Способ получения лизосомального полиферментного препарата для лечения инфицированнных очагов

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) 3а явлено 11.09.75 (21) 2 166051/13

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 57703 5 (51) М. Кл.

А 61 К 37/48 с присоединением за>вки №

Гасударственный намнтет

6аввтв Министров СССР ао делам иэаоретений и открытий (23) Приоритет (43) Опубликовано25.10.77>Бюллетень ¹ 39 (45) Дата опубликования описания 04.11.77 (53) УДК 615.779. .94 (088.8) А. A. Покровский, В. А. Тутельян и Л. В. Кравченко (72) Авторы изобретения

Институт питания Академии медицинских наук СССР (7l) Заявитель. (54} СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИЗОСО!ЧА>!!ОГО IIOJ)11<1>I=PNL>!П !!. >ГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ 1»IIIIILII»IPOHА1-!Н1>1Х

ОЧАГОВ

Изобретение относится к медицине, а именно к способу получения новых лечебных средств, предназначенных для энзимагической обработки инфицированных очагов в целях расплавления некротизированных структур различных тканей и их очищения.

Известен способ получения ферментного препарата, пригодного для леч»11ия !!1!<1>иц!1рованных очагов, заключающийся в том, что 1О из биологического материала (.шгамм микроорганизмов) выделяют и подвергают 01истке комплекс протеолитических ферментов lj .

Однако препарат, полученный известным способом, недостаточно эффективен, так как 1в вследствие ограниченной субстрагной специфичности приводит лишь к частичной деградации белков. В то же время другие макромолекулярные соединения, входящие в состав некротизированной ткани (полисаха- 20 риды, мукополисахариды, липиды, гликопротеиды и др.),. остаются неразрушенными.

Кроме этого, ферменты, из которых сосго— ит препарат, инактивируют и переваривают друг друга. 25

Целью нзобр» гения явч>|»г<-.я при;,!.. !!»!!!!1 способа выделения лнзосои для получ<>llllH полиф»рменгного препарата, сосгоннн>гo !!з природного комплекса Г1!дрс»11! !111»ск!!х ф»рментов с различной субсграгной сл цнфнч <ОСГЬ!О, 3г0 досгнгаегся 1!р!!1!»!!<>!!!1»к! Оно;об!l

ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИЗОСОМ, ВК>1Ю 1ДЮ!!!ЕГО ГОЛ ОГ >! I>l

3 оцню 6110;>ОГH I>11!>. i!!, с > бкл»10 ных стру»к l ól» 1»н >!<к!< III« li о Iilcт—

K) <1>Рг>кипи д,<У!>I .!11<.><. 0»1 I!Ilr

li0! 0 по. !>!<<> PI» iI!>) > < l:! д!I и . >< "1< Iин и11!1>1!ц11РОва11H!»1x ОчаГОв, В качестве и .точилка !нзосон> !!с!ю. различные св»желолуче<<ные гк:>ни;.!!i<>ко;>ив тающих — c»llbcKoêoçÿi1c гв»н н IY (крупного

РОГаГОГО СКОГа, СВИ1!»Й> OB»LI> ЛО!ПаДЕЙ) !1 лабораторных жнвогн<ых (кро<п!ков, к!ыс) j некоторых видов птиц (кур, уток, гусей); рьlб> 6»CII03BOIIO !II3OC> < <1Lк>!!г . 1<»кОгОрые т кани >1едОвек 1 !:1 »I<>, ский и аугопсий>!ый 1,<ат»р!1.!л). :.!<Особ 1!Олуче! лизос01 алиного д<>!! l .— фе. Р1 !» I1 1 1 ОГО ГIР»п !»!»ага д-.lH 1»ч »1< IIЯ и Iф;, ц1!

5 77035 рованных очагов поясняегся следуюшим примером.

Пример. 1 кг свежеполучецной пе1 чени крупного рогатого скота промывают в охлажденном физиологическом растворе, измельчают путем продавливания через перфорированную пластину из нержавеющей стали (пресс с диаметром отверстий около 1 мм) и гомогенизируют в цилиндрическом. гладкос- . тен«м стеклянном гомогенизагоре с фторопластовым пестиком (зазор 0,21 — 0,23 мм) при 150о об/мин в течение 120 сек. B качестве суспендируюшей среды используют изотонический 0,25 М раствор сахарозы с

0,001 М ЭДТА (pH 7,4). Разведение ткани 1:9.

Гомогенаг фильтруют через нейлоновый фильтр и оставшиеся на фильтре неразрушенные компоненты ткани регомогенизируют в том же объеме среды. Осаждение субклеточ»lI,lx структур осуществляют с помощью диффере»циаль»ого ценгрифугирования, используя для этого угловые роторы большого объема или роторы непрерывного действия.

Объединенный фильтрат центрифугируют при

3500 g в течение 10 мин. Осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость вновь ценгрифугируют в течение 30 мин при 10000 для выделения лизосом. Полученный осадок (лизосомы) ресуспендируют в 9 л среды и повторно ценгрифугируют при этих же условиях. Дополнительное обогащение фракции лизосом и ее очистку осуществляют с помощью ценгрифугирования суспензии лизосом в градиенте плотности среды (сахарозы, 35 фиколла) в роторах с поднимающимися пробирками или роторах зонального типа. Для очистки лизосом от низкомолекулярных со» единений плотный осадок осторожно заливают охлажденным физиологическим раствором 4р и промывную жидкость быстро удаляют. Эту

»роцедуру повторяют, используя в качестве

»ромывной жидкости бидистиллированную воду. Дополнительную очистку осушествляюг путем диализа ресуслендированного осадка 45 против воды. Для получения лизосом с различной степенью повреждения мембран полученный осадок тщательно ресуспендируюг в

1 л физиологического раствора, после чего подвергают поэтапному замораживанию (при

-20 С) и оттаиванию (при +20 С). В зависимости ог количества повгорейий этой обработки достигается различная степень повреждения ("Раскрытия" ) лизосомальных мембран. Для получения лизосом с полносгью5 разрушенной мембраной полученный осадок ресуспендируют в 1 л бидистиллированной ,воды и замораживают при -20@С. Процедуру замораживания и оттаивания повторяют не менее 8-10 раз, после чего суспензию 60

4 сразу же подвергают лиофилизации. Для получения высокорастворимой разновидности лизосомального полиферменгного препарата суспензию лизосом с полностью разрушенной мембраной предварительно центрифугируют при 100000 р в течение 30 мин для осаждения мембран и лиофилизации подвергают надосадочкую жидкость, содержащую растворимые ферменты матрикса лизосом.

Для увеличения выхода препарата осадок, со— держаший лизосомальные мембраны, вновь ресуспендируют в бидистиллированноя воде и лиофилизируюг. Высокорастворимую разновидность лизосомального полиферменгного препарата перед лиофилизацией подвергают стерилизации путем фильтрации через ульграмикролорисгые мембранные фильтры, Для получения разновидностей лизосомального полиферментного препарата в сус»»е» зию или раствор перед лиофилизацией добавляют расчегное количество необходимого дополнительного химиотерапевтического средства (антибиотики, сульфаниламидные препараты и др.). Полученный после лиофилизации порошок расфасовывают в стерильные стек»»я»»ные флаконы и закупоривают. Выход llpellaрата составляет около 20 r (в расчете»а сухой вес); высокорастворимой разнов»»дности препарата — около 3 r.

Хранить полученный лизосомальный»олиферменгный препарат и его разновидности необходимо в лиофилизированном сосгоянии в герметических стеклянных флаконах при температуре — 4 — -8 С. При хранении о о в этих условиях активность препарата практически не изменяется в течение 8-10 л»есяцев.

С целью увеличения содержания лизосом в исходном материале вызывают индукцию их образова»»»я и биосинтеза лизосомаль»ых ферментов путем предварительного воздействия на животнъ»с с помощью различных элементарных факторов (голода»ие, содержание на малобелковом рационе и др.).

Лизосомальный полиферменгный и репарат мо»кет быть использован в клинике- д»я эпзиматической обработки инфицирован»ых очагов в целях расплавления некротизированных струкгур различных тканей и их очише»ия.

Полиферменгный препараг и е» о р-»з»»ов»»дности могут быть»риме»е»ы»ри лечении гнойных ран н ожогов, хронических незажи— ваюших язв, при лечении гравмагичес ких и лослеоперацио»ных ге»»атом, осгг.о»»ие,»»»тов, абсцессов; г»р»» пневмококковых и туберкулез»ых менингитах (»угем внугр»».»юл»бmlьного введения высокоpQcгворимой разно—

BIIllHocTH препарата); Ilpll раз»» I»I»lx заб щс ваниях дыхательных путей-бронхитах, бро»хоэкгазах, абсцессах легких, груд»оразре577(1:(5 (О (оставитель С. Малютина

Техреп М. 11упа Корректор A. Власенко

Редактор М. Рогова

Заказ 3403/10 Тираж 677 Подписное

ЦНИИПИ Государственный комитет Совет» Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 1/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Про<.ктная, 1 шающихся пневмониях и ателектазах, хронической бронхиальной астме и эмфиземе; в стоматологии — при лечении гангрен корня зуба, при воспалении десневь(х карманов, парадонтозах; в офтальмологии — при лечении коньюнктивитов; в отоларингологиипри лечении воспалительных заболеваний носоглотки и среднего уха; в дерматологии, гинекрлогии и других областях медицины.

Преимуществом лизосомального полиферментного препарата является то, что в состав его входят все ферменты, нео(ходимые для полной деградации любого из известных биополимеров, причем эти ферменты устойчивы по отношению друг к другу.

Формула изоб ре гения

Применение способа выделения лизосом, включающего гомогенизацию биологнческог о материала, осаждение субклеточных структур, выделение и очистку фракции лизосом для получения лизосомального полнфермонтного препарата для лечения ипфицпрованных очагов, Источцики информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент СШЛ И 3409719, кл. 42415 9- 1, 1 960 °