Способ получения эритроцитарного диагностикума

 

Сееа Советских

Социалистических республик

Оп ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ ВТИЛЬСТВХ (и) 571266 (Н) Дополиительное к авт. свид-ву(22) Заявлеио25.06.75 (21)2153528/13 с присоединением заявки ¹â€” (23) Приоритет— (4S) Опубликоваио05.09.77Бвллетеиь №ээ (61) M. Кл.

А 61 К 35/18

Гвеудврстненнмй квинтет йвватв Мнннетрвв СИР нв делам нэвбрвтеннй н вткритнй (53) САДК 615.373 (088.8) (45) Дата опубликования описания 03.10.77 (72) Авторы изобретения

Ю. А. Черняев и Т. В. Бондаренко (71) Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский яшурный институт (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОРЭ

ДИАГНОСТИКУМА

Изобретение относится к лабораторной диагностике вирусных болезней и может! быть использовано при получении стабиль« ных эритроцитарных диагностикумов.

Известен способ получения эритроцитар- а ного диагностикума для проведения реакции пассивной гемагглютинации при идентификации и определении титра яшурных антигенов, включаюший формалиниэацяю и танизацию эритроцитов, сенсибилизацию их антисы )О

BDpoTKBMH в присутствии связующего агента 11)

Однако такой способ не обеспечивает высокой специфичности и стабильности диагностикума. )6

С целью повышения специфичности и стабильности диагностикума предложено в качестве свяэуюшего агента испольэовать 13%-ный раствор хлористого или уксуснокиолого кадмия. 20

Для сенсибилизации эритроцитов применяют яшурные, гипериммучные сыворотки морских свинок: яшурная сыворотка Ощ е серия

31, титр в РСК 1:30; яшурная сыворотка, серия Э8, титр в РСК ¹ 1;30, яшур-25

Я йая сыворотка Сат, серия 29, титр в PCK

1: 30.

Контроль полученных эритроцитарных диаг ностикумов ставят с ящурными антигенами: ящурный антиген 019, серия 38, титр в

РСК 1:8, яшурный антиген Ай, серий 44, титр в РСК 1:8, яшурный антиген Сс серия 47, титр в РСК 1:6.

При сенсибилнзации эритроцитов к смв еи .формалинизированных таниэированных эритроцитов барана с очищенными хлороформом, гипериммуниыми сыворотками морс ких свинок добавляют 2%-ный раствор хлористого хрома. Эритроциты сенсибилиэируют антисыворотками О ЕН, Аа и ССт . Контроль каждой серии полученных сенсибилизированных эритроцитов ставят с ящурными антигенами 0 9„, А а и Снт. При постановке контроля полученных эритроцитарных диагностикумов в день сенсибилиэации отмечают перекрестные реакции части диагностикумов с аитигенами других типов вируса.

Окончательный контроль полученных эритроцнтарных диагностикумов ставят через

3 дня после их получения.

571266

Диагностикум, полученный с использова- кием в качестве связующего хлористого хрома, дает перекрестные реакции с антигенами других типов, а диагностикумы, полученные с использованием в качестве связующе- ь го солей кадмия: .хлористого кадмия и уксуснокислого кадмия, являются строго типоспецифичными.

П р.и м е р 1. У здорового барана, берут(10 кровь во флаконы, наполовину наполненные раствором Альсевера, мл: глюкоза 10,25, лимониокислый натрий 4Я, лимонная кислота 0,275, хлористый натрий 2,1, бидистил, лированная вода до 500. Флаконы выдержи- 15 о вают при 4 С в течение 24 ч.

К 100 мл смеси крови барана с раствором Альсевера быстро добавляют 40 мл

50%-ного раствора формалина (с содержанием 37% формальдегида) в физиологическом О растворе. Смесь выдерживают в водяной о бане 1,5 ч при 37 С, помешивая через каж» дые 15 мин. Полученные формалинизированные эритроциты четырежды отмывают в

100 мл физиологического раствора,, выдержи 25 о вают 2 суток при 4 С, надосадочную жидкость сливают, а из осадка эритроцитов готовят 100%-ную суспензию на 0,15 М фосфатно-буферном растворе (рН 7,2) с добавлением 0,3% фенола.

Формалинизированные эритроциты могут о сохраняться при 4 С до одного года. Затем формалинизированные эритроциты однократно отмывают и готовят 3%-ную суспензию на физиологическом растворе. Полученную суспензию смешивают с равным количеством раствора танина в физиологическом растворе (1:30000). Смесь выдерживают в водяной бане 15 мин, и эритроциты двукрат-. но отмывают физиологическим раствором. 40

Эритроциты хранят в виде 3%-ной суспензии в 0,3%-ном растворе фенола на фосфатно-буферном растворе. После этого производят сенсибилиэацию эритроцитов ящурНыми антисыворотками. Для этого смешива- 4

У Ъ ют равные количества 3%-ной суспенэии отмытых от консерванта танизированных эрия роцитов и обработанйой хлороформом ящурИой антисыворотки нужного штамма в раэЙэдении 1:20. Антисыворотка должна иметь Мантр"в РСК 1:30 или выше.

К смеси добавляют 2%-ный раствор хлорчстого кадмия CdC5>, 1:5. Смесь выдерживают при комнатной температуре

ЗО мин и эритроциты дважды отмывают

0,15 М фосфатно-буферным раствором (рН 7,2). Из полученного осадка эритроюатов готовят 3%-ную суспензию на фосфат

No-буферном растворе с добавлением 1% г N

4 нормальной сыворотки крови лошади и

0,3% фенола.

Реакцию ставят в микропанелях микротитратора Токачи с луночками, имеющими коническое дно. Исследуемые антигены разводят последовательно в объеме 0,05 мл и добавiIBIoT полученный эритроцитарный диагности» кум в дозе 0,025 мп. Реакцию читают через 1,5 ч инкубации панелей при комнатной температуре по форме осадка эритроцитов. Оценку проводят в крестах в зависимости от степени агглютинации эритроцитов.

Пример 2. Формалиниэацию и танизацию эритроцитов осуществляют так, как указано в примере 1.

К 3% суспенэии танизированных эритроцитов добавляют 1%-ный раствор уксуснокислого кадмия . Cd (СН СОО)й, 1 ч раствора на 2,5 ч. суспензии. Смесь выдерживают при комнатной температуре 10 мин, К смеси добавляют обработанную .хлороформом антисыворотку в количестве, равном количеству взятой. суспензии эритроцитов, Смесь выдерживают при комнатной температуре 20 мин. Затем эритроциты дважды отмывают 0,15 М и фосфатно-буферным раствором (рН 7,2). Иэ полученного осадка эритроцитов готовят 3%-ную суспензию на фосфатно-буферном растворе с добавлением 1% нормальной сыворотки крови лошади и 0,3% фенола.

Эритроцйтарные диагностикумы, полученные предлагаемым способом, отличаются высокой специфичностью и стабильностью и могут быть успешно использованы для пое-, тановки реакции пассивной гемагглютинации при идентификации и для определения титра ящурных антигенов.

Формула изобретения

Способ получения эритроцитарного диагФ ностикума путем обработки эритроцитов формалином и танмином с последующей сенсибилиэацией их антисыворотками в присутствии связующего агента, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения специфичности и стабильности диагностикума, в качестве связующего агента используют

1-3/-ный раствор .хлористого или уксуснокислого кадмия.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе.

1. Методические указания по выделению и идентификации lIITBMMDB вируса ящура. ,М., Колос, 1974.