 13000 об/мин В течение 10 мин прк 1-4 С.

Полученную чадссадсчнуm красноватого цвета проверяют спектроФстсметпкчески. Прк наличии максиму мсв спектропсгпсшения прк алинах Волн

316,412,548 и 548 нм продолжают процесс.

Жидкость ставят на дкалкз в цеппсфа2 0 объемов 2 м!Л раствора сдноэгмешенного фссфата калия< содержашего 0;.5 M сахарсзы B течение

16 час, а затем пр)qvc(>eT через колоБку KN-целлюлозы, Обработанной 2 мМ раствором фосфата калия =. статических условиях«(e B - езерВ««арах 1 л дсорбк, ВаКНЫй цКТОХООМ C Ha KM--ДЕЛЛЮЛОЗЕ ПЕ рекосят на стеклянную Воронку и промывают 10 мМ раствором сднсзамешенного фссфата калия (C применением Вакуума).

Элюцкзс проводят буферным раствором дв замешенксго фосфата чатскя piI 8,,5—

9,0. Элюат пропускают «ере кспсчг» й»Л = nenes«io n) û i 96pe60TBBH",À v i e n. «6,"i

Вбпке буфером.

Раствор дкализуют В целлофановых ме-.

inKAx п««стив, ) 0 066емсв« " май ")аствсра

Однозяь ешенкс о »о»сфа" а "-«алк B прксут= ствкк 0,25 liI сахассзь.. В "i«e еккб 8 каср затем:.-,роматсгра4.круют на ксло;.ке -.! == целгпжсзы, пром61ваю1 и э:.înpóio".".

Раствор цктохрсма c TBBBT на дкализ против дистиллированной Всдэ В течение

10 нас, после чего Высушивают лкофкпькс о при= 75Г

9 ыход фермента при пересчете на высушенные дрожжи — 0,04% при содержа@ нкк чистого цитохрома С "0-55%, (1итохрсм С, полученный по данному способу, проверен в экспериментальных и клинических условиях и дал положительные результаты при лечении патологических состояний, связанных с гипоксией и аноксией (различные нарушения кровс..бращения, кислородное голодание срга нкзма, отравления,, мышечные и нервные заболевания, травмы мозга, ожоги).

11 p c д м е т и з G б p e т е и к R

Способ получения цитохрома С путем уО экстракцик разрушенных этилацета гом дрОжжевых клеток В присутствии сульфата аммония., освобождения экстракта от Взвешенных частиц, дичлиза, ПОследуюшей очистки с использованием ДЭАЗ-цеплюлозь- к КМ-целлюлозы, о т л и ч а ю щ ий с ч тем, -To, с целью повышения выхода к левсгс продукта, экстракцию осушествпяют раствором сахарозы, а очистку проводят nocëeäoBBTåúíoé сорбцией цепс

Вогс продукта B статических условиях ка

Е"ТД ж -целлюлозе и пропусканием элюата чер з колонку ДЗР.Э-цел.полозы и КМЦЕПЛЮЛОЗ6;.